[0001] 本发明涉及婴儿的营养组合物领域，其目的是预防以后的生活中的代谢紊乱。

[0002] 母乳喂养是喂养婴儿的优选方法。已经提出，在生命早期的母乳喂养可能会影响以后的生活中疾病的发生。然而，存在使母乳喂养不可能或不太理想的情况。在那些情况下，婴儿配方物和后续配方物是良好的替代物。现代婴儿配方物或后续配方物的组成已经被高度改造以使得可以满足快速成长和发育中的婴儿的许多特殊营养需求。

[0003] 婴儿配方奶粉的成分仍可改善。与母乳喂养的婴儿相比，配方物喂养的婴儿变肥胖，在以后的生活中发生代谢性健康疾病，发生肝脏重量增加或非酒精性脂肪肝疾病(NFALD)，或在以后的生活中发展为心血管疾病的风险增加。生命早期的喂养对成年期这些疾病风险具有持久的编程作用。这些病症是西方世界的主要健康问题，并且是全球范围内主要的可预防的死亡原因，成年人和儿童的患病率日益上升，当局将其视为21世纪最严重的公共卫生问题之一。约12％至25％的美国人患有NAFLD，而且2％至5％的美国人受NASH影响。据估计，非酒精性脂肪肝疾病谱群(spectrum)疾病在全世界范围影响约10亿人。

[0004] WO 2006/091103描述了一种组合物，其包含双歧杆菌(Bifidobacterium)和两种不可消化的低聚糖以刺激人乳喂养的婴儿的肠道菌群。

[0005] WO 2013/036102描述了具有特定脂肪组分的组合物，该组分对身体具有编程作用，并且当食用西式饮食时，使得以后的生活中总血胆固醇水平降低，从而降低了西式生活方式疾病的风险。

[0006] US 9,386,793涉及治疗方法，其包括使用益生菌Dorea和任选的益生元来恢复健康哺乳动物的细菌肠道微生物群。

[0007] WO 2011/096808描述了一种组合物，其包含唾液酸低聚糖和活的拟杆菌属种(Bacteroides ssp.)，以降低婴儿在以后的生活中超重或肥胖的风险。

[0008] 本发明人出乎意料地发现，当使用动物模型时，在生命早期使用短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)结合不可消化的低聚糖的饮食补充剂可带来以后的生活的益处。特别是发现，当与未接受这种饮食干预且受到西式饮食挑战(challenge)的对照组相比时，在以后的生活中，暴露于热量和脂肪增加的西式饮食后，脂质代谢得到改善，从而改善了肝脏健康和血浆脂质参数。

[0009] 本发明人已经在小鼠模型中发现，可以以这样的方式对婴儿进行编程，使得他们可以更好地禁受通常与西式饮食有关的风险。当婴儿在他们的生命早期中接受了补充有短双歧杆菌与不可消化的低聚糖的饮食时，发现可以预防肝脏增重过度。在以后的生活中，肝脏中的脂肪堆积(特别是甘油三酯)减少，且酮体形成(由血浆β‑羟基丁酸的量决定)增加，这两者均表明肝脏中脂肪吸收减少和脂肪消耗增加。基因表达研究表明，与对照组相比，在生命早期接受了短双歧杆菌和不可消化的低聚糖的组中，脂质代谢和胆固醇生物合成途径发生了改变，与未暴露于西式饮食的健康参考组更具有可比性。出乎意料的是，在仅接受不可消化的低聚糖而未接受短双歧杆菌的组中未观察到上述作用或作用程度小得多。

[0010] 因此，在婴儿期一起使用短双歧杆菌与不可消化的低聚糖，特别适合于在以后的生活中改善脂质代谢并预防与脂质代谢相关的病症，特别是脂肪肝疾病和/或高胆固醇血症和/或血浆胆固醇相关的动脉粥样硬化。

[0011] 因此，本发明涉及一种用于预防和/或降低人类受试者在以后的生活中发生与受损的脂质代谢相关的病症的风险的方法，所述病症选自脂肪肝疾病、高胆固醇血症和血浆胆固醇相关的动脉粥样硬化，所述方法通过在生命早期给予包含短双歧杆菌和不可消化的低聚糖的组合的营养组合物来实现。优选地，本发明涉及一种用于预防和/或降低人类受试者在以后的生活中发生与受损的脂质代谢相关的病症的风险的方法，所述病症选自高胆固醇血症和血浆胆固醇相关的动脉粥样硬化，所述方法通过在生命早期给予包含短双歧杆菌和不可消化的低聚糖的组合的营养组合物来实现。具体地，本发明涉及一种用于预防和/或降低人类受试者在以后的生活中发生高胆固醇血症和/或血浆胆固醇相关的动脉粥样硬化的风险的方法，其通过在生命早期给予包含短双歧杆菌和不可消化的低聚糖的组合的营养组合物来实现。

[0012] 在一个实施方案中，本发明的方法是一种用于预防和/或降低人类受试者在以后的生活中发生与受损的脂质代谢相关的病症的风险的非医学方法，所述病症选自脂肪肝疾病、高胆固醇血症和血浆胆固醇相关的动脉粥样硬化，所述方法通过在生命早期给予包含短双歧杆菌和不可消化的低聚糖的组合的营养组合物来实现。优选地，本发明涉及一种用于预防和/或降低人类受试者在以后的生活中发生与受损的脂质代谢相关的病症的风险的非医学方法，所述病症选自高胆固醇血症和血浆胆固醇相关的动脉粥样硬化，所述方法通过在生命早期给予包含短双歧杆菌和不可消化的低聚糖的组合的营养组合物来实现。具体地，本发明涉及一种用于预防和/或降低人类受试者在以后的生活中发生高胆固醇血症和/或血浆胆固醇相关的动脉粥样硬化的风险的非医学方法，其通过在生命早期给予包含短双歧杆菌和不可消化的低聚糖的组合的营养组合物来实现。

[0013] 本发明也可以表述为短双歧杆菌和不可消化的低聚糖的组合用于制备营养组合物的用途，所述营养组合物用于预防和/或降低人类受试者在以后的生活中发生与受损的脂质代谢相关的病症(选自脂肪肝疾病、高胆固醇血症和血浆胆固醇相关的动脉粥样硬化)的风险，其通过在生命早期向人类受试者给予营养组合物来实现。优选地，本发明涉及短双歧杆菌和不可消化的低聚糖的组合用于制备营养组合物的用途，所述营养组合物用于预防和/或降低人类受试者在以后的生活中发生与受损的脂质代谢相关的病症(所述疾病选自高胆固醇血症和血浆胆固醇相关的动脉粥样硬化)的风险，其通过在生命早期向人类受试者给予营养组合物来实现。具体地，本发明涉及短双歧杆菌和不可消化的低聚糖的组合用于制备营养组合物的用途，所述营养组合物用于预防和/或降低人类受试者在以后的生活中发生高胆固醇血症和/或血浆胆固醇相关的动脉粥样硬化的风险，其通过在生命早期向人类受试者给予营养组合物来实现。

[0014] 本发明也可以表述为一种包含短双歧杆菌和不可消化的低聚糖的组合的营养组合物，所述营养组合物用于预防和/或降低人类受试者在以后的生活中发生与受损的脂质代谢相关的病症(选自脂肪肝疾病、高胆固醇血症和血浆胆固醇相关的动脉粥样硬化)的风险，其通过在生命早期向人类受试者给予营养组合物来实现。优选地，本发明涉及一种包含短双歧杆菌和不可消化的低聚糖的组合的营养组合物，所述营养组合物用于预防和/或降低人类受试者在以后的生活中发生与受损的脂质代谢相关的病症(所述疾病选自高胆固醇血症和血浆胆固醇相关的动脉粥样硬化)的风险，其通过在生命早期向人类受试者给予营养组合物来实现。本发明特别涉及一种包含短双歧杆菌和不可消化的低聚糖的组合的营养组合物，所述营养组合物用于预防和/或降低人类受试者在以后的生活中发生高胆固醇血症和/或血浆胆固醇相关的动脉粥样硬化的风险，其通过在生命早期向人类受试者给予营养组合物来实现。

[0015] 在一个实施方案中，本发明的方法或用途用于预防和/或降低在以后的生活中发生脂肪肝疾病的风险。在一个实施方案中，本发明的方法或用途用于预防和/或降低在以后的生活中发生非酒精性脂肪肝的风险。

[0016] 在一个实施方案中，本发明的方法或用途用于预防和/或降低在以后的生活中发生高胆固醇血症和/或血浆胆固醇相关的动脉粥样硬化的风险。

[0017] 短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)

[0018] 本发明的方法或用途中的营养组合物(在下文中也称为本发明的(营养)组合物)包含短双歧杆菌。发现短双歧杆菌与不可消化的低聚糖一起存在可有益地影响以后的生活中的脂质代谢和肝脏健康。短双歧杆菌为革兰氏阳性、厌氧、分支的杆状细菌。短双歧杆菌优选地与短双歧杆菌ATCC15700模式株的16S rRNA序列具有至少95％的同一性，更优选至少97％的同一性(Stackebrandt&Goebel,1994,Int.J.Syst.Bacteriol.44:846‑849)。优选的短双歧杆菌菌株是从健康人乳喂养的婴儿的粪便中分离得到的那些菌株。通常，这些菌株是可从乳酸菌生产商处市售获得的，但是它们也可以直接从粪便中分离、鉴定、表征和生产。根据优选的实施方案，本发明的组合物包含至少一种选自短双歧杆菌Bb‑03(Rhodia/Danisco)、短双歧杆菌M‑16V(Morinaga)、短双歧杆菌R0070(Institute Rosell,Lallemand)、短双歧杆菌BR03(Probiotical)、短双歧杆菌BR92(Cell Biotech)、DSM 20091、LMG 11613、YIT4065、FERM BP‑6223和CNCM I‑2219的短双歧杆菌。最优选地，短双歧杆菌选自短双歧杆菌M‑16V和短双歧杆菌CNCM I‑2219，最优选地短双歧杆菌为M‑16V。短双歧杆菌I‑2219被a.o.发表于WO 2004/093899和US 7,410,653，并由Compagnie Gervais Danone于1999年5月31日保藏在法国巴黎巴斯德研究所国家微生物保藏中心(Collection Nationale de Cultures de Microorganisms,Institute Pasteur,Paris,France)。短双歧杆菌M‑16V保藏为BCCM/LMG23729，并可从Morinaga Milk Industry Co.,Ltd.市售获得。

[0019] 本发明的组合物优选地包含活的短双歧杆菌。本发明的组合物优选地包含104至12
10 菌落形成单位(cfu)短双歧杆菌/克本发明的营养组合物的干重，优选地每克本发明的
4 11 5 10 6 9
组合物的干重包含10至10 ，更优选10至10 ，最优选10至1x 10cfu短双歧杆菌。优选地，
4 13 6 11
所述组合物包含10至10 cfu短双歧杆菌/100ml，更优选每100ml包含10至10 cfu短双歧
7 10
杆菌，最优选每100ml包含10至10 cfu短双歧杆菌。在本发明的上下文中，应理解，营养组合物优选地不包含其他益生菌，因此在本发明的方法或用途中优选地从营养组合物中排除短双歧杆菌以外的益生菌。

[0020] 不可消化的低聚糖

[0021] 本发明的方法或用途中的营养组合物包含不可消化的低聚糖(NDO)。本发明中使用的术语“低聚糖”优选地是指聚合度(DP)为2至250的糖，优选地DP为2至100，更优选地为2至60。应理解，在本发明的上下文中，DP在一定范围内的糖可以包括具有不同平均DP的糖的混合物，例如，如果本发明的组合物中包含DP为2至100的低聚糖，这可包括包含平均DP为2至5、平均DP为50至70、以及平均DP为7至60的低聚糖的组合物。本发明中使用的术语“不可消化的低聚糖”是指通过在人的上消化道(小肠和胃)中存在的酸或消化酶的作用，在肠道中不能被消化或仅能部分被消化，但会被人肠道菌群发酵的低聚糖。例如，蔗糖、乳糖、麦芽糖和麦芽糊精被认为是可消化的。例如，低聚半乳糖、低聚果糖被认为是不可消化的低聚糖。

[0022] 优选地，不可消化的低聚糖为可溶的。当涉及低聚糖时，本文所用的术语“可溶的”是指根据L.Prosky et al.,J.Assoc.Off.Anal.Chem.71,1017‑1023(1988)所述的方法，该低聚糖是可溶的。

[0023] 不可消化的低聚糖优选地选自低聚果糖、低聚半乳糖、低聚葡萄糖、低聚阿拉伯糖、低聚甘露糖、低聚木糖、低聚岩藻糖、低聚阿拉伯半乳糖、低聚葡萄甘露糖、低聚半乳甘露糖，包含唾液酸的低聚糖和糖醛酸低聚糖。

[0024] 优选地，本发明的组合物包含低聚果糖和/或低聚半乳糖，更优选低聚半乳糖，最优选反式低聚半乳糖。在优选的实施方案中，所述组合物包含低聚半乳糖和低聚果糖的混合物。优选地，本发明的组合物包含DP为2至10的低聚半乳糖，优选地平均DP为2至10，和/或DP为2至60的低聚果糖，优选地平均DP为2至60，优选地平均DP为10至60，优选地平均DP为15至60，优选地平均DP为20至60。在这些优选的实施方案中，不可消化的低聚糖的存在将对以后的生活中的脂质代谢和肝脏健康具有改善作用。

[0025] 低聚半乳糖优选地选自反式低聚半乳糖。在特别优选的实施方案中，本发明的方法包括给予反式低聚半乳糖([半乳糖]n‑葡萄糖；其中n是1至60的整数，即2、3、4、5、6、……、59、60；优选地n选自2、3、4、5、6、7、8、9或10)。反式低聚半乳糖(TOS)例如以商标TM
Vivinal (Borculo Domo Ingredients,荷兰)出售。反式低聚半乳糖的糖优选地是β‑连接的。

[0026] 在一个实施方案中，本发明的方法或用途中的营养组合物优选地包含低聚果糖。如本文所用的术语“低聚果糖”是指包含至少2个β‑连接的果糖单元的链的不可消化的多糖，其DP为2至250，优选7至100，更优选20至60。在一个实施方案中，优选地使用菊粉(inulin)。菊粉可例如以商品名 (Orafti)获得。本发明的低聚果糖的平
均DP优选地至少为7，更优选地至少为10，优选地低于100。所使用的低聚果糖优选地具有通过β(2→1)键连接的(大多数)果糖单元。低聚果糖的其他术语包括菊粉、果糖多糖(fructopolysaccharide)、多聚果糖(polyfructose)、果聚糖(fructans)和低聚果糖(oligofructose)。本发明的组合物优选地包含DP为2至200的低聚果糖。

[0027] 在优选的实施方案中，本发明的组合物包含两种或更多种不可消化的碳水化合物，其差异在于单糖单元组成，或聚合度(DP)或两者。两种不可消化的碳水化合物的单糖组成有所不同，当基于单糖单元的总数计时，在单糖组成上存在至少30数量％的差异，更优选地至少50数量％的差异。例如，平均组成为Glu‑Gal3的低聚半乳糖和平均组成为Glu‑Fru3的低聚果糖相差75数量％。如果两种碳水化合物的平均DP相差大于5个单糖单元，优选地大于10个单元，甚至更优选地大于15个单元，则两种不可消化的碳水化合物的DP有所不同。例如，平均DP为4的水解菊粉和平均DP为25的长链菊粉的DP相差21个单元。

[0028] 优选地，本发明的组合物包含平均DP为2至10的低聚半乳糖和平均DP为10至60的低聚果糖。优选地，本发明的组合物包含平均DP为2至10的低聚果糖和平均DP为15至60的低聚果糖。优选地，本发明的组合物包含平均DP为2至10的低聚半乳糖和平均DP为2至10的低聚果糖。在这些优选的实施方案中，不可消化的低聚糖的存在将对以后的生活中的脂质代谢和肝脏健康具有改善作用。

[0029] 优选地，本发明的组合物包含重量比为20至0.5，更优选为20至1，最优选为12至2的低聚半乳糖和低聚果糖。

[0030] 优选地，本发明的组合物包含80mg至2g不可消化的低聚糖/100ml，更优选地每100ml包含150mg至1.50g，甚至更优选300mg至1g。基于干重计，组合物优选地包含0.25重量％至20重量％，更优选0.5重量％至10重量％，甚至更优选1.5重量％至7.5重量％的不可消化的低聚糖。

[0031] 优选地，本发明的组合物包含104至1012cfu短双歧杆菌/克干重和基于干重计0.255 10
重量％至20重量％不可消化的低聚糖，更优选地包含10至10 cfu短双歧杆菌/克干重和基于干重计0.5重量％至10重量％不可消化的低聚糖。优选地，本发明的组合物不包含除短双歧杆菌外的益生菌。

[0032] 优选地，本发明的组合物包含104至1013cfu短双歧杆菌和80mg至2g不可消化的低6 11
聚糖/100ml，更优选地每100ml包含10 至10 cfu短双歧杆菌和300mg至1g不可消化的低聚糖。优选地，本发明的组合物不包含除短双歧杆菌外的益生菌。

[0033] 优选地，本发明的营养组合物包含：i)1x 105cfu至1x 1010cfu短双歧杆菌/克干6 10
重，更优选1x 10cfu至1x 10 cfu；以及ii)基于干重计0.5至20重量％的低聚半乳糖，更优选0.5至10重量％的低聚半乳糖，或iii)基于干重计0.05至2重量％的低聚果糖，更优选0.1至1重量％的低聚果糖，或ii)和iii)两者。优选地，本发明的营养组合物不包含除短双歧杆菌外的益生菌。

[0034] 营养组合物

[0035] 本发明的方法或用途中的营养组合物优选地特别适合于给年龄小于36个月的人类受试者，特别是年龄小于24个月的人类受试者，甚至更优选年龄小于18个月的人类受试者，最优选年龄小于12个月的婴儿提供每日营养需求。因此，所述营养组合物用于喂养或被使用用于喂养人类受试者。本发明的组合物优选地包含脂质、蛋白质和可消化的碳水化合物组分，其中脂质组分优选提供总热量的30至60％，蛋白质组分优选地提供总热量的5至20重量％，更优选5至15重量％，且可消化的碳水化合物组分优选地提供总热量的25％至75％。优选地，本发明的组合物包含提供总热量的35％至50％的脂质组分，提供总热量的
6％至12％的蛋白质组分和提供总热量的40％至60％的可消化的碳水化合物组分。总热量的量是由蛋白质、脂质和可消化的碳水化合物的热量总和来决定。

[0036] 本发明的组合物不是人乳。本发明的组合物优选地包含植物脂质。根据婴儿配方物的国际导则，本发明的组合物优选地包含其他级分，诸如维生素和矿物质。优选地，所述营养组合物是婴儿配方物、后续配方物或幼儿配方物，更优选婴儿配方物或后续配方物。

[0037] 优选地，所述营养组合物不包含乳酸杆菌(Lactobacilli)。在生命早期已接受短双歧杆菌和不可消化的低聚糖，且在以后的生活中具有改善的脂质代谢和肝脏健康的组中发现乳酸杆菌有所减少。

[0038] 在一个实施方案中，本发明的组合物是适于在用水性溶液(优选地用水)复原(reconstitution)后制备液体组合物的粉末。优选地，本发明的组合物为待用水复原的粉末。

[0039] 为了满足婴儿的热量需求，所述组合物优选地包含50至200kcal/100ml液体，更优选60至90kcal/100ml液体，甚至更优选60至75kcal/100ml液体。这种热量密度确保水和热量消耗之间的最佳比例。本发明的组合物的克分子渗透压浓度优选地为150至420mOsmol/l，更优选260至320mOsmol/l。低的克分子渗透压浓度旨在减少胃肠道压力。压力会诱导脂肪细胞形成。

[0040] 优选地，本发明的组合物为液体形式，在布氏粘度计(Brookfield viscometer)中‑1于20℃下以100s 的剪切速率测得，该组合物的粘度低于35mPa.s，更优选低于6mPa.s。合适地，所述组合物为粉末形式，其可以用水复原以形成液体，或为液体浓缩物形式(其应当用水稀释)。当所述组合物为液体形式时，每天给予的优选体积为约80至2500ml，更优选地每天约450至1000ml。

[0041] 用途

[0042] 利用动物模型，发现当在生命早期给予时，双歧杆菌和不可消化的低聚糖的组合(而不是仅不可消化的低聚糖而没有双歧杆菌)，与未接受这种饮食干预并接受西式饮食挑战的对照组相比，有益地影响了指示在以后的生活中改善的脂质代谢和肝脏健康的参数。

[0043] 本发明涉及一种包含短双歧杆菌和不可消化的低聚糖的营养组合物，其用于通过在生命早期向人类受试者给予营养组合物来改善人类受试者在以后的生活中的脂质代谢和肝脏健康。

[0044] 当小鼠成年时及在小鼠接受西式饮食后，观察到对预防在以后的生活中的肝脏过重具有显著作用。同样，观察到肝脏甘油三酯显著减少和肝脏胆固醇减少。这是在出生后第98天观察到的，其是一个对应于人类成年期的时间点。这表明早期营养对肝脏增重具有有益作用，实际给药期后预防肝脏重量过重并预防不想要的肝脏病症。此外，出乎意料地发现，受试者表现出脂肪积累减少，酮体形成增加，这是通过对血浆β‑羟基丁酸酯和GIP水平的作用来指示。禁食或运动后酮体形成的增加表明碳水化合物氧化向脂肪氧化的改善的快速新陈代谢转换。在增加的或高的饮食脂肪的情况下，生酮作用可以有助于去除大量进入肝脏的脂肪，并且该途径的功能障碍会促使NAFLD的发生。生酮作用在预防饮食引起的NAFLD方面可能起到重要作用。暴露于西式饮食且在生命早期未接受过合生素(synbiotic)组合物的对照组倾向于NAFDL表型，其由对脂质稳态的不利作用所指示，并由对葡萄糖稳态的作用进一步支持。此外，低度慢性炎症是NAFLD向更高风险肝硬化状态发展的基础。此外，基因表达研究显示，与在生命早期未接受过合生素的暴露于西式饮食的对照组相比，合生素组中的脂质途径与健康参照组相比更具有可比性。代谢稳态的失调，例如胰岛素敏感性或脂质代谢的改变，可能与脂肪肝疾病(FLD)的发生相关。因此，在生命早期给予合生素的组中，NAFDL表型和脂肪肝疾病及其进展得到预防。

[0045] 脂肪肝疾病包括酒精性脂肪肝疾病和非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。优选地，本发明的合生素组合物在生命早期给予，用于预防或降低在以后的生活中发生NAFLD的风险。NAFLD涵盖了一个谱群的疾病活动。该谱群开始于肝脏中的脂肪积累(肝脏脂肪变性)。肝脏可以保留脂肪，而不会干扰肝脏功能，但也可能发展变为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)(脂肪变性结合炎症和纤维化(脂肪性肝炎)的状态。NASH是一种进行性疾病：超过10年的时间，最多达20％的NASH患者将发生肝硬化，且最多达10％的患者将发生与肝脏疾病相关的死亡。

[0046] 在一个实施方案中，本发明涉及一种包含短双歧杆菌和不可消化的低聚糖的营养组合物，该营养组合物用于预防和/或降低人类受试者在以后的生活中发生肝脏重量增加和/或脂肪肝疾病的风险，其通过向生命早期的人类受试者给予所述营养组合物来实现，更优选地用于预防和/或降低发生NAFLD的风险。

[0047] 在生命早期已接受合生素的组中，在以后的生活中观察到血浆胆固醇显著降低。此外，基因表达研究显示，与在生命早期未接受过合生素的暴露于西式饮食的对照组相比，合生素组中的胆固醇生物合成、储存、转运分布和细胞稳态与健康参照组相比更具有可比性。胆固醇的血浆水平降低表明预防或降低了发生高胆固醇血症和/或动脉粥样硬化的风险。在一个实施方案中，本发明涉及一种包含短双歧杆菌和不可消化的低聚糖的营养组合物，该营养组合物用于降低人类受试者在以后的生活中的血浆胆固醇水平，和/或用于预防和/或降低人类受试者在以后的生活中发生高胆固醇血症和/或血浆胆固醇相关的动脉粥样硬化的风险，其通过向生命早期的人类受试者给予所述营养组合物来实现。

[0048] 本发明的组合物将给予在生命早期的人类受试者。生命早期优选地是指人类受试者的年龄小于36个月时，优选人类受试者的年龄小于24个月时，甚至更优选人类受试者的年龄小于18个月时，更优选人类受试者为年龄小于12个月的婴儿时，最优选人类受试者为小于6个月的婴儿时。在一个实施方案中，将本发明的组合物给予在生命早期的健康的人类受试者，优选地给予足月出生的人类受试者。

[0049] 根据本发明，以后的生活优选地意指当人类受试者为儿童或优选地为成年人时。优选地，以后的生活是指人类受试者的年龄大于5岁时，且更优选大于18岁时。在以后的生活中预防或在以后的生活中降低发生的风险不同于直接的预防作用(在食用营养干预时产生的作用)，在于在停止食用营养组合物后，它可以很好地在生活中进一步延长其健康作用，例如，在停止给予配方物后至少2年，更优选至少4年，更优选至少15年。据信这种在以后的生活中的作用是由于编程作用，其中在生命早期，当人类受试者仍在生长和发育时，器官和它的代谢能力(诸如脂肪细胞形成、胰腺B细胞团形成、肝脏发育)在生命早期的关键窗口被编程，并且在此时期发生的作用在以后的生活中具有健康作用。实际上，在出生后第42天的微生物群转移对代谢健康没有作用，表明小鼠的关键窗口已经过去。

[0050] 在优选的实施方案中，将包含短双歧杆菌和不可消化的低聚糖的营养组合物用于暴露于或成长于致肥胖环境中和/或在婴儿期后食用西式饮食的人类受试者。西式饮食脂肪增加且饱和脂肪酸增加，其中脂肪提供饮食总热量的超过35％，以及饱和脂肪酸提供饮食总热量的超过10％。术语致肥胖环境是指促进体重增加的环境，以及不利于在家庭或工作场所减少体重的环境(Swinburn et al.,1999,Prev Med 29:563‑570)。换言之，致肥胖环境是指促进、诱导、帮助或有助于肥胖的环境。贡献因素是城市化，通常伴随体力活动的减少以及食物的容易获取。在一个实施方案中，所述营养组合物对暴露于其中日常饮食是西式饮食的环境的婴儿特别有益，所述西式饮食为脂肪增加或高脂肪，且饱和脂肪酸增加或高饱和脂肪酸，其中脂肪提供饮食总热量的超过35％，以及饱和脂肪酸提供饮食总热量的超过10％，更特别地，西式饮食特征在于包含提供饮食总热量的35％至45％的脂肪并包含提供饮食总热量的10％至20％的饱和脂肪酸。

[0051] 在优选的实施方案中，在以后的生活中，人类受试者处于发生与受损的脂质代谢或受损的肝脏健康有关的疾病的风险。因此，人类受试者优选地选自早产儿、小于胎龄儿、大于胎龄儿、出生于超重或肥胖母亲的婴儿、出生于患有2型糖尿病或妊娠糖尿病的母亲的婴儿、剖腹产婴儿以及正在接受或已接受抗生素治疗的婴儿。

[0052] 在本文件及其权利要求中，动词“包含”及其变化形式以其非限制性意义使用以表示包括该词之后的项目，但不排除未特别提及的项目。另外，通过不定冠词“一(a)”或“一个(an)”提及一个元素不排除存在一个以上所述元素的可能性，除非上下文明确要求有且仅有一个所述元素。因此，不定冠词“一”或“一个”通常意指“至少一个”。附图说明

[0053] 图1显示生命早期营养干预后在成年期的脂质代谢和肝脏参数的血浆标志物。数据是平均值±SEM。*p≤0.05，**p≤0.01。脂质稳态的全身性标志物：β‑羟基丁酸酯，bHB(A)，总胆固醇，TC(B)，甘油三酯，TG(C)。肝标志物：肝脏重量(D)，肝脏TC(E)和肝脏TG(F)。

[0054] SYN：在生命早期接受短双歧杆菌和不可消化的低聚糖，然后在第42‑98天接受西式饮食的组。G/F：在生命早期接受不可消化的低聚糖，然后在第42‑98天接受西式饮食的组。CTR：在生命早期未接受短双歧杆菌且未接受不可消化的低聚糖，然后在第42‑98天接受西式饮食的组。REF：没有生命早期营养干预或在以后的生活中没有西式饮食挑战，以标准食物饲养的对照组。

[0055] 图2显示生命早期营养干预后在成年期的葡萄糖稳态的血浆标志物。数据是平均值±SEM。*p≤0.05，**p≤0.01。葡萄糖稳态的全身性标志物：稳态模型评估胰岛素抵抗、HOMA‑IR(A)、葡萄糖(B)、胰岛素(C)、胰淀素(D)、抑胃肽、GIP(E)和胰多肽，PP(F)。

[0056] SYN：在生命早期接受短双歧杆菌和不可消化的低聚糖，然后在第42‑98天接受西式饮食的组。G/F：在生命早期接受不可消化的低聚糖，然后在第42‑98天接受西式饮食的组。CTR：在生命早期未接受短双歧杆菌且未接受不可消化的低聚糖，然后在第42‑98天接受西式饮食的组。REF：没有生命早期营养干预或在以后的生活中没有西式饮食挑战，以标准食物饲养的对照组。

[0057] 实施例1：指示脂质稳态和肝脏健康的以后的生活中的血浆和肝脏特征受到生命早期的合生素干预的有益影响

[0058] 材料与方法

[0059] 在受控的标准饲养条件下，将小鼠饲养在Macronon 2型笼子中，随意进食和饮水。雌性和雄性C57BL/6J小鼠获自荷兰的Harlan Laboratories B.V.，并定时交配。在出生后(PN)第2天，挑选几窝动物，每只母鼠(dam)随机分配4只雄性和2只雌性幼崽。在适应、妊娠和哺乳期间，根据美国营养学会(American Institute of Nutrition)的配方(AIN‑93G；
16.4kcal％的脂肪，18.8kcal％的蛋白质；RDS，荷兰)，给动物饲喂适合用于饲养的辐照过的标准半合成饮食。在PN2，给泌乳母鼠分配不同的干预饮食，即AIN‑93G饮食的不同补充，使用不可消化的低聚糖[G/F：2％w/w scGOS(短链低聚半乳糖( GOS)):lcFOS(长
9
链低聚果糖(Inulin ))重量比9:1]、合生素[SYN：(2％w/w G/F+10cfu/g短双歧杆菌M‑16V(Morinaga Milk Industries Ltd.)]或载体(vehicle)对照(CTRL：2％w/w麦芽糊精)。除饮食的补充之外，幼崽还每天(PN10‑15)接受口服剂量(30μl)，形式为各个补充物的
9
滴剂(G/F和约10‑15mg/天的麦芽糊精、1x 10cfu短双歧杆菌M‑16V)。断奶后(PN21)，成对饲养雄性后代，并继续饲喂各个补充的干预饮食直到PN42，这一时期与人类的婴儿期和幼儿期相对应。在PN42后直至PN98，在青春期和成年期，给CTRL、G/F和SYN动物喂食西式饮食(WSD；AIN‑93G饮食，其脂质级分调整为含有20重量％脂质(17重量％猪油(lard)、3重量％豆油、0.1重量％胆固醇)，代表轻度的西式饮食，其脂肪提供总热量的约40％并且含有基于总热量计14.5％的饱和脂肪酸)作为挑战。与被认为是健康的饮食相比，这种饮食基于总能量计的脂肪水平增加，且饱和脂肪酸的百分比增加。

[0060] 从PN21开始，在连续的时间间隔，通过称重所提供食物和剩余食物之间的差来确定食物摄食量。

[0061] 在PN98，禁食6小时后，通过异氟醚/O2麻醉将动物安乐死，然后进行颈椎脱位。将血液样本收集在涂覆有K3EDTA的微管(Greiner Bio‑one,Germany)中。通过离心(1350g、10min、4℃)从血液样本中获得血浆，然后在液氮中速冻并储存在‑80℃下。在解剖期间收集肝脏、称重、在液氮中速冻并保存在‑80℃下直至进一步分析。

[0062] 在PN98血浆样品中，禁食血浆总胆固醇(血浆TC；cholesterol liquicolor CHOD‑PAP,Instruchemie,Delfzijl，荷兰)、甘油三酯(血浆TG；GPO trinder method,Sigma Aldrich,Zwijndrecht，荷兰)、β‑羟基丁酸酯(血浆bHB；β‑Hydroxybutyrate LiquiColor,Stanbio Laboratory,Boerne,TX,USA)和葡萄糖(GOD‑PAP method,Roche diagnostics,Almere，荷兰)是通过使用微孔板成像系统(Bio‑Rad Laboratories Inc.,Hercules,CA,USA)进行比色法测量。禁食血浆胰岛素、胰淀素、葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)和瘦素(leptin)是使用多路方法(MILLIPLEX MAP Mouse Metabolic Hormone Magnetic Bead Panel,Merck KGaA,Darmstadt,Germany)同时进行测量。根据制造商的方案制备样品、对照品和标准品，并使用Bio‑PlexTM 200Luminex仪器(Bio‑Rad Laboratories Inc.,Hercules,CA,USA)对荧光进行定量。作为胰岛素敏感性的间接量度，将胰岛素抗性的稳态模型评估(HOMA‑IR；

[0063] [glu(mmol/l)*ins(pmol/l)/22.5])用于禁食的血糖和胰岛素。在来自PN98的肝脏组织中，蛋白质(BCAtm Protein Assay Kit,Thermo scientific,Breda，荷兰)、甘油三酯(Triglycerides liquicolor mono kit,Human Diagnostics,Wiesbaden,Gemany)和胆固醇(Cholesterol liquicolor mono kit,Human Diagnostics,Wiesbaden,Germany)含量是使用微孔板成像系统(Bio‑Rad Laboratories Inc.,Hercules,CA,USA)进行比色法评估。

[0064] 对来自十二指肠、空肠、回肠、结肠、肝脏和WAT的总RNA进行分离、纯化并立即保存于‑80℃下。为此，根据制造商的说明使用DNA酶处理的TRIzol/氯仿(Invitrogen,Breda，荷兰)和RNAeasy迷你试剂盒(Qiagen,Venlo，荷兰)。对RNA进行定量(NanoDrop ND‑1000UV‑vis spectrophotometer,Isogen,Maarsen，荷兰)，并根据Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies,Amsterdam，荷兰)，使用真核生物总RNA Nano测定法，用6000Nano试剂盒验证其完整性。如果样品显示18S和28S核糖体RNA亚基的完整条带，未显示染色体峰或RNA降解产物，且RNA完整性值(RIN)大于8.0，则认为它们适合与微阵列杂交。

[0065] 使用Ambion全转录(WT)表达试剂盒(Life Technologies,Carlsbad,USA)和Affymetrix GeneChip WT终端标签试剂盒(Affymetrix,Santa Clara,USA)，由每个样品的100ng纯化的RNA制备标记的cDNA。根据制造商的方案，将一个组织的所有样品与相同的Affymetrix GeneChip Mouse Gene 1.1ST阵列杂交。集成于一个在线管道中，使用Bioconductor软件包进行质量控制和标准化步骤{Lin,2011#287}。应用来自Bioconductor库AffyPLM(默认设置)的鲁棒多阵列(robust multiarray)(RMA)分析算法，计算探针组的标准化表达估计值{Irizarry,2003#275}。根据Dai et al.{Dai,2005#263}，重新定义探针组，并且分配给Entrez基因数据库的唯一基因标识符(ID)，从而产生了21,187个分配的Entrez ID。

[0066] 为了减少变量的数量，仅选择在至少5个阵列上的强度值>20且四分位间距>0.1的基因用于进一步分析，从而得到肝脏的14,230个基因，WAT的15,574个基因，结肠的14,377个基因，十二指肠、空肠和回肠的15,467个基因。使用基于强度的中度t统计法(intensity based‑moderated t‑statistics)(IBMT)进行经验贝叶斯校正{Sartor,2006#313}，从四个组的平均信号强度计算信号2log比率和各自的倍数变化(1的2log比率等于倍数变化为2)，以及相关的变化显著性。将所得倍数变化和相应的p值用于描述性生物信息学分析和数据可视化。

[0067] 为了将基因表达数据与生物学功能和经典途径(canonical pathway)相关联，应用Ingenuity Pathway Analysis(IPA,IngenuityH Systems,www.ingenuity.com)，使用p＝0.05作为基因过滤器，进行全面的途径和网络分析。

[0068] REF组代表未接受饮食干预(生命早期阶段)且未接受WSD挑战饮食(在以后的生活中)的对照组。在统计分析中，比较三个受WSD挑战的组(CTRL、G/F、SYN)。

[0069] 使用IBM SPSS Statistics 19.0(SPSS Benelux,Gorinchem,荷兰)和GraphPad Prism 6(GraphPad Software,La Jolla,CA,USA)进行统计分析。

[0070] 使用单样品考‑斯二氏检验(One‑Sample Kolmogorov‑Smirnov Test)对所有变量进行正态分布检验。如果呈正态分布，则通过单因素方差分析(ANOVA)在CTRL vs.G/F vs.SYN中分析变量。在显著性作用方面，使用Tukey多重比较检验进行事后分析，以在各个组之间进行比较。在非高斯分布的情况下，在单因素方差分析前进行对数转换。p≤0.05时，认为差异是显著性的。除非另外表明，否则数据表示为平均值±SEM。

[0071] 结果

[0072] 与对照饮食(REF和CTRL组)相比，采用G/F或SYN进行的生命早期营养干预不会影响干预期间及干预之后直至PN42的发育生长。在这个时间点，实验组之间的体重、脂肪量和瘦体重没有差异。相对于体重的脂肪量(脂肪量％)在所有组中也是相似的。从PN42到PN98，CTRL、G/F和SYN组在WSD挑战下，所有组中的动物体长和瘦体重均保持相似，表明正常的生长轨迹。

[0073] 无论是在生命早期(PN21‑42)还是在以后的生活期间(PN42‑93)，均未检测到可以解释观察到的表型的组间的食物摄食差异。

[0074] 全身和肝脏脂质代谢的标志物的结果如图1所示。SYN组的血浆β‑羟基丁酸(bHB)显著升高(图1A)。bHB是禁食或运动期间的能量来源，也是脂质稳态中的信号分子，并且表明酮的形成。这也表明通过β‑氧化(例如在肝脏中)脂肪酸的消耗增加。这表明在禁食时转向脂肪氧化的改善的代谢转换。与CTRL相比时，SYN组的血浆胆固醇也显著降低(p＝0.007)，而G/F组中的作用中等(图1B)。对血浆TG无显著作用(图1C)。

[0075] 代谢稳态的失调(诸如脂质代谢中的改变)与脂肪肝疾病(FLD)(肝脏中异位脂肪堆积的可逆病症)的发生相关。因此，测量了相关的肝脏参数。与CTRL和G/F动物相比，解剖的SYN动物的平均肝脏重量显著降低(图1D)。肝脏总胆固醇相对于肝脏蛋白的差异呈趋势性降低(p＝0.08)，并遵循阶梯状视觉模式(stair‑like visual pattern)(图1E)。SYN的肝脏甘油三酯含量显著低于CTRL和G/F中的含量(图1F)。

[0076] 图2示出了葡萄糖代谢的作用，因为这可能会影响脂质代谢和肝脏健康。HOMA‑IR计算是基于禁食血糖和胰岛素水平，其中前者(毫不奇怪地)在所有组中均相似，而后者则有显著差异(p＝0.039)，而CTRL、G/F和SYN显示阶梯下降模式。SYN中的HOMA‑IR低于CTRL，因此表明该生物体的胰岛素反应更敏感。尽管所有组中的禁食血糖水平(图2B)相似，HOMA‑IR(图2A)(胰岛素敏感性的指标)以及与葡萄糖稳态相关的各种信号分子(包括胰岛素(图2C)、胰淀素(图2D)、GIP(图2E)和PP(图2F))显示在PN98时WSD挑战后SYN中的血浆水平提高(趋势性)，而SYN中的血浆胰岛素显著低于CTRL。血浆GIP(一种也已知会影响葡萄糖摄取和脂质合成的有效的肠降血糖素)在除了SYN的所有组都同样高，SYN组其显著低于G/F组(p＝
0.014)。

[0077] 对脂质稳态的作用表明，CTRL组倾向于NAFDL表型，且对葡萄糖稳态的作用进一步支持了这一点。此外，低度慢性炎症是NAFLD向高风险肝硬化状态发展的基础。因此，在SYN中NAFDL表型和脂肪肝疾病得以预防/挽救。

[0078] 为了确定生命早期合生素补充的有益作用的内在分子机制，本发明人对六个相关组织：十二指肠、空肠、回肠和结肠、肝脏和白色脂肪组织进行了微阵列分析。对于SYN vs.CTRL，在回肠(n＝1592)，然后是空肠(n＝1307)和十二指肠(n＝1227)中，本发明人观察到了最强的作用，该作用是由显著差异(p<0.05)表达的基因数量确定的。肝脏中有1191个基因被显著调节，而WAT和结肠中，分别仅有315和285个基因的表达是显著不同的。在所有被分析的组织中，在SYN vs.CTRL的比较中，绝对倍数变化高于1.2的相似基因数量均存在上调或下调，占小肠和结肠中被调节基因的大部分。然而，在肝脏和WAT中，大多数基因的表达以低于1.2的绝对倍数变化被调节，这表明与CTRL相比，合生素补充在肝脏和WAT中诱导的调节更弱。

[0079] 回肠、空肠和十二指肠中差异表达基因的对比揭示，仅有84个基因是组织之间共有的，这84个基因占每段中差异表达基因的不足10％。这表明与CTRL相比时，生命早期的合生素补充在肠段中诱导长期的组织特异性的转录反应。值得注意的是，在小肠的所有区段中所有重叠的基因均沿相同方向改变基因表达，其中69个基因上调而其余下调。使用GO描述对所述84个基因进行的注释识别出17个和12个分别在代谢和免疫功能中标明的基因。

[0080] 为了鉴别出所述基因的差异调节所特异性靶向的生物学功能和经典途径，本发明人使用了Ingenuity Pathway Analysis(IPA)。在IPA中，调节的显著性是基于受调节基因相对于对功能有贡献的基因总数的数量和改变。在回肠中，生物学功能和经典途径受到强调节，其前5位的‑log(p值)分别在14.25‑11.98和12.80‑5.27之间。在肝脏中，生物学功能和途径的调节的最大‑log(p值)为7.49和3.04。在回肠中，受到最强调节的生物学功能是“脂质代谢”，受到最强调节的经典途径是“胆固醇生物合成”。聚焦于胆固醇代谢时，发现与生物合成(甲羟戊酸途径，类固醇生物合成)、胆固醇摄食进细胞和稳态调节相关的基因集(gene set)在生命早期补充SYN的小鼠中被上调，而与胆固醇储存、排泄和分布相关的基因集却被下调，这可能表明细胞的胆固醇需求更高。这些调节与REF组在很大程度上是一致的。然而，在G/F组中，这些作用不存在或存在程度较小，并且该结果与CTRL组更具有可比性。

[0081] 实施例2：单独的微生物群调节不会导致针对代谢健康的长期作用

[0082] 将高压灭菌的标准饲料饲养的无菌C57/B16雄性小鼠用于移植。在第5周，使所有小鼠适应无菌WSD 1周。使来自用饲料喂养(CTRL)和补充有合生素(SYN)的小鼠的盲肠的冷冻内容物(喂养实验中PN42时收集)在补充有还原溶液(溶于NaHCO3缓冲液中的0.02M Na2S和1％半胱氨酸)的PBS缓冲液中均质化。从每组中选择两个不同供体。适应一周后，将小鼠(6周龄，PN42，每组4‑5只小鼠)禁食4h，并用上述所得的浆液(200μl)强饲。将移植的小鼠饲养在带有无菌垫的高压灭菌的单个通风笼中，并随意饲喂无菌的WSD和高压灭菌的水14周。在PN 42、43、70和98测量体重并进行全身磁共振成像(MRI)。

[0083] 在转移时(PN42)，受体GF小鼠之间的体重、脂肪量和瘦体重没有差异。在微生物群转移后，本发明人观察到对于饮食*时间相互作用而言，CTRL和SYN组之间的体重、脂肪量和瘦体重没有显著差异。因此，在合生素补充之后改变的微生物群不足以将补充有合生素的小鼠的有益表型转移给受体。这表明，可以认为通过在生命早期肠道中存在的不可消化的低聚糖和短双歧杆菌进行的生命早期微生物群调节的实际过程是诱导长期代谢健康作用所必需的。