一种微流控芯片 |
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| 申请号 | CN202320299591.1 | 申请日 | 2023-02-23 | 公开(公告)号 | CN220116558U | 公开(公告)日 | 2023-12-01 |
| 申请人 | 广州市第一人民医院(广州消化疾病中心、广州医科大学附属市一人民医院、华南理工大学附属第二医院); | 发明人 | 林冬果; 尹建华; 陈振华; 刘大渔; | ||||
| 摘要 | 本实用新型公开了一种微流控芯片，涉及类器官芯片技术领域。包括依次封接组装的：连接层，底部设有连接通道，连接通道两侧设有第一入口和第一出口，第一入口和第一出口 自下而上 直通连接层的上方；培养层，位于连接层的下方，对应连接通道下方设有至少一微坑阵列，所述微坑阵列包括若干具有相同几何参数的微坑。该芯片在筛选实验时只需要通过第一入口或第一出口上进行输注灌流，细胞悬液即可进入连接通道进行扩散，进而使细胞附着在微坑上，形成细胞培养和实验的微环境，至少可用于 病毒感染 模型的构建。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种微流控芯片，其特征在于，包括依次封接组装的： |
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| 说明书全文 | 一种微流控芯片技术领域[0001] 本实用新型涉及类器官芯片技术领域，特别是，一种微流控芯片。 背景技术[0002] 既往研究发现，流感病毒感染引起的免疫反应诱导大量细胞因子和趋化因子的产生，最终导致呼吸道和肺部损伤。很多研究也表明，中草药的有效成分可以从抗病毒和抗炎在体内外起作用。然而，传统实验耗时长、花费大以及追踪分析难等问题限制了其在抗病毒药物筛选中的应用。因此，目前抗病毒药物研发亟需仿真病毒感染肺器官的药物筛选平台。 [0003] 近十年来，器官芯片技术为研究不同器官的功能和机制提供了体外模型，也被广泛应用于药物或治疗方案筛选，现有的芯片方法在构建病毒感染的肺类器官模型上还存在一些不足之处：结构设计复杂、细胞分析的通量低和细胞难以回收或回收的数量少，亟需一种结构简单分析通量的类器官芯片结构用于研究上述的实验。实用新型内容 [0004] 本实用新型涉及类器官芯片技术领域，特别是，一种微流控芯片，用于解决现有类器官芯片结构复杂、并行分析困难且难以回收细胞的问题。 [0005] 本实用新型提供如下解决方案：一种微流控芯片，包括依次封接组装的： [0006] 连接层，底部设有连接通道，连接通道两侧设有第一入口和第一出口，第一入口和第一出口自下而上直通连接层的上方； [0007] 培养层，位于连接层的下方，对应连接通道下方设有至少一微坑阵列，所述微坑阵列包括若干具有相同几何参数的微坑，第一入口或第一出口包括微细开口，用于克服液体在第一入口或第一出口的重力回流。 [0008] 本实用新型中，通过两层结构的封装即可实现类器官芯片的构建，可以根据封装工艺特异性设计流程，以简化实验操作并方便后续的细胞回收操作，同时，芯片中还设计了微坑阵列，用于捕获细胞悬浮液中单细胞，微坑结构的数量可以根据实际需要进行设计，扩大了细胞分析的数量级；同时，所述微坑在制作时，是可以直接在培养层上进行，简化了微坑的制作工艺；微坑结构与连接通道的封装环境中，在筛选实验时只需要通过第一入口或第一出口上进行输注灌流，细胞悬液即可进入连接通道进行扩散，进而使细胞附着在微坑上，形成细胞培养和实验的微环境，可用于病毒感染模型的构建。 [0009] 优选的，所述连接通道为矩形凹槽，所述微坑阵列为矩形阵列，所述矩形凹槽与所述矩形阵列对应设置。 [0010] 优选的，连接通道包括位于中部的矩形凹槽和位于矩形凹槽两侧的三角凹槽，两个三角凹槽相对的一边分别与矩形凹槽的两个短边连接，三角凹槽尖部的一端为延伸端，所述延伸端与第一入口或第一出口连接。 [0011] 优选的，所述培养层设有若干微坑阵列，所述连接层对应设有若干连接通道，设有一分散层，所述分散层位于所述连接层之上，所述分散层靠近第一入口的一侧设有分散通道，且所述分散通道底部与第一入口连通，所述分散通道设有位于分散层顶部的第二入口。 [0012] 优选的，分散层设有第二出口，第二出口与第一出口连通设置。 [0013] 优选的，第二出口与第一出口同轴心设置。 [0014] 优选的，第二出口的直径为第一出口的2～5倍。 [0015] 优选的，所述微坑阵列的数量为10‑15万个。 [0016] 优选的，所述分散层的高度为400‑600μm，所述培养层的高度为100‑200μm，所述培养层的高度为100‑200μm。 [0017] 采用本实用新型的技术方案，具有如下有益效果： [0018] 1)本实用新型的微流控芯片是至少两层封装组合的复合结构，芯片内部的封装环境中，包括了连接通道和在连接通道下方的微坑阵列，在对第一入口或第一出口的灌流中，首先在连接通道上进行溶液的扩散，随后在微坑阵列对悬浮的细胞进行捕获培养，捕获的细胞在后续的培养中即变成类器官，通过与相应的病毒进行共孵既可以获取病毒感染模型； [0019] 2)本实用新型还包括了在连接层上的分散层，实现多个并行的连接通道和微坑阵列的芯片结构，若干连接通道和微坑阵列的芯片中，在同样进行细胞培养和建立病毒感染模型的情况下，本实用新型设计的多个微坑阵列中，可以同时进行多种或空白化合物或药物的筛选实验，简化实验操作。附图说明 [0020] 图1为本实用新型的实施例一的微流控芯片的结构图； [0021] 图2为本实用新型的实施例一的微流控芯片的分层爆炸图； [0022] 图3为本实用新型的实施例一的微流控芯片的俯视图； [0023] 图4为本实用新型的实施例一的微流控芯片的侧视剖面图； [0024] 图5为本实用新型的实施例二的微流控芯片的结构图； [0025] 图6为本实用新型的实施例二的微流控芯片的分层爆炸图； [0026] 图7为本实用新型的实施例二的微流控芯片的俯视图； [0027] 图8为本实用新型的实施例二的微流控芯片的侧视剖面图； 具体实施方式[0028] 下面将结合本实用新型实施例中的附图，对本实用新型实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本实用新型一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本实用新型中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本实用新型保护的范围。 [0029] 在本实用新型的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”、“左”、“右”“内”、“外”“前端”、“后端”、“两端”、“一端”、“另一端”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本实用新型和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本实用新型的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。 [0030] 在本实用新型的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“设置有”、“连接”等，应做广义理解，例如“连接”，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体式连接；可以是机械连接，也可以是电连接；机械连接可以是焊接、铆接、螺纹连接或法兰连接等；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本实用新型中的具体含义。 [0031] 实施例一： [0032] 下面结合附图对本实用新型进行具体描述，一种微流控芯片，包括依次封接组装的： [0033] 连接层，底部设有连接通道2，连接通道2两侧设有第一入口1和第一出口4，第一入口1和第一出口4自下而上直通连接层的上方； [0034] 培养层，位于连接层的下方，对应连接通道2下方设有至少一微坑阵列3，所述微坑阵列3包括若干具有相同几何参数的微坑，第一入口或第一出口包括微细开口，用于克服液体在第一入口或第一出口的重力回流。 [0035] 本实用新型中，通过两层结构的封装即可实现类器官芯片的构建，可以根据封装工艺特异性设计流程，以简化实验操作并方便后续的细胞回收操作，同时，芯片中还设计了微坑阵列3，用于捕获细胞悬浮液中单细胞，微坑结构的数量可以根据实际需要进行设计，扩大了细胞分析的数量级；同时，所述微坑在制作时，是可以直接在培养层上进行，简化了微坑的制作工艺；微坑结构与连接通道2的封装环境中，在筛选实验时只需要通过第一入口1或第一出口4上进行输注灌流，细胞悬液即可进入连接通道2进行扩散，进而使细胞附着在微坑上，形成细胞培养和实验的微环境，至少可用于病毒感染模型的构建。 [0036] 优选的，所述连接通道2为矩形凹槽，所述微坑阵列3为矩形阵列，所述矩形凹槽与所述矩形阵列对应设置。 [0037] 优选的，连接通道2包括位于中部的矩形凹槽和位于矩形凹槽两侧的三角凹槽，两个三角凹槽相对的一边分别与矩形凹槽的两个短边连接，三角凹槽尖部的一端为延伸端，所述延伸端与第一入口1或第一出口4连接。 [0038] 具体的，如图1‑4所示，所示的芯片主要用于构建流感病毒感染的肺类器官阵列芯片，包括自下而上的培养层和连接层，两层PDMS层的微结构，培养层包括矩形排列的底层微坑阵列3，对应与微坑阵列3的上方，连接层对应设置有连接通道2以及第一入口1和第一出口4，连接通道2包括位于两侧的三角扩散区和位于中部的矩形联通区，两个三角扩散区的尖部用于连接第一入口1或第一出口4，另一侧分别连接矩形联通区的两端，两个三角扩散区上设有菱形的扩散方区； [0039] 第一入口1和第一出口4的底部还设有底部通道； [0040] 所述的两层结构依次封接组装成复合结构的微流控芯片。 [0041] 实施例二： [0042] 与实施例一相比，实施例二提供了第二种芯片结构： [0043] 优选的，所述培养层设有若干微坑阵列，所述连接层对应设有若干连接通道，设有一分散层，所述分散层位于所述连接层之上，所述分散层靠近第一入口的一侧设有分散通道，且所述分散通道底部与第一入口连通，所述分散通道设有位于分散层顶部的第二入口，第一入口或第一出口包括微细开口，用于克服液体在第一入口或第一出口的重力回流。 [0044] 优选的，分散层设有第二出口，第二出口与第一出口连通设置。 [0045] 优选的，第二出口与第一出口同轴心设置。 [0046] 优选的，第二出口的直径为第一出口的2～5倍。 [0047] 优选的，所述微坑阵列的数量为10‑15万个。 [0048] 优选的，所述分散层的高度为400‑600μm，所述培养层的高度为100‑200μm，所述培养层的高度为100‑200μm。 [0049] 具体的，如图5‑8所示，所述芯片主要是用于流感病毒感染肺类器官阵列芯片用于抗病毒药物筛选； [0050] 芯片主要包含三层PDMS层的微结构，顶层为流体进入的分散通道6，中间层为流体的连接区域，和底层为微坑阵列9。培养层包括矩形排列的底层微坑阵列9，对应与微坑阵列9的上方，连接层对应设置有连接通道8以及第一入口7和第一出口，连接通道8包括位于两侧的三角扩散区和位于中部的矩形联通区，两个三角扩散区的尖部用于连接第一入口7或第一出口，另一侧分别连接矩形联通区的两端，两个三角扩散区上设有菱形的扩散方区；第一入口7和第一出口的底部还设有底部通道； [0051] 三层结构依次封接组装成复合结构的微流控芯片； [0052] 芯片的微通道结构包括三个不同的高度，分别对应分散通道6(h4＝500μm)、连接区域(h5＝150μm)和微坑(h6＝150μm)这种设计具有实用价值，包括： [0053] ①利用分散通道6和连接区域的高度差，使得引入的流体受限于通道高度差形成的阻力，允许流体同时到达微坑阵列9层，从而串联多个微坑阵列9单元；利用这种串联的装置可以完成高通量大规模的微坑阵列9构建； [0054] ②由于芯片同样具有亲水表面效应，引入的细胞悬液可以迅速浸润并填充微坑；具体的，芯片上设有12万个微坑。 [0055] 采用本实用新型的技术方案，具有如下有益效果： [0056] 1)本实用新型的微流控芯片是至少两层封装组合的复合结构，芯片内部的封装环境中，包括了连接通道和在连接通道下方的微坑阵列，在对第一入口或第一出口的灌流中，首先在连接通道上进行溶液的扩散，随后在微坑阵列对悬浮的细胞进行捕获培养，捕获的细胞在后续的培养中即变成类器官，通过与相应的病毒进行共孵既可以获取病毒感染模型； [0057] 2)本实用新型还包括了在连接层上的分散层，实现多个并行的连接通道和微坑阵列的芯片结构，若干连接通道和微坑阵列的芯片中，在同样进行细胞培养和建立病毒感染模型的情况下，本实用新型设计的多个微坑阵列中，可以同时进行多种或空白化合物或药物的筛选实验，简化实验操作。 [0058] 实施例三： [0059] 本实施例提供了芯片的制备方法： [0060] 基于所述的微流控芯片，本实用新型进一步提供了芯片的制造方法，包括： [0061] 使用光刻‑倒模法加工芯片，制作芯片模具； [0064] 烘烤PDMS基片，轻轻剥离芯片模具上的PDMS基片，并在通道的入口和出口处打孔； [0065] 清洗并依次封接PDMS基片，形成如所述的微流控芯片。 [0066] 具体制备方法如下： [0068] ②先使用三甲基氯硅烷熏蒸处理模具表面，使PDMS基片易于从模具上剥离。 [0069] ③将PDMS前体和引发剂按10:1充分混匀，均匀倒入模具。真空抽取处理直至PDMS胶中的气泡完全去除。将PDMS基片置于烘箱烘烤后，从硅片模具上轻轻剥离，并在通道的流体入口和出口处打孔。 [0071] 基于所述的制备方法，本实用新型还进一步提供了芯片的亲水涂层处理方法，包括： [0072] 将5.0％(v/v)的N,N‑二甲基丙烯酰胺和0.1％(v/v)的甲基丙烯酸缩水甘油脂混合在纯水中，脱气处理； [0074] 用3500分子量截断透析管进行广泛透析，收集透析后的溶液； [0075] 引入所述溶液到封接后的微流控芯片中，室温孵育； [0076] 负压抽出溶液，烘干芯片并灭菌处理获得具有亲水涂层的微流控芯片。 [0077] 具体的亲水涂层处理方法包括： [0078] 将5.0％(v/v)的N,N‑二甲基丙烯酰胺和0.1％(v/v)的甲基丙烯酸缩水甘油脂混合在纯水中，彻底脱气10min。 [0079] 为引发聚合反应，在混合物中加入0.1％(v/v)的四甲基乙二胺和0.05％(v/v)的过硫酸钾。 [0081] 芯片封接后，将亲水聚合物溶液稀释引入芯片中，室温孵育15min，负压将芯片内溶液完全抽出，将处理后的芯片放置在密闭容器中，烘干。 [0082] 实施例四： [0083] 肺类器模型感染甲型流感病毒的构建 [0084] (1)微流控芯片上的细胞分散 [0086] ②使用微量注射泵向芯片顺序灌注细胞悬液、氟化油、壳聚糖溶液、氟化油； [0087] ③完成液滴阵列构建后，芯片引入培养基进行细胞培养； [0088] 所述培养基(下称肺类器官培养基)中的肺类器官培养基组分包括：DMEM细胞培养基、1X的N21‑MAX添加剂、A83‑01、SB202190、Y‑27632、N‑乙酰半胱氨酸、Noggin、FGF‑10、FGF‑7和R‑Spondin1； [0089] 具体为Advanced DMEM/F12细胞培养基、1X的N21‑MAX添加剂、0.5μM的A83‑01、0.5μM的SB202190、5μM的Y‑27632、1.25mM的N‑乙酰半胱氨酸、100ng/mL的Noggin、100ng/mL的FGF‑10、25ng/mL的FGF‑7、0.5μg/mL的R‑Spondin1； [0090] (2)芯片上的类器官培养 [0091] 构建肺细胞阵列后，使用肺类器官培养基进行连续灌流培养，对芯片捕获的肺细胞进行连续灌流培养，在这种单细胞悬浮培养条件下，海藻酸钠‑Matrigel‑壳聚糖三组份形成了仿生培养微环境；获得肺类器官模型； [0092] (3)芯片上构建肺类器感染甲型流感病毒模型 [0093] 取肺类器官阵列芯片，弃培养液、用PBS洗2次除去残留的培养基。阵列灌入100TCID50/mL的甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)，与类器官共孵1h吸附100TCID50/mL的流感病毒。然后用PBS洗2次，加入含有1μg/mL TPCK‑胰酶的肺类器官培养基进行连续灌流培养 48h； [0094] (4)芯片上的药物筛选 [0095] 化合物的抗病毒活性检测。肺类器官阵列芯片，弃培养液、用PBS洗2次除去残留的含血清培养基。化合物溶液倍比稀释后，预先与100TCID50/mL的甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)共孵育30min； [0096] 各浓度的化合物和病毒混合溶液依次灌入阵列芯片2的各单元，共孵1h吸附100TCID50/mL的流感病毒。然后用PBS洗2次，加入含有1μg/mL TPCK‑胰酶的肺类器官培养基进行连续灌流培养48h。用死活细胞染色法进行抗病毒活性测定。用Prism5.01计算化合物的IC50，重复试验三次； [0097] (5)结果讨论 [0098] 本实施例使用实施例二所述的芯片完成抗病毒药物筛选实验。所述芯片含有6个独立的单元。独立单元内可以完成同一药物不同浓度筛选，或者是不同药物的筛选。 [0099] 芯片内对不同药物浓度的化合物库进行筛选。实验结果发现(表1)，18‑ARLPRKKWK的IC50为0.89±0.07μg/mL，而20‑ARLPRKKWK的IC50值为0.79±0.38μg/mL。未感染甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的肺模型检测药物毒性。化合物库的CC50值均大于150μg/mL。微流控芯片的抗病毒药物筛选方法可以筛选出4个化合物的安全系数大于150，这4个化合物为：18‑KKWKARLPR、20‑KKWKARLPR、18‑ARLPRKKWK和20‑ARLPRKKWK。因此，基于微流控芯片的流感感染肺模型可用于抗流感病毒药物筛选，可满足高通量的抗病毒药物筛选实验开展。 [0100] 表1基于微流控芯片的流感感染肺模型筛选抗甲型流感病毒多肽药物 [0101] [0102] 表1中所采用的多肽化合物由本专利发明人制备得到，其制备以及结构可参见发明人发表的论文，Lin,Dongguo,et al."A "building block"approach to the new influenza A virus entry inhibitors with reduced cellular toxicities." Scientific Reports6.1(2016):22790. [0103] 尽管本实用新型的描述已经相当详尽且特别对几个所述实施例进行了描述，但其并非旨在局限于任何这些细节或实施例或任何特殊实施例，而是应当将其视作是通过参考所附权利要求考虑到现有技术为这些权利要求提供广义的可能性解释，从而有效地涵盖本实用新型的预定范围。此外，上文以实用新型人可预见的实施例对本实用新型进行描述，其目的是为了提供有用的描述，而那些目前尚未预见的对本实用新型的非实质性改动仍可代表本实用新型的等效改动。 [0104] 以上所述，只是本实用新型的较佳实施例而已，本实用新型并不局限于上述实施方式，只要其以相同的手段达到本实用新型的技术效果，都应属于本实用新型的保护范围。在本实用新型的保护范围内其技术方案和/或实施方式可以有各种不同的修改和变化。 |
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