[0001] 本发明提供一种具有高乙酸耐受性的粟酒裂殖酵母，属于微生物技术领域。背景技术：

[0002] 酵母菌是一种多功能的工业微生物，在传统发酵食品和医药生产领域做出了突出贡献。同时，在生物能源产业快速发展的时代，酵母菌由于其高效的生物燃料生产能力，也是环境友好型能源生产的有利转换平台。然而，在实际工业化生产过程中，酵母菌往往受到极端温度、弱有机酸、高渗压等环境因素的胁迫。所有这些应激条件都会影响细胞的生长速率和代谢能力，从而降低生产效率。乙酸是一种典型的弱有机酸，在许多发酵过程中作为副产物积累或作为抑制剂存在。例如，白酒固态发酵是多菌种、开放式的生态酿造过程，是由包括酵母菌、细菌、霉菌等在内的300‑400种微生物共同作用的结果。其中乳酸菌能够代谢产生乙酸以及乳酸等。乳酸菌的大量繁殖则会引起乙酸、乳酸的累积，对酵母菌的生长代谢造成威胁。此外，木质纤维素生物炼制乙醇过程中，由于原料中纤维素、半纤维素和木质素之间致密的结构，不利于纤维素酶对纤维素的水解，因此，木质纤维素在酶水解前必须经过预处理以提高纤维素对纤维素酶的可及度。在预处理过程中，半纤维素乙酰基水解产生大量乙酸，其含量在1.5～10g/L，研究表明当乙酸浓度达到2g/L时便会严重影响酵母菌的生长与代谢。为减小抑制剂的影响所采取的一些脱毒策略往往造成糖的损失和生产成本的增加，影响了生产的经济性。

[0003] 选育具有强的抗逆性能，包括具有强的乙酸耐受性的酵母菌菌株对于提高传统发酵业以及现代生物能源制造业等行业的发展大有裨益且势在必行。发明内容：

[0004] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种具有高乙酸耐受能力的粟酒裂殖酵母，在乙酸含量为20g/L的培养基中可以正常发酵产乙醇，能够解决高浓度乙酸环境下酵母菌发酵受抑制的问题。

[0005] 所述粟酒裂殖酵母，具体为粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces  pombe)Sujiu.014，该菌株筛选自酱香型白酒生产酒醅，已于2021年2月1日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.21791。

[0006] 所述粟酒裂殖酵母Sujiu.014的26SrDNA具有序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

[0007] SEQ ID NO.1：

[0008] AAGCGGAGGAAAAGAAAATAACCATGATTCCCTCMRKWACGGCGAGTGAAGCGGGAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGTCAACATTTCTTTTGTTGTCCGAGTTGTAATTTCAAGAAGCTGCTTTGAGTGTAGACGATCGGTCTAAGTTCCTTGGAACAGGACGTCAGAGAGGGTGAGAACCCCGTCTTTGGTCGATTGGATATGCCATATAAAGCGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAATGGGTGGTAAATTTCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTTAAATAGTACGTGAAATTGCTGAAAGGGAAGCATTGGAAATCAGTCTTACCTGGGTGAGATCAGTAGTCTCTTCGCGAGACTATGCACTCTGAACCTGTGGTAGGTCAGCATCAGTTTTCGGGGGCGGAAAAAGAATAAGGGAAGGTGGCTTTCCGGGTTCTGCCTGGGGAGTGTTTATAGCCCTTGTTGTAATACGTCCACTGGGGACTGAGGACTGCGGCTYSGTGCCAAGGATGCTGACATAATGGTTTTCAATGGCCCGTCTTGAACCACGGACCATTG。

[0009] 所述粟酒裂殖酵母Sujiu.014具有如下理化性质：

[0010] (1)形态特征为：菌落呈半球状，边缘整齐，不透明，正反面微黄色，质地均匀易挑起；菌体呈杆状，细胞宽度(直径)约0.5～1μm，长度1～2μm；

[0011] (2)生物学特征为：能够同化利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、木糖、半乳糖、乙醇、尿素、硫酸铵，不能同化利用阿拉伯糖、柠檬酸、乳酸、硝酸钾；

[0012] (3)最高可耐受20g/L乙酸，在此浓度下培养30h，生长OD600值在0.82以上；

[0013] 最高可耐受60g/L乳酸，在此浓度下培养32h，生长OD600值在0.95以上；

[0014] 最高可耐受温度为40℃，在此温度下培养12h，生长OD600值在1.30以上；

[0015] 最高可耐受8％乙醇，在此浓度下培养34h，生长OD600值在1.50以上。

[0016] 本发明还提供粟酒裂殖酵母Sujiu.014在发酵生产乙醇或白酒中的应用。有益效果：

[0017] 本发明提供了一种具有极强乙酸耐受能力，较好的耐乳酸、耐高温、耐乙醇能力的粟酒裂殖酵母。能够耐受20g/L乙酸，为目前报道乙酸耐受能力最高的酵母菌株，同时能够耐受60g/L乳酸、40℃温度以及8％的乙醇。能够解决高浓度乙酸环境下酵母菌发酵受抑制的问题。附图说明：

[0018] 图1为本发明提供的粟酒裂殖酵母菌落形态、显微形态以及电镜图；

[0019] 其中，a‑菌落形态；b‑显微镜图；c‑扫描电镜图。

[0020] 图2是本发明提供的粟酒裂殖酵母在无胁迫以及不同浓度乙酸下的生长状况；

[0021] 其中，a‑无胁迫；b‑不同浓度乙酸胁迫

[0022] 图3是本发明提供的粟酒裂殖酵母在不同浓度乳酸下的生长状况。

[0023] 图4是本发明提供的粟酒裂殖酵母在不同温度下的生长状况。

[0024] 图5是本发明提供的粟酒裂殖酵母在不同浓度乙醇下的生长状况。

[0025] 图6是本发明提供的粟酒裂殖酵母系统进化树。

[0026] 上述附图中的SP.14即为本发明粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)Sujiu.014。具体实施方式：

[0027] 下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

[0028] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

[0029] 实施例1分子生物学鉴定

[0030] 对菌株粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)Sujiu.014进行26SrDNA鉴定。所选通用引物为：

[0031] NL1(5'‑GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG‑3')；

[0032] NL4(5'‑GGTCCGTGTTTCAAGACGG‑3')。

[0033] 扩增片段长度约为600bp。目的片段送金唯智测序，测序结果与GenBank中所登录的26S rDNA序列(KY296084.1，MT729825.1，NR_151433.1，CU329672.1等)进行比对分析，同源性达到98％，见图6。通过26S rDNA序列分析，确定该菌株为粟酒裂殖酵母。

[0034] 实施例2菌落形态、微观形态观察

[0035] (1)菌落：将纯化后的单菌落以稀释涂板的方式接种于WL培养基，30℃培养2～3天，观察并记录菌落形态。结果如图1‑a所示，菌落呈半球状，边缘整齐，不透明，正反面微黄色，质地均匀易挑起。

[0036] (2)显微镜检：美兰染色，40X油镜观察。结果如图1‑b所示，菌体呈杆状，无鞭毛。

[0037] (3)扫描电镜：

[0038] 酵母菌摇床培养16h(稳定期)，取5mL菌液加入50mL离心管，7000r/min离心2min，倒掉上清液；加入20mL 5％固定液戊二醛溶液，涡旋震荡后静置，固定2h；加入20mL PBS缓冲液，洗涤三次，每次以7000r/min离心5min；分别依次加入50％、70％、95％乙醇各洗涤一次，无水乙醇洗涤两次，7000r/min离心20min后加入叔丁醇(不可低温)洗涤三次，4000r/min离心15min。所得样品冷冻干燥后采用扫描电子显微镜观察(SU1510，捷克)。结果如图1‑c所示，菌体性状与光学显微镜下形态一致，呈短杆状。细胞宽度(直径)约0.5～1μm，长度1～2μm。

[0039] 实施例3碳氮源同化实验

[0040] (1)碳源同化试验

[0041] 同化碳源基础培养基：(NH4)2SO4 0.5％,KH2PO4 0.1％,MgSO4·7H2O 0.05％,酵母浸粉0.02％,琼脂2％,115℃灭菌15min。

[0042] 测试的碳源为柠檬酸、半乳糖、木糖、乙醇、乳酸、乙酸、阿拉伯糖，用灭菌的注射器经滤膜(0.20μm)除菌，使其含量达到50mmol/L。

[0043] 将供试菌种接入3mL无菌生理盐水，充分摇匀，吸取1mL酵母悬液于无菌培养皿中，再倾入融化并冷却至45～50℃左右的无碳源基础培养基，摇匀，待凝固后，置于30℃下倒置培养7h。取出带菌平板，在皿底上用玻璃铅笔划分成六个小区，其中一个小区作为对照，其余五个小区标记上实验用的碳源物。将少许碳源用无菌涂布棒按标记加到带菌平板上，先正放2～4h，待表面干燥，置于30℃下倒置培养48h，，观察结果。若能在某一小区内观察到菌落生长，说明该菌种能利用这种碳源。结果如表1所示，

[0044] 表1碳源同化结果

[0045]

[0046] 注：+代表能够利用；‑代表不能利用。

[0047] (2)氮源同化

[0048] 同化氮源基础培养基：葡萄糖2％,KH2PO4 0.1％,MgSO4·7H2O 0.05％,酵母浸粉0.02％,琼脂2％,115℃灭菌15min。

[0049] 测试的氮源为硝酸钾、硫酸铵、尿素，用灭菌的注射器经滤膜(0.20μm)除菌，使其含量达到50mmol/L。

[0050] 具体实验方法同实施列3碳源同化实验一致。

[0051] 表2氮源同化结果

[0052]

[0053] 注：+代表能够利用；‑代表不能利用。

[0054] 实施例4耐乙酸性能评价

[0055] YPD液态培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，115℃灭菌20min后使用。

[0056] 乙酸胁迫培养基:在YPD液体培养基添加乙酸，终浓度分别为4g/L，8g/L，12g/L，16g/L，20g/L。

[0057] 胁迫实验以Sujiu.014为研究对象，粟酒裂殖酵母商业菌株ATCC16979作为对照菌株。胁迫实验前首先考察在无胁迫处理下两菌株的生长情况，即在YPD液体培养基中生长情况。

[0058] 在固体培养基分别取一环粟酒裂殖酵母接种于装有5mLYPD液态培养基中，于30℃，180r/min摇床培养至稳定期。以10％的接种量接种至新鲜的YPD液体培养基(30℃，7
180r/min)，培养至对数中后期(活菌数约为1x10CFU/mL)再以3％的接种量转接至无胁迫培养基及乙酸胁迫培养基并使用全自动生长曲线仪(芬兰Bioscreen C)测定菌株的生长趋势(30℃，静置培养)。

[0059] 结果如图2所示，无胁迫培养时两株菌均在12h进入稳定期，生长OD600值在1.6左右，生长状态差异小。乙酸胁迫下，本发明提供的粟酒裂殖酵母在20g/L乙酸存在的YPD培养基中培养30h，生长OD值在0.82以上。对照菌株ATCC16979在4g/L乙酸处理下即停止生长。

[0060] 实施例5耐乳酸性能评价

[0061] 乳酸胁迫培养基:在YPD液体培养基添加乳酸，终浓度分别为20g/L，40g/L，60g/L，80g/L。

[0062] 以Sujiu.014为研究对象，粟酒裂殖酵母商业菌株ATCC16979作为对照菌株。在固体培养基取一环粟酒裂殖酵母接种于装有5mLYPD液态培养基中，于30℃，180r/min摇床培养至稳定期。以10％的接种量接种至新鲜的YPD液体培养基(30℃，180r/min)，培养至对数7
中后期(活菌数约为1x10CFU/mL)再以3％的接种量转接至乳酸胁迫培养基(30℃，静置培养)并使用全自动生长曲线仪(芬兰Bioscreen C)测定菌株的生长趋势。所述结果如图3所示，本发明提供的粟酒裂殖酵母在60g/L乳酸存在的YPD培养基中培养32h，生长OD600值在
0.95以上。对照菌株ATCC16979在此浓度下培养32h，生长OD600值为0.84。

[0063] 实施例4耐高温性能评价

[0064] 以Sujiu.014为研究对象，粟酒裂殖酵母商业菌株ATCC16979作为对照菌株。在固体培养基取一环粟酒裂殖酵母接种于装有5mL YPD液态培养基中，于30℃，180r/min摇床培养至稳定期。以10％的接种量接种至新鲜的YPD液体培养基(30℃，180r/min)，培养至对数7
中后期(活菌数约为1x10 CFU/mL)再以3％的接种量转接至新鲜YPD培养基于40℃静置培养，并使用全自动生长曲线仪(芬兰Bioscreen C)测定菌株的生长趋势。所述结果如图4所示，本发明提供的粟酒裂殖酵母在高温40℃长势良好，在此温度下培养12h，生长OD600值在
1.30以上。对照菌株ATCC16979在此温度下不能生长。

[0065] 实施例5耐乙醇性能评价

[0066] 乙醇胁迫培养基:在YPD液体培养基添加乙醇，终浓度为8％，以不添加乙醇的YPD液体培养基作为对照培养基。

[0067] 以Sujiu.014为研究对象，粟酒裂殖酵母商业菌株ATCC16979作为对照菌株。在固体培养基取一环粟酒裂殖酵母接种于装有5mLYPD液态培养基中，于30℃，180r/min摇床培养至稳定期。以10％的接种量接种至新鲜的YPD液体培养基(30℃，180r/min)，培养至对数7
中后期(活菌数约为1x10 CFU/mL)再以3％的接种量转接至乙醇胁迫培养基(30℃静置培养)并使用全自动生长曲线仪(芬兰Bioscreen C)测定菌株的生长趋势。所述结果如图5所示，本发明提供的粟酒裂殖酵母在8％乙醇存在的YPD培养基中培养34h，生长OD600值在1.50以上。对照菌株ATCC16979在此乙醇浓度下生长OD600值仅为0.65。

[0068] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。