蛋白质含量为至少100wt％(N x 6.25)d.b.的卡诺拉蛋白分离物可从卡诺拉油粕(canola oil seed meal)形成，如于2002年5月3日提交的共同待决的美国专利申请系列号10/137,391(美国专利申请公开号20030125526A1)、于2004年6月9日提交的10/476,230(美国专利申请公开号20040254353A1)和相应的PCT公开号WO 02/089597中所述，二者均被转让给本申请的受让人并且在此通过参考并入它们的公开内容。该程序涉及多步骤方法，包括使用盐溶液萃取卡诺拉油粕，将所得含水蛋白质溶液与残留的油粕分离，通过使用选择性膜技术将该含水溶液的蛋白质浓度增加至至少约200g/L同时保持离子强度基本恒定，将所得经浓缩的蛋白质溶液稀释进入冷水中以引起蛋白质胶束(micelle)的形成，沉降该蛋白质胶束以形成无定形的、粘性的、凝胶状的、谷蛋白样蛋白质胶束团(protein micellar mass)(PMM)，并从蛋白质含量为至少约100wt％(通过凯氏氮(Kjeldahl nitrogen)测定)(N x 6.25)的上清液中回收蛋白质胶束团。本文所用的蛋白质含量是基于干重量测定的。可对回收的PMM进行干燥。
在上述方法的一个实施方式中，对来自PMM沉降步骤的上清液进行处理以回收蛋白质分离物，其包括来自湿PMM和上清液的干燥蛋白质。该程序可通过初始使用超滤膜浓缩上清液，将经浓缩的上清液与湿PMM混合并干燥该混合物而实现。所得卡诺拉蛋白分离物具有至少约90wt％蛋白质(N x 6.25)的高纯度，优选至少约100wt％蛋白质(N x6.25)。
在上述方法的另一实施方式中，对来自PMM沉降步骤的上清液进行处理以从上清液中回收蛋白质。该程序可通过初始使用超滤膜浓缩上清液并干燥该浓缩物而实现。所得卡诺拉蛋白分离物具有至少约90wt％蛋白质(N x 6.25)的高纯度，优选至少约100wt％蛋白质(N x 6.25)。
前述美国专列申请中所述的程序基本是分批程序。在于2002年11月19日提交的共同待决的美国专利申请号10/298,678(美国专利申请公开号20040039174A1)和相应的公开的国际申请号WO 03/043439(被转让给本申请的受让人并且在此通过参考并入其公开内容)中，描述了用于制备卡诺拉蛋白分离物的连续方法。根据它们，将卡诺拉油粕与盐溶液连续混合，将该混合物穿过管道运输，同时从卡诺拉油粕中萃取蛋白质以形成含水蛋白质溶液，将该含水蛋白质溶液连续地与残留的卡诺拉油粕分离，将该含水蛋白质溶液连续地穿过选择性膜操作运输以将该含水蛋白质溶液的蛋白质含量增加至至少约200g/L，同时保持离子强度基本恒定，将所得的经浓缩的蛋白质溶液连续地与冷水混合以引起蛋白质胶束的形成，并使该蛋白质胶束连续地沉降，同时上清液连续地溢出直至在沉积容器中已经累积了期望量的PMM。将该PMM从沉积容器中移出并可被干燥。该PMM含有至少约90wt％(通过凯氏氮法测定)(N x 6.25)的蛋白质含量，优选至少约100wt％(N x 6.25)。
如前述美国专利申请系列号10/137,391和10/471,230中所述，可对溢出的上清液进行处理以从其回收卡诺拉蛋白分离物。
已知卡诺拉籽含有约10至约30wt％的蛋白质，并已经鉴定了几种不同的蛋白质组分。这些蛋白质是通过不同的沉降系数(S)来区分的。这些已知的和已经鉴定的蛋白质包括称作十字花科蛋白(cruciferin)的12S球蛋白、7S球蛋白和称作napin的2S白蛋白。
卡诺拉(Canola)也称作油菜籽或油料种子油菜(oil seed rape)。
在于2003年8月25日提交的共同待决的美国专利申请系列号10/413,371(美国专利申请公开号20040034204)和于2003年4月15日提交的10/510,766以及相应的公开的PCT公开号WO 03/08876中，被转让给本申请的受让人并且在此通过参考并入其公开内容，描述了PMM卡诺拉蛋白分离物的组合物和上清来源的卡诺拉蛋白分离物的组合物。该上清来源的卡诺拉蛋白分离物主要包括2S蛋白和较少量的7S蛋白和痕量的12S蛋白。该2S蛋白是低分子量白蛋白。该PMM产品主要包括7S蛋白，其中，2S蛋白和12S蛋白为相对次要的组分。该7S和12S蛋白是较高分子量的球蛋白，其中，7S分子为12S蛋白的半分子。
正如其所述的，该上清液来源的卡诺拉蛋白分离物呈现如下的蛋白质图谱：
约60至约95％wt％的2S蛋白，
约5至约40wt％的7S蛋白，以及
0至约5wt％的12S蛋白，优选
约70至约95wt％的2S蛋白，
约5至约30wt％的7S蛋白，以及
0至约2wt％的12S蛋白。
该PMM卡诺拉蛋白分离物呈现如下的蛋白质图谱：
约60至约98wt％的7S蛋白，
约1至约15wt％的12S蛋白，以及
0至约25wt％的2S蛋白，优选
约88至约98wt％的7S蛋白，
约1至约10wt％的12S蛋白，以及
0至约6wt％的2S蛋白。
已经发现主要由2S蛋白组成的上清液来源的卡诺拉蛋白分离物与主要由7S蛋白组成的PMM来源的卡诺拉蛋白分离物相比，对某些应用而言呈现较优越的功能性质。在在先申请所述的程序中，为了生产上清液来源的卡诺拉蛋白分离物，必需按顺序有效地经历PMM形成和上清液准备步骤，以将这些卡诺拉蛋白分级。
在于2005年7月21日提交的美国专利申请号11/038,086(美国专利申请公开号US 2005-0181112A1)中，被转让给本申请的受让人并且在此通过参考并入其公开内容(WO 2005/067729)，描述了这样的程序，其中，将来自PMM沉淀物的上清液在膜处理之前或之后进行热处理以沉淀7S蛋白，并留下富含2S蛋白的蛋白质溶液。可对剩余溶液进行喷雾干燥以回收干物质形式的2S蛋白。
该含有最小比例7S和12S蛋白的2S蛋白证明较未处理的2S蛋白有增加的溶解度(包括在酸性pH值下)，并能够对含水溶液提供改善的澄明度，并利用软饮料和运动饮料提供澄清蛋白质加强的饮料。
发明概述
本发明利用涉及离子交换的替代程序制备基本不含7S和12S卡诺拉蛋白的基本纯的2S卡诺拉蛋白。
在离子交换色谱法中，带电的离子交换介质用于结合带相反电荷的分子，而带相似电荷和不带电的材料则不被保留。这使得离子交换色谱法对纯化带电分子诸如蛋白质而言是一种有用的工具。卡诺拉蛋白的两个主要种类具有显著不同的等电点。7S/12S球蛋白的等电点范围为约6至7，而对2S白蛋白而言该数值近似为11。本文利用了这种差异通过离子交换色谱法来将蛋白质相互分离。
本为提供了一种离子交换方法，其中通过将2S蛋白结合于阳离子交换介质同时允许其他蛋白质和杂质被洗脱掉而将2S蛋白捕获。然后通过将阳离子交换介质暴露于合适的高盐浓度盐水中而将该2S蛋白从阳离子交换介质中释放。
依照本发明的一个方面，提供了生产基本纯的2S卡诺拉蛋白的方法，其包括将来自卡诺拉油粕的卡诺拉蛋白溶解以形成卡诺拉蛋白溶液，将该卡诺拉蛋白溶液与残留的卡诺拉油粕分离，将该卡诺拉蛋白溶液与阳离子交换介质在其中所述2S卡诺拉蛋白优先于其他卡诺拉蛋白结合于所述阳离子交换介质的条件下接触，将结合的2S卡诺拉蛋白与未结合的卡诺拉蛋白和杂质分离，以及将结合的2S卡诺拉蛋白与阳离子交换介质分离。
发明详述
如上所述，对卡诺拉蛋白溶液实施离子交换色谱法，以优先将2S卡诺拉蛋白结合于离子交换介质，并随后从该离子交换介质回收基本纯形式的2S卡诺拉蛋白。
该程序可以任何便利的方式完成。在本发明的一个优选方面，将卡诺拉蛋白的含水溶液在约5至6的pH下与阳离子交换介质接触，其中两个种类的蛋白质均被带上正电荷。利用盐浓度以限制带较少正电荷的7S/12S卡诺拉蛋白以及杂质诸如芥子碱的结合。
该含水卡诺拉蛋白溶液可通过从卡诺拉油粕萃取而最便利地形成。该萃取是使用含水盐溶液实现的，所述含水盐溶液具有期望的盐浓度和pH值，以有效保证2S蛋白优先结合于阳离子交换介质。该盐溶液的盐浓度范围通常为约0.25至0.35M NaCl，且该含水卡诺拉蛋白溶液的pH范围为约5至约6。
卡诺拉油粕的萃取可在期望的pH范围之外完成，然后必要时可采用任何便利的酸或碱将该卡诺拉蛋白溶液的pH调节至约5至约6的pH范围。
在一备选方式中，蛋白质可通过使用较低盐浓度的盐溶液来从卡诺拉油粕中萃取并且然后加入额外的盐至期望的浓度。然而，优选采用离子交换所要求浓度的盐水实现萃取，因为该萃取物溶液的形式为可直接施加于阳离子交换介质的形式，在形成后立即用于2S卡诺拉蛋白的分离。因此，几乎没有时间发生氧化反应或酚类化合物结合于蛋白质。
将该卡诺拉蛋白萃取物溶液施加于阳离子交换介质，所述阳离子交换介质可以任何便利的形式提供，诸如树脂珠或膜吸附器的形式。在膜吸附器中，离子交换基团被结合于微孔膜。代替树脂填充柱使用膜使得可以使用更高的流速并得到更快的处理。
该卡诺拉蛋白萃取物溶液与阳离子交换介质的接触，在适当的pH和盐水平存在下，引起2S蛋白与带较少正电荷的7S/12S蛋白相比优先被吸附。在阳离子交换介质与卡诺拉蛋白萃取物溶液分离后，可通过与含水盐溶液接触来将该2S蛋白从阳离子交换介质除去，所述含水盐溶液具有较该含水卡诺拉蛋白盐溶液更高的盐浓度，诸如约0.55至约0.70M NaCl。
该洗脱出的2S蛋白溶液具有高的盐浓度，并在干燥蛋白质之前通过任何便利的方式进行脱盐，诸如渗滤。该程序生产出高纯度的2S卡诺拉蛋白分离物，其基本不含7S/12S蛋白，且其蛋白含量按干重计(d.b.)为至少约100wt％(N x 6.25)。
卡诺拉7S/12S蛋白可在与离子交换介质接触后以未变性的形式从卡诺拉蛋白萃取物中回收，所述未变性的形式不同于利用等电点或热沉淀以分离这些蛋白质与2S蛋白时的形式。
实施例
实施例1
该实施例说明了使用阳离子交换柱制备基本纯的2S卡诺拉蛋白。
(a)蛋白质萃取：
典型地，使用每22.5g油粕150ml盐水进行卡诺拉油粕的一系列15％w/v萃取。使用磁力搅拌棒将这些样品在室温搅拌30分钟。在每一种情况中，通过在10200g下离心10分钟来将该萃取物与用过的油粕分离，然后通过采用25μm孔径的滤纸和0.45μm孔径注射器式滤器的连续过滤使其进一步澄清。通过LECO分析(LECO FP 528氮测定仪)测定该澄清萃取物的蛋白质含量，并通过尺寸排阻(SEC)HPLC测定其蛋白质图谱。在各次运行(run)中，盐溶液的盐浓度可在0.26至0.35M NaCl之间变化。
由于萃取盐浓度是受控制的，所以这对初始澄清的萃取物的蛋白质含量和图谱有一些影响(下面的表1)。就从蛋白质产率和2S蛋白的萃取方面而言，更高的盐浓度是合乎需要的，但它对分离有负面影响，如下所示。
表1-在不同盐水平制备的萃取物的分析
 NaCl的浓度(M)   pH   蛋白质浓度(％)   可归因于2S的HPLC  蛋白峰面积％  0.26   5.60   2.62   n.d.*  0.29   5.67   2.71   n.d.*  0.30   5.61   n.d.*   36.9  0.35   5.61   2.82   37.4
n.d.＝未测定
(b)色谱法：
将样品进行阳离子交换(CIEX)色谱，使用SP Sepharose XL(20ml)色谱柱，使用能够进行峰收集的GradiFrac LPLC系统(Pharmacia Biotech)进行操作。在每一次运行中，将10ml的澄清萃取物经由系统中的样品环施加于色谱柱。在所使用的盐水浓度下，2S蛋白被结合于色谱柱而7S和12S卡诺拉蛋白与其他杂质则流经通过(pass through)色谱柱。捕获空隙材料(void material)，然后将较萃取物更高的盐浓度的盐水施加于色谱柱以释放结合的2S蛋白。所使用的盐浓度是随着运行的进行而调节的，为了达到最好地分离蛋白质并保证结合材料的释放。所用的样品GradiFrac程序在下面的表-2中给出：
表2-用于从萃取物中CIEX分离2S的样品Gradifrac程序

注释：如同所开发的方法，所采用的节段体积(segment volume)可存在一些小的变异。
注释：一旦确定了所有的2S蛋白在洗脱步骤中都被释放，则取消运行之间用1M NaCl进行的色谱柱清洗。
每天，将从所有运行洗脱出的级分合并并在-60℃冷藏，除第20至26次运行的产品外，将合并后的级分冷藏用于第二天脱盐。下面的表3列出了在各次生产运行中用于萃取和洗脱的盐浓度。
表3-在各次生产运行中用于萃取和2S蛋白洗脱的盐浓度
  生产运行   萃取中NaCl  的浓度(M)   用于2S洗脱的NaCl  浓度(M)   1  2  3至8  9至13  14至26   0.30  0.30  0.35  0.29  0.26   0.55  0.60  0.65  0.65  0.65
用于萃取/蛋白质分离和2S蛋白洗脱的盐浓度是随着生产运行的进行而精细调节的。在第一次运行中，所用的盐浓度为0.30M/0.55M。空隙材料是作为重叠的双峰(doublet peak)收集的，发现第一个峰几乎含有所有的7S/12S，少量的未结合2S蛋白和大部分在萃取物中可见的杂质，除一部分芥子碱外。双峰中的第二个峰，它需要稍长的时间从色谱柱中出现，发现其含有显著量的芥子碱和非常少量的蛋白质和其他杂质。采用0.55M NaCl进行的洗脱未能从色谱柱中将所有的2S蛋白洗脱出来，因为采用1M NaCl清洗色谱柱时获得显著的2S蛋白峰。
对于第二次运行而言，将洗脱盐水平提高至0.60M以更好地释放2S蛋白。此次，清洗色谱柱时发现了较小的2S蛋白峰。在第三次运行中，将洗脱步骤增加至0.65M NaCl，并且发现该水平可有效地消除清洗色谱柱时看到的峰。将第三次运行中的初始盐水平增加至0.35M NaCl，希望使得两个空隙峰更靠近。双峰之间的分离降低，但是仍然获得了双峰。同样地，在该较高盐水平下的操作增加了不能够结合于色谱柱并可在空隙中发现的2S蛋白的量。
随后，将初始盐水平降低至0.29M，然后至0.26M，接连地降低了损失于空隙的2S蛋白的水平(下面的表4)。我们担心降低该初始盐水平将导致7S/12S蛋白或芥子碱与色谱柱的一些结合，这将是非常不希望的，因为这将使得2S洗脱步骤复杂化。然而，在0.26M NaCl下，2S蛋白是唯一观察到的结合于色谱柱的种类。
表4-基于萃取物盐浓度的总空隙材料中的2S含量
  NaCl的浓度(M)   2S峰面积(计数)   0.26  0.29  0.30  0.35   66769  115540  n.d.*  224545
*n.d.＝未测定
(c)洗脱出的2S蛋白的脱盐：
将洗脱出的2S蛋白的冰冻样品放置于冰箱中过夜以解冻。第二天将仍然冰冻的容器放置于温水浴中，在该温水浴中样品被加温刚好至冰晶熔化。然后将所有已解冻的样品过滤通过25μm孔径的滤纸，并合并成为单个大样品。通过浓缩和在Vivaflow 5000 MWCO Hydrosart超滤膜单元上的渗滤将所得2S蛋白脱盐。所收集的2S蛋白级分的总体积为大约1500ml。将合并后的2S蛋白溶液浓缩降至25至30ml，然后加入300ml水用于渗滤。将该样品再浓缩至25至30ml，并再次加入300ml水，然后将该样品再次再浓缩。从包含于下面表5中的结果可以看出，脱盐是采用大约10倍渗滤体积的两个步骤而有效地进行的。
表5-采用渗滤进行的盐含量的降低
  2S样品   浓度(mS)   pH   蛋白质浓度(％)   组合的GradiFrac级分  加入DF1水之后  加入DF2水之后  最终渗余物   49.6  5.68  0.943  n.d.*   5.83  5.28  4.92  n.d.*   0.31  n.d.*  n.d.*  5.84
*n.d.＝未测定。
然后将渗余物冷冻干燥。
(d)终产品：
使用Minolta CR-310色度计评价终产品的干色(dry colour)，并且也配制了溶液用于湿色(wet colour)分析。使用涡旋混合器将蛋白质粉末(0.5g)与水(10ml)混合。然后将该样品在7800g下离心10分钟(主要为了除去空气)，并通过LECO测定上清液中的蛋白质含量。将一个等分部分(aliquot)(8ml)的上清液转移至小烧杯中并加入充足的水以调节蛋白质含量至5％。然后将该样品照相，并将一个等分部分的样品用于蛋白质图谱分析(SEC HPLC)。同样将一些样品稀释至3.5％蛋白质并进行另一次照相。通过LECO测定该干粉的蛋白质含量，但是没有获得足够的样品用于进行水分含量分析。因此，蛋白质含量只基于湿物质来表达。
本研究收集了总共1.63g终产品。基于湿物质的粉末中的蛋白质含量为105.82％w/w(N x 6.25)。如果基于干物质表达(这是标准的)，则蛋白质含量将还要更高。再次水合产品的色谱分析表明在280nm所检测到的峰面积的96.1％可归因于2S，峰面积的3.8％可归因于napin原(pro-napin)。因此，峰面积的99.9％可归因于目标蛋白质。未检测到7S或12S蛋白。
干产物的颜色得分在表6中给出。
表6-通过阳离子交换从萃取物中分离得到的2S的干色
  样品   L*   a*   b*   2S   83.05   -2.61   15.49
在水中再次水合的产品的湿色呈现绿色，并且该溶液的澄明度极好。我们认为由于完全不存在7S/12S蛋白，所以该溶液的澄明度应该在大多数条件下保持相当稳定。
该产品的产率看起来相当好。由于分离条件被修改了数次并且已知发生了2S蛋白损失，特别是在初次运行中，由不完全结合于树脂以及不完全洗脱造成的2S蛋白损失，因此难以计算代表性的产率。通过最后的运行，所有的2S蛋白被洗脱出来，但仍有少量未结合于色谱柱。如上所述，假如它不允许其它种类结合于色谱柱，则降低初始盐含量或许可解决该问题。如果认为1.63g的2S蛋白是从260ml(26x 10ml进样)的澄清萃取物中产生的，然后可将其外推至从1000L澄清萃取物中得到6.3kg的2S。
实施例2
该实施例说明了使用阳离子交换膜生产基本纯的2S卡诺拉蛋白。
(a)蛋白质萃取：
使用300ml的0.3M NaCl通过将油粕与盐水混合并使用磁力搅拌棒在室温将样品搅拌30分钟来完成30g卡诺拉油粕的10％w/v萃取。然后通过在10,200g下离心10分钟将该萃取物与用过的油粕分离，并通过采用25μm孔径的滤纸和0.45μm孔径的滤片(filter disk)进行连续过滤将该萃取物进一步澄清。通过SEC HPLC测定该萃取物的蛋白质图谱。
0.26M NaCl在实施例1中被鉴定为用于萃取溶液的盐水平的最佳选择。在采用膜吸附器的预实验中初始采用了该盐水平(数据未给出)，但发现少量的7S/12S蛋白和一些芥子碱被膜结合。将萃取溶液的盐含量增加至0.3M NaCl限制7S/12S蛋白结合。0.3M NaCl萃取物的蛋白质图谱为蛋白质峰面积的64.6％可归因于7S/12S，35.4％可归因于2S。
(b)离子交换：
离子交换分离是使用串联连接的两个Sartobind S75(Sartorius AG，Goettingen，德国)强酸阳离子吸附器膜单元进行的。使用蠕动泵以推动各种溶液通过膜单元。样品分离方案在表7中给出。
表7-用于使用阳离子交换膜吸附器从萃取物中分离2S的样品方案
  步骤   溶液   体积(ml)   流速(ml/min)   平衡  样品加载  膜漂洗  2S洗脱   0.3M NaCl  澄清的萃取物  0.3M NaCl  0.67M NaCl   40  10  50  30   20  20  20  20
在连续两天的时间内完成了大约32次运行。每天将从所有运行洗脱出的2S蛋白级分合并并冷藏直至脱盐。通过SEC HPLC测定空隙/清洗和洗脱出的级分的蛋白质图谱。
发现小部分的2S(蛋白质峰面积的7.7％)损失于空隙级分中，也许是由系统的过载造成的。洗脱出的级分几乎完全是2S(蛋白质峰面积的99.6％)。在生产运行的第一天，使用0.65M NaCl作为洗脱缓冲液，并在当天结束时，将膜吸附器用1M NaCl(40ml)清洗。1M NaCl洗脱液的分析(SEC HPLC)显示少量的2S未被0.65M NaCl洗脱出来。在分离运行的第二天，使用0.67M NaCl作为洗脱缓冲液。采用1M NaCl清洗膜，这不释放任何2S蛋白，表明0.67M NaCl足以回收所有结合的2S蛋白。
(c)经分离的2S蛋白的脱盐：
通过浓缩和在Vivaflow 5000 MWCO Hydrosart超滤膜单元上的渗滤将洗脱出的2S蛋白脱盐。所有所收集的2S蛋白级分的体积为大约1000ml。将其浓缩降至25至30ml，然后加入300ml水用于渗滤。将该样品再浓缩至25至30ml，并再次加入400ml水，然后将该样品再次再浓缩。在第二次渗滤步骤之后，将渗余物冷冻干燥。
使用电导仪测定多种样品的导电率。渗滤的目标是将样品的电导率降低至1mS以下。为了通过SEC HPLC测定蛋白质图谱而检查渗透物。
两个渗滤步骤有效地降低了2S蛋白样品的电导率(表8)。在超滤或渗滤渗透物中未检测到蛋白质。
表8-采用渗滤进行的盐含量的降低
  2S样品   电导率(mS)   洗脱物  加入DF1水之后  加入DF2水之后  最终渗余物   49.8  7.56  0.79  n.d.*
*n.d.＝未测定。
(d)终产品：
使用Minolta CR-310色度计评价终产品的干色，并且也配制了溶液用于湿色分析。使用涡旋混合器将蛋白质粉末(0.6g)与水(10ml)混合。然后将该样品在7800g下离心10分钟，并通过LECO测定上清液中的蛋白质含量。将一个等分部分(8ml)的上清液转移至小烧杯中并加入充足的水以调节蛋白质含量至5％。然后将该样品照相，并将一个等分部分的样品用于蛋白质图谱分析(SEC HPLC)。同样将一些样品稀释至3.5％并进行另一次照相。通过LECO测定该干粉的蛋白质含量，但是没有获得足够的样品用于进行水分含量分析。因此，蛋白质含量只基于湿物质来表达。
本研究收集了总共1.54g终产品。该产品的纯度非常好，基于湿物质的粉末中的蛋白质含量为101.99％w/w(N x 6.25)。如先前所述的，未产生足够的样品用于进行水分含量分析，因此蛋白质的含量不能基于干物质表达。再次水合产品的色谱分析表明在280nm所检测到的峰面积的99.85％可归因于2S蛋白。未检测到7S蛋白或12S蛋白。
所测定的用于膜吸收器2S的干色数值在表9中给出。
表9-通过膜吸附器阳离子交换从萃取物中分离得到的2S的干色
  样品   L*   a*   b*   2S   84.21   -2.40   15.09
在水中再次水合的产品的湿色和澄明度表明该2S蛋白是通过柱色谱法生产的。我们认为由于完全不存在7S/12S蛋白，该溶液的澄明度应该在大多数条件下保持相当稳定。
公开内容的概述
在该公开内容概述中，本发明提供了使用离子交换色谱法回收高纯度2S卡诺拉蛋白的方法。修改可能落于本发明的范围之内。