一种耐热、耐盐碱、耐受离子液的纤维素酶及其应用专利检索-洗涤剂组合物用单一物质作为洗涤剂皂或制皂树脂皂甘油的回收专利检索查询-专利查询网

一种耐热、耐盐碱、耐受离子液的 纤维素酶及其应用

专利类型	发明公开	法律事件	公开;
专利有效性	公开	当前状态	公开
申请号	CN202510049182.X	申请日	2025-01-13
公开(公告)号	CN119842671A	公开(公告)日	2025-04-18
申请人	大理大学;	申请人类型	学校
发明人	尹以瑞; 王丽娟; 胡成巧; 黄梅; 杨正凤; 谢开庆; 朱丹; 吕志华;	第一发明人	尹以瑞
权利人	大理大学	权利人类型	学校
当前权利人	大理大学	当前权利人类型	学校
省份	当前专利权人所在省份：云南省	城市	当前专利权人所在城市：云南省大理白族自治州
具体地址	当前专利权人所在详细地址：云南省大理白族自治州大理市大理古城弘圣路2号	邮编	当前专利权人邮编：671003
主IPC国际分类	C12N9/42	所有IPC国际分类	C12N9/42 ; C12N15/70 ; C12N1/21 ; C12N15/56 ; A23L29/00 ; A23K10/14 ; A23K20/189 ; C11D3/386 ; C12R1/19
专利引用数量	0	专利被引用数量	0
专利权利要求数量	7	专利文献类型	A
专利代理机构	北京慕达星云知识产权代理事务所	专利代理人	魏志恒;
摘要	本发明公开了一种耐热、耐盐碱、耐受离子液的纤维素酶及其应用。属于纤维素酶技术领域。本发明从新疆艾比盐湖底泥宏基因组中获得一个新的纤维素酶基因c5‑cel4，对其进行克隆，并在大肠杆菌中异源表达。C5‑CEL4具有耐热、耐碱、耐盐和离子液高耐受性的特性。此外，该酶在大肠杆菌中能进行分泌表达且蛋白C端从氨基酸残基315～448被切除，该酶的分泌与蛋白C端氨基酸残基315～448序列相关，同时能耐受大多数金属离子、抑制剂和醇类。这预示着C5‑CEL4是生物质转化、洗涤和纺织工业生产的理想候选酶，在饲料、食品和生物能源中具有巨大潜在的应用前景。
权利要求	1.一种耐热、耐盐碱、耐受离子液的纤维素酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示； MIFGAGAQAVEPLTVNGNRILAGGEVRSLAGPSFFWSNTGWGAERFYNESAVRWVKNDWNATIVRASLGVDGEGGYLEDPAGNKSRVVELVEAAIANDLYVIIDWHSHHAEDHPAEAVAFFEEMARNYGHHDNVIYEIYNEPLQISWSNTIKPYAETVISAIRAIDPDNLIVVGTPTWSQDVDTASWDPIQGHANIAYTLHFYAGTHTQYLRDKARTALNNGIALFVTEWGTVNANGDGGVAQDETQRWMDFLEANHISHANWALNDKDEGASALVPGVSATGGWGQSELTESGRLVRDIVRGWDGGGSSSSSS，SEQ ID NO.6。 2.权利要求1所述的纤维素酶的编码基因。 3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，其核苷酸如SEQ ID NO.5所示； ATGATATTCGGCGCAGGTGCCCAGGCGGTGGAGCCGTTGACCGTCAATGGCAACCGGATACTGGCCGGTGGTGAAGTGCGCAGCCTGGCCGGGCCCAGCTTCTTCTGGAGCAACACCGGCTGGGGCGCCGAGCGTTTCTACAACGAAAGCGCGGTGCGCTGGGTCAAGAACGACTGGAACGCCACCATCGTGCGCGCCTCCCTGGGTGTGGACGGAGAGGGCGGCTACCTGGAAGACCCGGCCGGCAACAAGAGCCGGGTGGTCGAACTGGTGGAGGCAGCCATTGCCAACGACCTCTACGTGATCATCGACTGGCACTCCCACCACGCCGAGGACCACCCCGCCGAAGCGGTAGCGTTTTTTGAGGAAATGGCCCGCAACTACGGTCATCACGACAACGTCATCTACGAAATCTACAACGAGCCATTACAGATTTCCTGGAGCAACACCATCAAGCCTTATGCGGAGACGGTCATTTCCGCCATCCGCGCCATCGATCCGGACAACCTGATCGTGGTGGGCACACCCACCTGGTCCCAGGACGTGGACACCGCCTCCTGGGACCCGATCCAGGGACACGCCAATATCGCCTACACCCTGCACTTCTACGCCGGCACCCATACGCAATACCTGCGCGACAAGGCGCGGACCGCATTGAACAACGGCATCGCGCTGTTCGTCACCGAGTGGGGTACCGTCAACGCCAACGGCGACGGCGGTGTCGCCCAGGATGAAACCCAGCGCTGGATGGACTTCCTCGAAGCCAACCATATCAGCCACGCAAACTGGGCACTGAACGACAAGGACGAGGGCGCCTCCGCCCTGGTGCCTGGCGTCAGCGCCACCGGCGGCTGGGGGCAGAGCGAACTGACCGAATCCGGCCGGCTGGTGCGGGATATAGTGCGGGGCTGGGATGGAGGCGGTTCCTCTTCGAGCTCCAGCTCGTCCAGTTCCAGCTCCAGTAGTTCCAGCAGCTCAAGTTCCTCCTCCAGCTCCAGCTCGTCGTCGAGTTCGAGTTCTTCGTCCAGCTCCGGTGGCAGCGGCGCACTGAGCTGCGATCCCGGCAATGCGGACGTCTGGAATTCCGGCTTTGTACTGAGCAATGTCAGCGTGCACAACGATGGCGGAGCGGACGTCGACGGCTGGCAGGTTTCACTGCAATTCCCCCAGCCCATCCAGCTCACCAATGGCTGGAACGGCGACTTCAGCCTCTCGGGCGATGGCAAAACCCTGACCGTGGCGAATATCGGCTGGAACGGCTACCTCCAGCCGGGGCAATCCACTTCGTTCGGGCTGCAGGGCAGTTACAGCGGTAATTTCCTGATGCCGGAATGCAGCGCCAACTGA，SEQ ID NO.5。 4.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求3中所述的编码基因。 5.一种重组菌，其特征在于，包含权利要求4中所述的重组载体。 6.权利要求1所述的纤维素酶在降解CMC‑Na、甘蔗渣木聚糖、山毛榉木聚糖、玉米芯木聚糖中的应用。 7.权利要求1所述的纤维素酶在食品、饲料、纺织以及工业生产中的应用。
说明书全文	一种耐热、耐盐碱、耐受离子液的纤维素酶及其应用技术领域 [0001] 本发明涉及纤维素酶技术领域，更具体的说是涉及一种耐热、耐盐碱、耐受离子液的纤维素酶及其应用。背景技术 [0002] 纤维素是一种可再生的有机大分子多糖，在可再生植物生物质中含量最丰富。纤维素酶对纤维素的有效降解是木质纤维素转化的关键步骤，纤维素完全水解为葡萄糖需要内切葡聚糖酶(endo‑1,4‑D‑glueanase,EC3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(exo‑1,4‑D‑glucanase,EC3.2.1.91)和β‑葡萄糖苷酶(1,4‑D‑glueosidase,EC3.2.1.21)的共同作用。其中，内切葡聚糖酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机发起攻击，让聚合物更易被其它纤维素水解酶水解，是内键水解的主要酶群。 [0003] 目前纤维素酶广泛应用于纸浆造纸、生物燃料、食品、酿造、纺织品、动物饲料、生物纳米材料、酚醛等各种行业和产品，但在高温、高盐碱工业环境下，酶极易失活，因此，纤维素酶的热稳定性和耐盐碱性格外重要。 [0004] 虽然许多耐热纤维素酶具有耐盐性和多嗜极性，但真正能在高盐环境下进行有效催化转化反应的很少。所以，筛选耐盐碱纤维素酶有利于降低成本，提高工业效率。 [0005] 综上，如何提供一种耐盐碱的纤维素酶是本领域技术人员亟需解决的问题。发明内容 [0006] 有鉴于此，本发明提供了一种耐热、耐盐碱、耐受离子液的纤维素酶及其应用。 [0007] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案： [0008] 一种耐热、耐盐碱、耐受离子液的纤维素酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。 [0009] 上述的纤维素酶的编码基因。 [0010] 进一步的，其核苷酸如SEQ ID NO.5所示。 [0011] 一种重组载体，包含上述的编码基因。 [0012] 一种重组菌，包含上述的重组载体。 [0013] 上述的纤维素酶在降解CMC‑Na、甘蔗渣木聚糖、山毛榉木聚糖、玉米芯木聚糖中的应用。 [0014] 上述的纤维素酶在食品、饲料、纺织以及工业生产中的应用。 [0015] 经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为： [0016] 本发明从新疆艾比盐湖底泥宏基因组数据中分离到一个新的纤维素酶基因，命名为c5‑cel4，克隆该基因序列，构建重组载体，导入大肠杆菌，通过异源表达和蛋白纯化测定重组纤维素酶活性。结果表明，该酶是一种耐热、耐碱、嗜盐的离子液耐受型纤维素酶，且能分泌至大肠杆菌胞外，这预示着该酶可为纤维素酶在造纸、纺织、食品、饲料和生物燃料等领域的利用提供酶源储备。附图说明 [0017] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。 [0018] 图1为本发明实施例1中重组纤维素酶C5‑CEL4胞外发酵液及活性监测，其中，A代表胞外发酵情况；B代表活性结果； [0019] 图2为本发明实施例1中重组纤维素酶C5‑CEL4的SDS‑PAGE胶图，其中，A代表胞外纯化酶胶图；B代表胞内纯化酶胶图；Lane 1代表蛋白质分子量标记；Lane 2代表大肠杆菌DH5α/pSHY211‑c5‑cel4的菌体；Lane 3代表纯化酶C5‑CEL4；Lane 4代表纯化酶的酶谱分析； [0020] 图3为本发明实施例1中重组纤维素酶C5‑CEL4基于LC‑MS/MS的蛋白C端测序分析，其中，A代表总离子流色谱图，Chymotrypsin TIC图；B代表总离子流色谱图，Pepsin‑TIC图；C代表C端二级质谱图； [0021] 图4为本发明实施例1中基于氨基酸序列的最大似然分析得到的系统发育树图，显示C5‑CEL4与相关纤维素酶的系统发育位置，在节点上给出引导值(以1000次复制的百分比表示)； [0022] 图5为本发明实施例1中C5‑CEL4的氨基酸序列多重比对图，8BQA、8BQC、8C10、4MIR、1EGZ是氨基酸序列的PBD IDS，同源性水平为100％的残基用红色突出显示，其中， 8BQA、8BQC来自Cellvibriojaponicus，8C10来自Teredinibacter waterburyi，4MIR来自土壤宏基因组，1EGZ来自Dickeya chrysanthemi； [0023] 图6为本发明实施例1中C5‑CEL4的蛋白结构分析，其中，A为利用InterPro对C5‑CEL4的蛋白序列进行结构域预测，该结构描述了一个纤维素酶催化结构域(CD)；B为GH5家族纤维素酶C5‑CEL4，在SWISS‑MODEL服务器上使用Microbulbifer rhizosphaerae来源的GH5家族内切葡聚糖酶作为模板进行同源建模(UniProt登录号：A0A7W4WCK3)； [0024] 图7为本发明实施例1中温度和pH对重组纤维素酶C5‑CEL4的活性和稳定性的影响，其中，A代表温度对C5‑CEL4活性的影响；B代表pH对C5‑CEL4活性的影响；C代表温度对胞内酶C5‑CEL4稳定性的影响；D代表pH对胞内酶C5‑CEL4稳定性的影响；初始活性为100％，图中的每个值代表平均±SEM(n＝3)，胞外酶100％＝24.36+0.63U/mg,胞内酶100％＝19.6±3.47U/mg； [0025] 图8为本发明实施例1中NaCl和离子液对胞内酶C5‑CEL4的影响，其中，A代表NaCl对C5‑CEL4活性的影响；B代表孵育9月，NaCl浓度对C5‑CEL4稳定性的影响；C代表离子液对胞内酶C5‑CEL4活性的影响；D代表4℃孵育24h，离子液对胞内酶C5‑CEL4稳定性的影响；初始活性为100％，图中的每个值代表平均±SEM,100％＝19.6±3.47U/mg； [0026] 图9为本发明实施例1中C5‑CEL4的预测表面静电势，其中，A代表C5‑CEL4的表面静电势；B代表由A图在Pymol 2.6中翻转180°所得的表面静电势；负静电势和正静电势分别用红色和蓝色表示； [0027] 图10为本发明实施例1中C5‑CEL4水解CMC‑Na的薄层色谱分析，其中，通道1，标准品:葡萄糖(G1)、纤维二糖(G2)、纤维三糖(G3)、纤维四糖(G4)；通道2，无酶液的CMC‑Na；通道3，由CMC‑Na水解纯化的C5‑CEL4。具体实施方式 [0028] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。 [0029] 本发明所需药剂为常规实验药剂，采购自市售渠道；未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。 [0030] 实施例1 [0031] 1材料与方法 [0032] 1.1样本收集和宏基因组测序 [0033] 取样点位于新疆艾比湖(45°09′35″N，83°53′21″E)，艾比湖表面温度在7.8℃左右，pH值为8.49。底泥样本在干冰上快速冷冻，用于DNA分离和宏基因组测序。使用power soil Kit 试剂盒(MOBIO dnasy PowerSoil Kit,USA)进行DNA分离。宏基因组测序由苏州GENWIZ公司采用HiSeq 2500仪器进行，序列分析用IMG服务器(https://img.jgi.doe.gov/cgi‑bin/mer/main.cgi)。 [0034] 1.2纤维素酶序列预测及序列分析 [0035] 基于功能预测，从宏基因组数据库中预测到一个纤维素酶基因序列，命名为c5‑cel4。氨基酸序列的翻译使用Expasy‑Translate tool。使用BLASTp程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对c5‑cel4的蛋白质序列进行比对。利用RCSB PDB、SWISS‑MODEL、AlphaFold Protein Structure Database(ebi.ac.uk)、MEGA 7和ESPript 3.0进行氨基酸多序列比对和同源建模。使用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测信号肽、Search‑InterPro(ebi.ac.uk)预测蛋白结构域。使用MEGA 7进行系统发育分析，采用最大似然法和泊松校正模型构建系统发育树。 [0036] 1.3C5‑CEL4的克隆、表达、纯化与鉴定 [0037] 采用Primer 5.0设计兼并引物：c5‑cel4‑F(CATCATCATCATCATCATGAAATGATAT TCGGCGCAGGTGCCCAG，SEQ ID NO.1)和c5‑cel4‑R(GTGCTCGAGTGCGGCCGCAAG TCAGTTGGCGCTGCATTCCGGC，SEQ ID NO.2)扩增全长c5‑cel4基因。下划线序列表示经BamH I和Hind III酶切后的pSHY211载体(Characterization of a GH10 extremely thermophilic xylanase from the metagenome of hot spring for prebiotic production.)的同源重组片段。PCR由TransStarFastPfu Fly DNA聚合酶完成(TransGen Biotech,China)。PC R扩增程序为：95℃预变性3min，98℃20s，55℃30s，72℃2min，进行29次循环，72℃下孵育10min进行最终延伸。使用pEASY‑Uni无缝克隆与组装试剂盒(TransGen Biot ech,China)将PCR产物插入pSHY211载体中，得到表达质粒pSHY211‑c5‑cel4。大肠杆菌D H5α用于c5‑cel4基因的克隆。大肠杆菌在含有100μg/mL卡那霉素的LB培养基上生长，DNA分离纯化试剂盒购自Sangon(中国)。 [0038] 用pSHY211‑c5‑cel4表达纯化重组大肠杆菌DH5α。在含100μg/mL卡那霉素的15mL LB液体培养基中，37℃、180r/min，过夜培养，作为种子液。以5％接种量，将种子液接种于含200mL基础盐和100mL LB混合液体培养基中，混合液体培养基含100μg/mL的卡那霉素，37℃，180r/min，振荡培养36h。再4000r/min，离心30min，收集上清液作为胞外粗酶液。收集大肠杆菌生物量，大肠杆菌生物量用25～30mL含10mM咪唑的PBS缓冲液(pH 7.6)进行重悬，置于冰水浴中进行超声破碎，裂解液于4℃，12,000r/min离心20min，取上清液作为胞内粗酶液。将过滤后的胞内以及胞外粗酶液分别加入平衡后的Ni‑NTA镍柱(Histrap,TransGen Biotech,China)，重悬镍柱填料，置于500mL锥形瓶中，≤15℃摇床150r/min振荡1.5h进行结合，提高结合蛋白量。按照Yin et al.(2017)(The Hybrid Strategy of Thermoactinospora rubra YIM 77501T for Utilizing Cellulose as a Carbon Source at Different Temperatures)先前报道的方法纯化胞内蛋白以及胞外蛋白，用于重组纤维素酶表征。用Bradford蛋白测定试剂盒(Order NO.C5‑CEL403031,Sangon Biotech,China)测定蛋白浓度，以牛血清蛋白为标准。纯化的C5‑CEL4酶使用12％SDS‑PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)进行电泳，用考马斯亮蓝R‑250染色蛋白条带。使用酶谱技术评估凝胶内的纤维素酶活性，简单地说，样品在含有0.5％(w/v)CMC‑Na的12％SDS‑丙烯酰胺凝胶上溶解。电泳后，用2.5％(v/v)Triton X‑100(pH 7.0)洗涤30min，200mM磷酸缓冲液浸泡 15min，在磷酸缓冲液(pH7.0)中于45℃下孵育1小时。最后，凝胶在25℃下用0.2％(w/v)刚果红染色10min，使用1mol/L 氯化钠去除刚果红，直到在凝胶的背景下可见一个清晰的活性条带。 [0039] 将蛋白目的条带切成1mm3的胶粒，装入1.5mL EP管中。使用50％ACN(乙腈)‑50％50mMNH4HCO3(碳酸氢铵)溶液脱色，放置10～30min吸出弃去，重复此操作至胶粒无色。加入 100％ACN 1000μL，放置30min，待胶粒呈白色缩至团状，弃去ACN，室温放置干燥。还原烷基化：取100μL 10mM DTT(二硫苏糖醇)溶液加入样品中，于56℃水浴中还原1h，吸出上清弃去；取100μL 20mM IAM(碘乙酰胺)溶液加入样品中，暗处室温反应1h，吸出上清弃去。取500μL脱色液加入样品，涡旋后吸出弃去；取1000μL 100％ACN加入样品中，待胶粒呈白色缩至团状，弃去ACN，室温放置干燥。加入50μL浓度为25ng/μL的胰蛋白酶(用50mMNH4HCO3稀释)，密封置于37℃水浴中酶切16h。肽段提取：加提取液(5％三氟乙酸TFA‑50％ACN‑45％水)100μL/管，37℃水浴1h后，超声5min，离心5min，将提取液移入另一新EP管中，重复提取一次，将提取液合并，真空离心干燥。酶切后肽段使用脱盐柱脱盐，于45℃真空离心浓缩仪中挥干溶剂。 [0040] 使用Easy‑nLC 1200/Q ExactiveTMHybrid Quadrupole‑OrbitrapTMMass Spectrometer高分辨液质联用系统进行数据采集。色谱分离：流动相A为含0.1％甲酸的水溶液，流动相B为含0.1％FA(甲酸)和80％ACN；0～2min，4～8％B；2～35min，8～28％B；35～55min，28～40％B；55～56min，95％～95％B，56～66min，95％～95％B，流速0.6μL/min。色谱柱：150μm i.d.×170mm,packing:Reprosil‑Pur 120C18‑AQ 1.9μm。质谱采集：Full MS: Resolution(70000)，AGC target(4e8)，Maximum IT(20ms)，Number ofscan ranges(1)，Scan range Spectrum(300‑1800m/z)，Datatype(Profile)；dd‑MS2:Resolution(17500)，AGC target(1e5)，MaximumIT(50ms)；TopN：(20)；NCE steppedNCE(30)。使用Byonic 软件进行分析。 [0041] 采用Primer5.0设计兼并引物:c5‑cel4‑gh5‑F2(CATCATCATCATCATCATGAAATGAT ATTCGGCGCAGGTGC，SEQ ID NO.3)和c5‑cel4‑gh5‑R2(GTGCTCGAGTGCGGCCGCAA GTCAGCTGGAGCTCGAAGAGGAA，SEQ ID NO.4)扩增c5‑cel4‑gh5酶基因。c5‑cel4‑gh5克隆、表达、纯化的方法与c5‑cel4一致。将C5‑CEL4和C5‑CEL4‑GH5单克隆菌体分别接种于含6mL基础盐和3mL LB的混合液体培养基中，混合液体培养基含100μg/mL的卡那霉素。C5‑CEL4和C5‑CEL4‑GH5分别接种三只试管，设置三个重复，37℃，180r/min，振荡培养36h。在4℃，12000r/min，离心20min，收集上清液作为胞外粗酶液。收集大肠杆菌生物量，大肠杆菌生物量用5mL PBS缓冲液(pH 7.6)进行重悬，置于冰水浴中进行超声破碎，裂解液于4℃，12, 000r/min离心20min，取上清液作为胞内粗酶液。比较C5‑CEL4和C5‑CEL4‑GH5的胞内外活性差异。 [0042] 1.4酶活测定 [0043] 以1％(w/v)的羧甲基纤维素钠(CMC‑Na)为底物，采用3,5‑二硝基水杨酸(DNS)法测定还原糖的释放量，测定对CMC‑Na的活性，每单位CMCase活性定义为每分钟释放1μmol葡萄糖当量还原糖的酶量。测定方法：取10μL纯化酶加入到90μL含有1％CMC‑Na的最适pH缓冲液中，在最适温度下反应30min，取出后迅速加入150μL的DNS终止反应，90℃条件下热激10min显色。拿出冷却后取150μL反应混合液加入96孔培养板中，使用酶标仪在540nm处测定其吸收值。每组实验设置3个平行，1个对照。 [0044] 1.5酶学性质 [0045] 通过将纯化后的酶C5‑CEL4在pH 3.0～10.0(柠檬酸‑磷酸氢二钠缓冲液，pH 3.0～8.0；甘氨酸‑氢氧化钠缓冲液，pH 8.0～10.0)下测定最适pH。通过在最适pH下测定C5‑CEL4在不同温度(20～75℃)下的活性来确定最适温度。为了评估热稳定性和pH稳定性，纯化的C5‑CEL4在不同温度(40、45、50、55和60℃)下孵育不同时间(0、20、40、60、80、100和120min)和梯度pH(3.0～13.0)中孵育不同时间(4℃，12和24h)后测定残余酶活性。 [0046] 1.6盐、离子液体、金属离子和化学试剂对酶活性的影响 [0047] 在50℃，pH7下测定最适盐浓度(0、0.1、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0M的NaCl)。将纯化的酶液在pH7.0的盐溶液(0～5M)中孵育(4℃)9个月后，测定酶残余活性(不除盐测定)。通过AlphaFoldProtein Structure Database和Pymol2.6软件进行C5‑CEL4的表面静电势预测。 [0048] 在50℃，pH7条件下加入不同浓度(w/v，1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％)的不同离子液(即1‑丁基‑3‑甲基咪唑四氯硼酸盐BMIM‑BF4， 1‑丁基‑3‑甲基咪唑醋酸盐BMIM‑Ac，和1‑乙基‑3‑甲基氯化咪唑鎓EMIM‑Cl)测定相对酶活性。将纯化的酶液在pH7.0的上述三种离子液溶液(w/v，1％、5％、10％、20％、30％、40％、 45％、50％)中孵育(4℃)24h后，测定酶残余活性。 [0049] 金属离子、化学试剂和离子液对C5‑CEL4活性的影响，将1mM和10mM的金属离子(Na+ + 2+ 3+ 2+ 2+ 2+ 2+ + 2+ 2+ 2+,K ,Mg ,Fe ,Ca ,Zn ,Co ,Cu ,Ag ,Mn ,Pb 和Ni )，0.1％和1％的不同化学试剂(EDTA、PMSF、DTT、Tween80、SDS、CTAB，对应的全称分别为乙二胺四乙酸、苯甲磺酰氟、二硫苏糖醇、聚山梨酯‑80、十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵)，1％和10％的不同醇类(Methanol、Ethanol、IPA、β‑ME，对应的全称分别为甲醇、乙醇、异丙醇、β‑巯基乙醇)分别添加到酶液的反应体系中，以未处理的酶液所测酶活为对照(100％)，测定相对酶活性。 [0050] 1.7底物特异性的测定 [0051] 控制条件并用上述相同的过程进行测试，反应混合物中不添加任何添加剂。分别以CMC‑Na、甘蔗渣木聚糖、山毛榉木聚糖、玉米芯木聚糖、微晶纤维素、纤维二糖为底物(1％,w/v)来探究C5‑CEL4胞内酶及胞外酶的底物特异性。以2～20mg/mL的不同浓度的CMC‑Na和甘蔗渣木聚糖测定C5‑CEL4胞内酶及胞外酶的动力学常数，在50℃，pH7下孵育5/10min。采用Lineweaver‑Burk图计算了反应的最大速度Km(Michaelis‑Menten constant)和Vmax(maximum velocity ofthe reaction)常数。 [0052] 1.8水解产物的薄层色谱分析 [0053] 将1％CMC‑Na与10μg纯化酶组成的反应混合物分别在最佳pH和温度下孵育2h。采用硅胶60板(Merck,Darmstadt,Germany)对CMC水解产物进行薄层色谱(TLC)表征。溶剂为1‑丁醇/乙酸/水(2:1:1,v/v/v)。用现制备的5％(v/v)H2SO4乙醇喷雾后，在120℃下处理 10min，检测糖。糖标准为葡萄糖(G1)、纤维素二糖(G2)、纤维素三糖(G3)、纤维素四糖(G4)。 [0054] 1.9统计分析 [0055] 除非另有说明，所有试验均设置三次重复，所有分析均采用平均值。结果使用SPSS20.0进行统计分析，以均数±SEM表示。统计学分析采用单因素方差分析，多个实验组比较采用Tukey检验(0.01 [0056] 2结果 [0057] 2.1C5‑CEL4基因的克隆、异源表达及纯化 [0058] 从新疆艾比湖的底泥中提取DNA样本进行测序。对纤维素酶序列进行相似性搜索，得到一个候选纤维素酶基因序列，命名为c5‑cel4。c5‑cel4核苷酸序列全长1347bp，编码448个氨基酸。在c5‑cel4中未发现明显的信号肽序列，提示该酶可能定位于细胞质。推导出的无信号肽蛋白由448个氨基酸组成，理论计算的分子大小为47.54KDa，理论pI 4.51。 [0059] 该纤维素酶基因的核苷酸序列如下所示： [0060] ATGATATTCGGCGCAGGTGCCCAGGCGGTGGAGCCGTTGACCGTCAATGGCAACCGGATACTGGCCGGTGGTGAAGTGCGCAGCCTGGCCGGGCCCAGCTTCTTCTGGAGCAACACCGGCTGGGGCGCCGAGCGTTTCTACAACGAAAGCGCGGTGCGCTGGGTCAAGAACGACTGGAACGCCACCATCGTGCGCGCCTCCCTGGGTGTGGACGGAGAGGGCGGCTACCTGGAAGACCCGGCCGGCAACAAGAGCCGGGTGGTCGAACTGGTGGAGGCAGCCATTGCCAACGACCTCTACGTGATCATCGACTGGCACTCCCACCACGCCGAGGACCACCCCGCCGAAGCGGTAGCGTTTTTTGAGGAAATGGCCCGCAACTACGGTCATCACGACAACGTCATCTACGAAATCTACAACGAGCCATTACAGATTTCCTGGAGCAAC ACCATCAAGCCTTATGCGGAGACGGTCATTTCCGCCATCCGCGCCATCGATCCGGACAACCTGATCGTGGTGGGCACACCCACCTGGTCCCAGGACGTGGACACCGCCTCCTGGGACCCGATCCAGGGACACGCCAATATCGCCTACACCCTGCACTTCTACGCCGGCACCCATACGCAATACCTGCGCGACAAGGCGCGGACCGCATTGAACAACGGCATCGCGCTGTTCGTCACCGAGTGGGGTACCGTCAACGCCAACGGCGACGGCGGTGTCGCCCAGGATGAAACCCAGCGCTGGATGGACTTCCTCGAAGCCAACCATATCAGCCACGCAAACTGGGCACTGAACGACAAGGACGAGGGCGCCTCCGCCCTGGTGCCTGGCGTCAGCGCCACCGGCGGCTGGGGGCAGAGCGAACTGACCGAATCCGGCCGGCTGGTGCGGGATATAGTGCGGGGCTGGGATGGAGGCGGTTCCTCTTCGAGCTCCAGCTCGTCCAGTTCCAGCTCCAGTAGTTCCAGCAGCTCAAGTTCCTCCTCCAGCTCCAGCTCGTCGTCGAGTTCGAGTTCTTCGTCCAGCTCCGGTGGCAGCGGCGCACTGAGCTGCGATCCCGGCAATGCGGACGTCTGGAATTCCGGCTTTGTACTGAGCAATGTCAGCGTGCACAACGATGGCGGAGCGGACGTCGACGGCTGGCAGGTTTCACTGCAATTCCCCCAGCCCATCCAGCTCACCAATGGCTGGAACGGCGACTTCAGCCTCTCGGGCGATGGCAAAACCCTGACCGTGGCGAATATCGGCTGGAACGGCTACCTCCAGCCGGGGCAATCCACTTCGTTCGGGCTGCAGGGCAGTTACAGCGGTAATTTCCTGATGCCGGAATGCAGCGCCAACTGA，SEQ ID NO.5。 [0061] 该纤维素酶的氨基酸序列如下所示： [0062] MIFGAGAQAVEPLTVNGNRILAGGEVRSLAGPSFFWSNTGWGAERFYNESAVRWVKNDWNATIVRASLGVDGEGGYLEDPAGNKSRVVELVEAAIANDLYVIIDWHSHHAEDHPAEAVAFFEEMARNYGHHDNVIYEIYNEPLQISWSNTIKPYAETVISAIRAIDPDNLIVVGTPTWSQDVDTASWDPIQGHANIAYTLHFYAGTHTQYLRDKARTALNNGIALFVTEWGTVNANGDGGVAQDETQRWMDFLEANHISHANWALNDKDEGASALVPGVSATGGWGQSELTESGRLVRDIVRGWDGGGSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSGGSGALSCDPGNADVWNSGFVLSNVSVHNDGGADVDGWQVSLQFPQPIQLTNGWNGDFSLSGDGKTLTVANIGWNGYLQPGQSTSFGLQGSYSGNFLMPECSAN，SEQ ID NO.6。 [0063] 纤维素酶基因成功克隆到pSHY211 C‑His(带有6个His标签的pSHY211载体)中作为His‑tag的融合蛋白，并通过测序进一步证实。重组纤维素酶C5‑CEL4能分泌到胞外，胞外活性监测情况表明，C5‑CEL4的最佳发酵产酶时间为37℃，36h，酶的比活力达0.886U/mL(图1A)。采用Ni‑NTA镍柱分别纯化其胞内粗酶液和胞外粗酶液，纯化后的胞内和胞外蛋白均在 12％SDS‑PAGE上对蛋白Marker显示一条33KDa条带，如图2所示。实际蛋白分子大小与理论分子大小(47.54KDa)相差较大，通过分析测序的序列，蛋白序列的N端具有His标签，C端无His标签且没有终止密码子。因此，选择C端进行蛋白测序分析。 [0064] 基于LC‑MS/MS的蛋白C端测序分析表明C5‑CEL4蛋白的C端序列为IVRGWDGGGSSSSSS，SEQ ID NO.7，C端终止于蛋白序列的第314位氨基酸(图3)。因此，表达目的蛋白的理论大小为34.12KDa，理论pI 4.69。氨基酸序列的提前终止导致表达蛋白变小，实际蛋白分子质量与理论蛋白分子质量(34.12KDa)符合，说明已成功表达且纯化到目的蛋白。通过酶谱法检测到纤维素酶活性，其中阳性活性表现为红色背景上的清晰条带(图2)。由于氨基酸序列被切割或表达中提前终止，导致C5‑CEL4缺失C端氨基酸残基315至448，包含CBM结构域，通过设计引物扩增C5‑CEL4的催化结构域(C5‑CEL4‑GH5)，并比较两者活性差异。结果表明，C5‑CEL4和C5‑CEL4‑GH5胞内活性差异不大，但胞外活性差异较大，C5‑CEL4‑GH5胞外活性极低，可能是由于C5‑CEL4氨基酸序列缺少部分与在大肠杆菌中的胞外分泌相关(图1B)。 [0065] 大肠杆菌中表达纤维素酶基因c5‑cel4核苷酸序列(1347bp)，如，SEQ ID NO.5所示。 [0066] 大肠杆菌中表达纤维素酶基因c5‑cel4‑gh5核苷酸序列(945bp)，如下所示： [0067] ATGATATTCGGCGCAGGTGCCCAGGCGGTGGAGCCGTTGACCGTCAATGGCAACCGGATACTGGCCGGTGGTGAAGTGCGCAGCCTGGCCGGGCCCAGCTTCTTCTGGAGCAACACCGGCTGGGGCGCCGAGCGTTTCTACAACGAAAGCGCGGTGCGCTGGGTCAAGAACGACTGGAACGCCACCATCGTGCGCGCCTCCCTGGGTGTGGACGGAGAGGGCGGCTACCTGGAAGACCCGGCCGGCAACAAGAGCCGGGTGGTCGAACTGGTGGAGGCAGCCATTGCCAACGACCTCTACGTGATCATCGACTGGCACTCCCACCACGCCGAGGACCACCCCGCCGAAGCGGTAGCGTTTTTTGAGGAAATGGCCCGCAACTACGGTCATCACGACAACGTCATCTACGAAATCTACAACGAGCCATTACAGATTTCCTGGAGCAACACCATCAAGCCTTATGCGGAGACGGTCATTTCCGCCATCCGCGCCATCGATCCGGACAACCTGATCGTGGTGGGCACACCCACCTGGTCCCAGGACGTGGACACCGCCTCCTGGGACCCGATCCAGGGACACGCCAATATCGCCTACACCCTGCACTTCTACGCCGGCACCCATACGCAATACCTGCGCGACAAGGCGCGGACCGCATTGAACAACGGCATCGCGCTGTTCGTCACCGAGTGGGGTACCGTCAACGCCAACGGCGACGGCGGTGTCGCCCAGGATGAAACCCAGCGCTGGATGGACTTCCTCGAAGCCAACCATATCAGCCACGCAAACTGGGCACTGAACGACAAGGACGAGGGCGCCTCCGCCCTGGTGCCTGGCGTCAGCGCCACCGGCGGCTGGGGGCAGAGCGAACTGACCGAATCCGGCCGGCTGGTGCGGGATATAGTGCGGGGCTGGGATGGAGGCGGTTCCTCTTCGAGCTCCAGCTGA，SEQ ID NO.8。 [0068] 大肠杆菌中表达纤维素酶C5‑CEL4‑GH5氨基酸序列(314残基)，如下所示： [0069] MIFGAGAQAVEPLTVNGNRILAGGEVRSLAGPSFFWSNTGWGAERFYNESAVRWVKNDWNATIVRASLGVDGEGGYLEDPAGNKSRVVELVEAAIANDLYVIIDWHSHHAEDHPAEAVAFFEEMARNYGHHDNVIYEIYNEPLQISWSNTIKPYAETVISAIRAIDPDNLIVVGTPTWSQDVDTASWDPIQGHANIAYTLHFYAGTHTQYLRDKARTALNNGIALFVTEWGTVNANGDGGVAQDETQRWMDFLEANHISHANWALNDKDEGASALVPGVSATGGWGQSELTESGRLVRDIVRGWDGGGSSSSSS，SEQ ID NO.9。 [0070] 通过在NCBI中进行比对，C5‑CEL4的氨基酸序列与来自Microbulbifer litoralis的纤维素酶相似性为90.97％(所有的序列分析，序列均使用实际表达的氨基酸序列)。如图4所示，氨基酸序列的系统发育分析显示C5‑CEL4属于纤维素酶家族糖基水解酶，与来自Microbulbifer halophilus的纤维素酶(GenBank:WP 265722981.1)聚在一支，支持率为 85％，Microbulbifer halophilus是一种中等嗜盐细菌。 [0071] 在PDB数据库中该蛋白与来自Cellvibriojaponicus的两个GH5家族内切葡聚糖酶(PDB:8BQA、8BQC)相似性为70％。多序列比对结果表明，C5‑CEL4与GH5家族纤维素酶8BQA、8BQC、8C10、4M1R，和内切葡聚糖酶1EGZ同源性较高(图5)。 [0072] 进一步的蛋白质序列分析显示，C5‑CEL4包含一个纤维素酶催化结构域(CD)，属于GH5家族纤维素酶(图6A)。通过SWISS‑MODEL同源建模，该蛋白与来自Microbulbifer rhizosphaerae的GH5家族内切葡聚糖酶的GMQE值最高为0.94。C5‑CEL4具有高度保守的整体结构，即一个典型的(β/α)8TIM桶状折叠，在催化裂口周围有8个环(图6B)。这个结构折叠为环提供了丰富的变异自由度，使得蛋白质具有催化多样性，包括底物的特异性、热稳定性和pH稳定性等。 [0073] 2.2温度和pH对C5‑CEL4的影响 [0074] C5‑CEL4胞内纯酶及胞外纯酶活性的最佳反应温度均为50℃，在35～60℃时，活性均保持在80％以上(图7A)。C5‑CEL4胞内纯酶及胞外纯酶活性的最佳pH均为7.0，超过70％的最大活性保持在pH 6.0和8.0之间(图7B)。热稳定性分析表明C5‑CEL4在40℃下热处理2h后仍保持100％的活性，在50℃下热处理2h后仍保持74％的活性，其在55℃和60℃下的半衰期为70min(图7C)。pH稳定性分析表明，在pH 3.0～13.0范围内，其活性保持在初始活性的50％以上，纯酶液在4℃孵育12h和24h后，其活性在pH 4.0～12.0范围内保持80％以上(图 7D)。 [0075] 2.3盐和离子液对C5‑CEL4的影响 [0076] 如图8A所示，C5‑CEL4活性的最佳反应NaCl浓度为2.5～3.0M，且在5M的近饱和盐浓度中活性仍保持在100％以上。盐度耐受分析表明，C5‑CEL4在4℃不同盐浓度下处理9个月后，在0.5M～5.0M浓度的NaCl中仍保持约100％以上活性(图8B)。在反应混合物中加入1mM/10mM NaCl、NaNO3和Na2SO3时，C5‑CEL4的活性仍保持在100％附近，说明加入不同钠盐的阴离子对C5‑CEL4活性的影响不明显(表1)。在1％～10％的EMIM‑Cl离子液中C5‑CEL4的活性显著提高到初始活性的110％以上(图8C)，在三种浓度为20％的离子液中，它保留了超过60％的相对活性。此外，在三种浓度40％的离子液中孵育24h后，C5‑CEL4的残留活性高达约90％以上，甚至略有激活(图8D)。这些结果表明C5‑CEL4是一种耐盐和耐离子液体的纤维素酶。 [0077] 如图9所示，蛋白质表面酸性氨基酸分布较高，使得整体静电电位为负，有利于酶表面疏水性减弱或亲水性增强，提高酶的水结合能力，防止酶在高盐溶液中的聚集。 [0078] 2.4金属离子和化学试剂对C5‑CEL4的影响 [0079] 如表1所示，C5‑CEL4活性能够被1mM的Co2+(114.4±1.1％)、1mM的Mn2+(135.6±2+ + 2+ 3+ 2+ 2+ 2+ + 8.7％)、10mM的Mn (212.4±0.4％)激活，在1mM和10mM的K、Mg 、Fe 、Ca 、Zn 、Cu 、Ag 、 2+ 2+ 2+ 2+ Ni 中轻度失活，在10mM的Pb 中丧失约9％的相对活性。Co 增加了约14％的相对活性，Mn强烈激活酶活性(提高约2.1倍)。0.1％的抑制剂EDTA、PMSF、DTT对C5‑CEL4影响不明显，但浓度升高至1.0％时，酶在EDTA和PMSF中轻度失活。0.1％的Tween80使酶增加了约37％的相对活性，浓度升高至1％时仍略有激活。0.1％/1.0％的SDS和CTAB对其活性有轻微抑制。1％和10％的甲醇、乙醇、异丙醇不影响酶活性。在1％的β‑ME中仍保持76％的相对活性，但浓度增加至10％时，酶直接失活。 [0080] 表1不同离子及化学试剂对胞内酶C5‑CEL4活性的影响 [0081] [0082] [0083] 注：实验数据进行显著性分析(p>0.05为不显著，0.05>p>0.01为显著标记为，p<0.01为极显著标记为*)，100％＝19.6±3.47U/mg。 [0084] 2.5C5‑CEL4底物特异性及动力学分析 [0085] C5‑CEL4的底物特异性见表2。胞外酶C5‑CEL4对CMC‑Na(24.36±0.23U/mg)、甘蔗渣木聚糖(13.24±0.61U/mg)、山毛榉木聚糖(14.06±0.53U/mg)有活性，但对玉米芯木聚糖、微晶纤维素和纤维二糖无活性。同样，胞内酶C5‑CEL4对CMC‑Na(19.60±3.47U/mg)、甘蔗渣木聚糖(2.50±0.77U/mg)、山毛榉木聚糖(1.48±2.01U/mg)有活性，但对玉米芯木聚糖、微晶纤维素和纤维二糖无活性。 [0086] 胞外酶C5‑CEL4对CMC‑Na的Km、Vmax和Kcat分别为45.03mg/mL、158.73μmol/min/‑1mg和98.20S ，对甘蔗渣木聚糖的Km、Vmax和Kcat分别为16.05mg/mL、15.55μmol/min/mg和‑1 12.32S 。胞内重组酶C5‑CEL4对CMC‑Na的Km、Vmax和Kcat分别为101.71mg/mL、357.14μmol/‑1 min/mg和220.95S (见表3)。 [0087] 表2C5‑CEL4的底物特异性 [0088] [0089] 表3C5‑CEL4的动力学参数 [0090] [0091] [0092] 2.6C5‑CEL4水解CMC‑Na的薄层色谱(TLC)分析 [0093] 如图10所示，用C5‑CEL4对CMC‑Na的水解产物进行TLC分析。结果表明，C5‑CE L4随机切割纤维素低聚糖链，水解产生纤维三糖(G3)。 [0094] 3结论 [0095] 本发明从新疆艾比盐湖底泥宏基因组中获得一个新的纤维素酶基因c5‑cel4，对其进行克隆，并在大肠杆菌中异源表达。C5‑CEL4的蛋白结构分析表明，蛋白质表面酸性氨基酸的丰富分布导致整体静电电位呈现负值，这有助于增强酶表面的亲水性，提升酶的水结合能力，使得该酶具有耐盐特性。酶学性质表明C5‑CEL4对CMC‑Na和甘蔗渣木聚糖都具有水解活性，是一个多功能纤维素酶，且具有耐热、耐碱、耐盐和离子液高耐受性的特性。此外，该酶能耐受大多数金属离子、抑制剂和醇类。这预示着C5‑CEL4是生物质转化、洗涤和纺织工业生产的理想候选酶，在饲料、食品和生物能源中具有巨大潜在的应用前景。 [0096] 本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。 [0097] 对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

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