[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗菌肽及其制备方法和应用。

[0002] 公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技
术。

[0003] 抗生素是能够抑制或杀死病原微生物重要的药物。但是，随着抗生素的广泛使用，病原微生物对传统抗生素的耐药性已经成为越来越严重的问题。抗菌肽具有杀菌快速、抗
菌谱广、毒副作用小、无免疫原性等优点。并且，由于其特殊的杀菌机理，被抑制或杀灭的病
原性微生物不会产生抗性菌株，不会由于耐药性而减弱杀灭细菌的作用。因此，抗菌肽药物
成为了抗生素的理想替代品，受到了医疗界的众多关注。

[0004] 尽管抗菌肽具有较高的医药健康功效和经济价值，但其现有的发掘和生产技术方法均存在一些问题，如抗菌肽发掘方法周期长、研发成本高；自然界现存多肽的提取分离通
常工艺繁琐、过程繁琐、含量偏低、价格昂贵，不适合进行规模化生产。

[0005] 此外，天然抗菌肽还存在诸多局限性，如：（1）抗菌活性较传统抗菌剂低，作为抗菌剂使用需要剂量大，应用成本高；（2）抗菌活性与肽链长度正相关，抗菌活性强的抗菌肽肽
链较长，合成成本和免疫原性亦较高；（3）导致真核细胞溶血性破坏；（4）体内易降解；（5）序
列排列有限，而具有序列多样性的多肽分子构成了一个近乎无限的潜在药物储藏库。

[0006] 为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种抗菌肽及其制备方法和应用。本发明的抗菌肽由14个氨基酸组成，肽链较短，制备方法和技术成熟，合成成本低。

[0007] 为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：第一方面，本发明提供了一种抗菌肽，所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、
SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ 
ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13所示，
SEQ ID NO.2中第14位的亮氨酸为D构型，SEQ ID NO.3中第1位和第5位的赖氨酸为D构型，
SEQ ID NO.9中第12位和第13位的赖氨酸为D构型，SEQ ID NO.10中第3位的赖氨酸为D构
型，SEQ ID NO.11中所有氨基酸均为D构型。

[0008] 抗菌肽具体名称及序列如下：QLX‑227‑1：氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
QLX‑227‑2：氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，第14位的亮氨酸（L）为D构型；
QLX‑227‑3：氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，第1位和第5位的赖氨酸（K）为D构型；
QLX‑227‑4：氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
QLX‑227‑5：氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
QLX‑227‑6：氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
QLX‑227‑7：氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；
QLX‑227‑8：氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；
QLX‑227‑9：氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，第12位和第13位的赖氨酸（K）为D构
型；
QLX‑227‑10：氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，第3位的赖氨酸（K）为D构型；
QLX‑227‑11：氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，所有氨基酸均为D构型；
QLX‑227‑12：氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；
QLX‑227‑13：氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。

[0009] 第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的抗菌肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
使用多肽合成仪采用固相合成法合成多肽，使用反相高效液相色谱进行纯化，得
到所述抗菌肽。

[0010] 第三方面，本发明提供了如第一方面所述的抗菌肽在制备抗革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌的药物中的应用。

[0011] 优选地，所述革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌或粪肠球菌。

[0012] 优选地，所述革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和鼠伤寒沙门氏菌中的至少一种。

[0013] 优选地，所述药物包括如第一方面所述的抗菌肽和至少一种医药上可接受的载体和/或添加剂。

[0014] 优选地，所述药物为内用药物或外用药物；所述内用药物为口服制剂或注射剂；所述外用药物包括贴剂及涂抹制剂。

[0015] 第四方面，本发明提供了如第一方面所述的抗菌肽在制备抗菌产品中的应用，所述抗菌产品包括消毒剂、洗涤剂、防腐剂和饲料添加剂中的至少一种。

[0016] 上述本发明的一种或多种技术方案取得的有益效果如下：(1)本发明的抗菌肽源自计算机高通量筛选，引入预设的功能属性信息，能够生成
具有特定属性的抗菌肽，且生成的抗菌肽区别于自然界中现存的抗菌肽，弥补了天然抗菌
肽氨基酸序列排列有限的缺陷。

[0017] (2)在计算机高通量筛选结果的基础上对抗菌肽序列进行D型氨基酸替换改造，以得到具有安全性更好的抗菌肽。

[0018] (3)经过体外和体内抗菌性能、溶血毒性及细胞毒性的严格检测筛选而来，具有对革兰氏阳性多重耐药菌和/或革兰氏阴性多重耐药菌的广谱抗菌活性，安全性较好。

[0019] (3)抗菌肽由14个氨基酸组成，肽链较短，制备方法和技术成熟，合成成本低。附图说明

[0020] 构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

[0021] 图1为本发明抗菌肽QLX‑227‑1的质谱检测图；图2为本发明抗菌肽QLX‑227‑1在PBS中的圆二色光谱，其中Helix代表螺旋，
Antiparallel&Parallel代表折叠，Beta‑turn代表转角，Randomcoil代表不规则卷曲；
图3为本发明抗菌肽QLX‑227‑1在50%TFE中的圆二色光谱，其中Helix代表螺旋，
Antiparallel&Parallel代表折叠，Beta‑turn代表转角，Randomcoil代表不规则卷曲；
图4为本发明抗菌肽QLX‑227‑2的质谱检测图；
图5为本发明抗菌肽QLX‑227‑3的质谱检测图；
图6为本发明抗菌肽QLX‑227‑4的质谱检测图；
图7为本发明抗菌肽QLX‑227‑5的质谱检测图；
图8为本发明抗菌肽QLX‑227‑6的质谱检测图；
图9为本发明抗菌肽QLX‑227‑7的质谱检测图；
图10为本发明抗菌肽QLX‑227‑8的质谱检测图；
图11为本发明抗菌肽QLX‑227‑9的质谱检测图；
图12为本发明抗菌肽QLX‑227‑10的质谱检测图；
图13为本发明抗菌肽QLX‑227‑11的质谱检测图；
图14为本发明抗菌肽QLX‑227‑12的质谱检测图；
图15为本发明抗菌肽QLX‑227‑13的质谱检测图；
图16为本发明抗菌肽QLX‑227‑1的溶血活性实验结果图；
图17为本发明抗菌肽QLX‑227‑2的溶血活性实验结果图；
图18为本发明抗菌肽QLX‑227‑3的溶血活性实验结果图；
图19为本发明抗菌肽QLX‑227‑4的溶血活性实验结果图；
图20为本发明抗菌肽QLX‑227‑5的溶血活性实验结果图；
图21为本发明抗菌肽QLX‑227‑6的溶血活性实验结果图；
图22为本发明抗菌肽QLX‑227‑7的溶血活性实验结果图；
图23为本发明抗菌肽QLX‑227‑8的溶血活性实验结果图；
图24为本发明抗菌肽QLX‑227‑9的溶血活性实验结果图；
图25为本发明抗菌肽QLX‑227‑10的溶血活性实验结果图；
图26为本发明抗菌肽QLX‑227‑11的溶血活性实验结果图；
图27为本发明抗菌肽QLX‑227‑12的溶血活性实验结果图；
图28为本发明抗菌肽QLX‑227‑13的溶血活性实验结果图；
图29为本发明抗菌肽QLX‑227‑1的细胞毒性实验结果图；
图30为本发明抗菌肽QLX‑227‑1对小鼠皮肤细菌感染的治疗结果图，其中a为对G+
金黄色葡萄球菌CMCC26003感染的治疗结果图，b为对G‑鲍曼不动杆菌ATCC19606感染的治
疗结果图。

[0022] 为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。

[0023] 本发明实施例中使用的材料如细菌、细胞、小鼠等均可购买得到，购买途径如下。

[0024] MH肉汤培养基（液体）：青岛海博生物hopebio，HB6231。

[0025] NB营养肉汤培养基（液体）：青岛海博生物hopebio，HB0108。

[0026] 大肠杆菌CMCC44102：青岛海博生物hopebio，HBJZ069。

[0027] 金黄色葡萄球菌CICC25138、粪肠球菌CICC24243、肺炎克雷伯菌ATCC BAA‑1705、鲍曼不动杆菌ATCC19606、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028：中国工业微生物菌种保藏管理中心
（CICC）。

[0028] 铜绿假单胞菌PAO1：宁波明舟生物科技有限公司 NingboMingZhoubioCO.,Ltd, BMZ114547。

[0029] G+金黄色葡萄球菌CMCC26003：青岛海博生物hopebio，HBJZ061。

[0030] HEK‑293T人胚肾细胞：赛维尔生物, STCC10301G‑1。

[0031] 小鼠：北京维通利华实验动物技术有限公司。

[0032] 实施例1抗菌肽QLX‑227‑1的合成选用固相有机合成，采用Fmoc保护合成法，合成方向从C
端到N端逐一进行，具体步骤如下：
1.选择改性树脂开始合成多肽，在反应器中加入pip/DMF，振荡反应器一些时间。

[0033] 2.过滤除去溶剂，向体系加满DMF，振荡反应器1 min，过滤除去液体；该操作进行三次。

[0034] 3.取少量检测试剂A和B和一点树脂加入到检测管中，将检测管放入100 ℃环境下20 s，查看树脂是否有颜色变化，如果颜色改变，则表示Fmoc脱除成功。

[0035] 4.将配置好的氨基酸溶液加入到反应器中，并将其记录在记录表中，加入1 mL DIC/DMF溶液，反应器振荡一些时间。

[0036] 5.操作如3，如果颜色没有发生变化，表示偶联成功。

[0037] 6.重复操作2，对树脂进行洗涤。

[0038] 7.在反应器中加入pip/DMF，震荡反应器一些时间。

[0039] 8.重复操作2，对树脂进行洗涤。

[0040] 9.重复以上操作3‑8，加入相应的氨基酸至多肽合成完毕。

[0041] 对得到的粗品进行分析确定目标肽的保留时间，并记录在表单上。根据多肽的疏水度和pI来确定多肽的溶解方法，并溶解多肽。溶液经0.45 um有机滤膜过滤到50 mL离心
管中。根据多肽的量、纯度和等电点来决定多肽的制备方法，将溶液注射到仪器中，根据
HPLC和纯度来收集馏分，并通过MS和HPLC进行分析是否合格。收集合格的馏分进行冻干，抗
菌肽QLX‑227‑1得到冻干粉。

[0042] 抗菌肽QLX‑227‑1的质谱如图1所示，质谱图中显示的分子量与理论分子量一致。

[0043] α‑螺旋卷曲螺旋和反平行β‑折叠是抗菌肽中最常见的结构，两亲性的α肽通常比二级结构不明确的肽更有活性，增加α‑螺旋含量与提高抗菌活性相关。β‑折叠抗菌肽包含
稳定结构的二硫键，并帮助抗菌肽穿过细胞膜。为了测定肽的α‑螺旋，利用圆二色谱（CD）监
测了抗菌肽分子在水性环境(PBS)和模拟细胞膜疏水环境(50% TFE)中的二级结构。抗菌肽
QLX‑227‑1的二级结构测算值分析图表分别如图2和图3所示。可以看到，水性环境(PBS)和
模拟细胞膜疏水环境(50% TFE)中抗菌肽QLX‑227‑1在190‑260nm处α‑螺旋结构分别占6.4%
和8.1%，β‑折叠结构分别占17.0%和18.9%。

[0044] 以上述合成方法合成抗菌肽QLX‑227‑2至QLX‑227‑13。抗菌肽QLX‑227‑2至QLX‑227‑13的质谱分别如图4至图15所示，质谱图中显示的分子量与理论分子量一致。

[0045] 实施例2 抗菌肽的抑菌活性测定采用美国临床实验室标准化研究所(CLSI)推荐的测定最小抑菌浓度(MIC)的方
法，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。具体步骤如下:
(1)菌体的准备:取冻存于‑20 ℃的待测菌，划线接种于NB营养肉汤培养基中孵
育。挑取单菌落，接种于10 mLNB营养肉汤培养基中，37 ℃、200 rpm过夜培养。然后再将过
夜菌体接种于新鲜的培养基中，培养1 2 h，直至菌体处于对数生长期，使其OD600=0.4，用
~
6
MH肉汤培养基将所得菌液的菌落数调整为大约10CFU/mL左右。

[0046] (2)肽的准备:将抗菌肽的浓度调整为512 ug/mL，吸取100 uL加入到96孔板的第1列孔内其它孔中加入50 uL MH肉汤培养基，然后将第1号孔中的多肽溶液吸出50 uL加入第
2号孔内，依次类推倍比稀释至第10号孔，吸出50 uL弃去。

[0047] (3)接种菌:用加样枪取步骤(1)调整好的50 uL菌液依次加到96孔板的前11列孔5
中，最终接种细菌浓度为每孔5X10 CFU/mL。将96孔板置微型振荡器上振荡1 min，使各孔内
液体混匀，微孔板加盖以减少孵育过程中的蒸发，并于37 ℃下孵育18 h。其中设定阳性对
照组为第11孔:即只加50 uL MH肉汤培养基和50 uL菌液；阴性对照为第12孔无菌对照组:
即只加100 uL MH肉汤培养基。上述设置使从第1孔到第10孔的抗菌肽浓度将依次递减。

[0048] (4)结果判断:无菌对照孔在整个试验过程中应始终保持清亮，表明整个试验是无菌操作。与生长对照孔中细菌生长特性(如微孔内肉汤呈混浊状、孔底出现沉淀等)相比较
进行判断，无肉眼可见生长的最低浓度为测定肽对检测菌的MIC值。

[0049] 抗菌肽抑菌活性测定结果如表1和表2所示，可以看出本发明的抗菌肽QLX‑227‑1至QLX‑227‑13均具有的抑制多重耐药革兰氏阳性和阴性菌生长的能力。

[0050] 表1 抗菌肽的最小抑革兰氏阳性多重耐药菌浓度表，单位μg/mL金黄色葡萄球菌CICC25138 粪肠球菌CICC24243
QLX‑227‑1 64 128
QLX‑227‑2 128 128
QLX‑227‑3 64 256
QLX‑227‑4 64 256
QLX‑227‑5 32 128
QLX‑227‑6 64 128
QLX‑227‑7 32 64
QLX‑227‑8 16 256
QLX‑227‑9 128 256
QLX‑227‑10 128 256
QLX‑227‑11 32 256
QLX‑227‑12 32 256
QLX‑227‑13 16 256
表2 抗菌肽的最小抑革兰氏阴性多重耐药菌浓度表，单位μg/mL
大肠杆菌CMCC44102（非耐） 肺炎克雷伯菌ATCC BAA‑1705 鲍曼不动杆菌ATCC19606 鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028 铜绿假单胞菌PAO1QLX‑227‑1 16 32 16 32 128
QLX‑227‑2 32 256 32 64 256
QLX‑227‑3 32 64 16 32 128
QLX‑227‑4 16 32 32 32 64
QLX‑227‑5 8 32 16 32 16
QLX‑227‑6 4 8 4 16 16
QLX‑227‑7 16 32 16 16 16
QLX‑227‑8 8 16 16 8 32
QLX‑227‑9 16 64 32 64 64
QLX‑227‑10 8 16 8 32 64
QLX‑227‑11 32 16 8 16 32
QLX‑227‑12 16 8 16 16 32
QLX‑227‑13 8 8 16 8 16
实施例3 抗菌肽的溶血活性
对于抗菌肽溶血活性的测定。以抗菌肽QLX‑227‑1为例，其余抗菌肽的溶血活性仅
需更改抗菌肽种类，具体试验步骤如下:
(1)使用肝素钠抗凝管采集新鲜的人血液1 mL，4 ℃保存备用；
(2)将1000 g上述的血液离心5 min，弃除上清，收集红细胞；
(3)将收集到的红细胞用PBS缓冲溶液洗涤三遍，在1000 g条件下离心5 min，弃上
清，收集红细胞，最后用约10 mL左右的PBS缓冲溶液重悬细胞，得到8%（V/V）红细胞悬液备
用；
(4)抗菌肽的稀释:向排列好的每排12个EP管的第1号管内加入90 uL PBS缓冲溶
液其余管中都加入50 uL PBS缓冲溶液，再向第1号管内加入10 uL抗菌肽QLX‑227‑1母液
（浓度为2048 ug/mL），然后将第1号管中的抗菌肽QLX‑227‑1溶液混匀吸出50 uL，加到第2
号管内，依次倍比稀释至第10号后，吸出50 uL弃去；
(5)取50uL上述准备好的红细胞悬液分别加入到含有不同浓度抗菌肽QLX‑227‑1
溶液的EP管中，在37 ℃培养箱内恒温孵育1 h。其中，第11孔加50 uL PBS和50 uL红细胞悬
液作为阴性对照，第12孔加50 uL 01%Triton X‑100和50 uL红细胞悬液作为阳性对照；
(6)1 h后取出EP管，在4 ℃条件下100 g离心5 min；
(7)吸取上述离心溶液的上清，平行转移到一个洁净的96孔板对应的孔中，用酶标
仪在570 nm(0D570nm)处测定光吸收值。

[0051] 如图16所示，抗菌肽QLX‑227‑1在1024 ug/mL时具有50%溶血活性，远高于其最小抗菌浓度的几何平均值，表明抗菌肽QLX‑227‑1在发挥抗菌作用时不会产生溶血。

[0052] 如图17所示，抗菌肽QLX‑227‑2在256 ug/mL时具有50%溶血活性，远高于其最小抗菌浓度的几何平均值，表明抗菌肽QLX‑227‑2在发挥抗菌作用时不会产生溶血。

[0053] 如图18所示，抗菌肽QLX‑227‑3在2048 ug/mL时具有50%溶血活性，远高于其最小抗菌浓度的几何平均值，表明抗菌肽QLX‑227‑3在发挥抗菌作用时不会产生溶血。

[0054] 如图19所示，抗菌肽QLX‑227‑4在2048 ug/mL时具有35%溶血活性，远高于其最小抗菌浓度的几何平均值，表明抗菌肽QLX‑227‑4在发挥抗菌作用时不会产生溶血。

[0055] 如图20所示，抗菌肽QLX‑227‑5在2048 ug/mL时也不产生溶血活性，表明抗菌肽QLX‑227‑5在发挥抗菌作用时不会产生溶血。

[0056] 如图21所示，抗菌肽QLX‑227‑6在512 ug/mL时具有50%溶血活性，远高于其最小抗菌浓度的几何平均值，表明抗菌肽QLX‑227‑6在发挥抗菌作用时不会产生溶血。

[0057] 如图22所示，抗菌肽QLX‑227‑7在256 ug/mL时具有50%溶血活性，远高于其最小抗菌浓度的几何平均值，表明抗菌肽QLX‑227‑7在发挥抗菌作用时不会产生溶血。

[0058] 如图23所示，抗菌肽QLX‑227‑8在2048 ug/mL时具有30%溶血活性，远高于其最小抗菌浓度的几何平均值，表明抗菌肽QLX‑227‑8在发挥抗菌作用时不会产生溶血。

[0059] 如图24所示，抗菌肽QLX‑227‑9在2024 ug/mL时不具有溶血活性，表明抗菌肽QLX‑227‑9在发挥抗菌作用时不会产生溶血。

[0060] 如图25所示，抗菌肽QLX‑227‑10在2048 ug/mL时具有30%溶血活性，远高于其最小抗菌浓度的几何平均值，表明抗菌肽QLX‑227‑10在发挥抗菌作用时不会产生溶血。

[0061] 如图26所示，抗菌肽QLX‑227‑11在2048 ug/mL时具有40%溶血活性，远高于其最小抗菌浓度的几何平均值，表明抗菌肽QLX‑227‑11在发挥抗菌作用时不会产生溶血。

[0062] 如图27所示，抗菌肽QLX‑227‑12在2048 ug/mL时具有5%溶血活性，远高于其最小抗菌浓度的几何平均值，表明抗菌肽QLX‑227‑11在发挥抗菌作用时不会产生溶血。

[0063] 如图28所示，抗菌肽QLX‑227‑13在2048 ug/mL时具有15%溶血活性，远高于其最小抗菌浓度的几何平均值，表明抗菌肽QLX‑227‑11在发挥抗菌作用时不会产生溶血。

[0064] 实施例4 抗菌肽的细胞毒性HEK‑293T人胚肾细胞用于检测抗菌肽的细胞毒性。将细胞按每孔8000个细胞接种
96孔板中。将细胞在37 ℃、5% CO2下孵育24小时。然后将抗菌肽QLX‑227‑2或QLX‑227‑1添
加到每个含有细胞的孔中。孵育24小时后，每孔加入10 uL CCK8，并在37 ℃下孵育2小时。
然后检测450nm处的吸光度值，并使用Prism 8按照曲线拟合并应用以下方程确定细胞存活
率值：
细胞存活率=（实验组‑空白对照）/（阴性对照组‑空白对照）×100%
空白对照为仅含CCK8的培养基，阴性对照组为不加入抗菌肽的细胞。

[0065] 如图29所示，抗菌QLX‑227‑1发挥50%细胞毒性的浓度在256 ug/mL以上，高于其最小抗菌浓度的几何平均值，表明抗菌肽QLX‑227‑1在发挥抗菌作用时不会产生细胞毒性。

[0066] 实施例5 抗菌肽的皮肤外用抗感染能力对于抗菌肽的皮肤外用抗感染能力测定，具体试验步骤如下：
8
G+金黄色葡萄球菌CMCC26003和G‑鲍曼不动杆菌ATCC19606菌液稀释至10CFU/mL
备用。雌性C57BL/6小鼠按体重随机分组，分为感染阴性对照组和抗菌肽治疗组，每组6只。
将小鼠背部脱毛后，用组织活检器在小鼠背部中心取下两块直径为5 mm的全层皮肤，各组
小鼠伤口面积大小均一即构建模型成功。在每只小鼠的两个伤口上注射5 uL浓度为
8
10CFU/mL的菌液。6 h后治疗组给予0.3 mg抗菌肽QLX‑227‑1治疗。造模24 h时无菌取动物
感染部位的皮肤，检测活菌并计数。如图30所示，抗菌肽QLX‑227‑1对小鼠皮肤G+和G‑细菌
感染有清除能力。

[0067] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修
改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。