[0001] 本发明属于酶工程技术领域，具体地说，本发明涉及一种海洋杆菌脂肪酶MNL及其编码基因的应用。

[0002] 洗涤剂领域是脂肪酶工业应用的一个十分重要的领域。洗涤环境通常是低温的、碱性的，所以要求洗涤剂领域应用的脂肪酶在低温和碱性下具备良好的活性和稳定性。

[0003] 通常的洗涤剂配方中都含有大量的阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂，有时也会添加一定量的阳离子表面活性剂、抗再沉积剂以及漂白强化剂等。因此洗涤剂领域应用的脂肪酶，要求能够具有优良的表面活性剂稳定性且反应活性不受这些表面活性剂的影响。

[0004] 海洋生态系统拥有着丰富的酶资源，但是在工业应用方面尚未得到广泛的开发。海洋生态系统的恶劣使海洋来源的酶进化出了耐低温的特性。一些耐低温的脂肪酶(E.C.3.1.1.3)能够在0～30℃催化甘油三酯水解，生成的产物包括脂肪酸和甘油。像这类低温的、碱性的脂肪酶具备着清洗油污的潜力，这使得它在洗涤剂领域中具有良好的应用价值。

[0005] 当前的衣物洗涤剂和/或织物护理组合物包括诸如表面活性剂、酶(蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和/或纤维素酶)、漂白剂、助洗剂系统等，其中脂肪酶在洗涤剂中的商业化应用还不够广泛。

[0006] 基于此，本发明的目的在于提供海洋杆菌脂肪酶MNL及其编码基因的应用。

[0007] 实现上述发明目的的具体技术方案包括如下。

[0008] 本发明的第一方面，提供了一种海洋杆菌脂肪酶MNL在去除油污或制备洗涤用品中的应用，所述海洋杆菌脂肪酶MNL的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0009] 本发明的第二方面，提供了一种海洋杆菌脂肪酶MNL的编码基因在去除油污或制备洗涤用品中的应用，所述海洋杆菌脂肪酶MNL的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0010] 本发明的第三方面，提供了一种插入有海洋杆菌脂肪酶MNL的编码基因的重组表达载体在去除油污或制备洗涤用品中的应用，所述海洋杆菌脂肪酶MNL的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0011] 本发明的第四方面，提供了一种工程菌在去除油污或制备洗涤用品中的应用，所述工程菌转化有重组表达载体，所述重组表达载体为插入有海洋杆菌脂肪酶MNL的编码基因的表达载体，所述海洋杆菌脂肪酶MNL的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0012] 本发明的第五方面，提供了一种洗涤剂，其包括海洋杆菌脂肪酶MNL，所述海洋杆菌脂肪酶MNL的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0013] 本发明的第六方面，提供了一种去除油污的方法，包括如下步骤：在洗涤剂中使用海洋杆菌脂肪酶MNL，所述海洋杆菌脂肪酶MNL的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0014] 本发明发现海洋微生物来源的海洋杆菌脂肪酶MNL在低温、碱性条件下具有良好的稳定性，且具有良好的表面活性剂耐受性，去除油污的效果好，与市售洗涤剂复配后效果更佳，可用于洗涤剂产品中，具有广阔的应用前景。附图说明

[0015] 图1为本发明实施例2中海洋杆菌脂肪酶MNL纯度的SDS‑PAGE分析；其中，Lane M，标准分子量标记物；Lane 1，细胞裂解液总量；Lane 2，离心后的细胞裂解液上清；Lane 3，2+
Sephadex G‑25洗脱样品；Lane 4，Ni 亲和层析洗脱样品。

[0016] 图2为本发明实施例3中海洋杆菌脂肪酶MNL在不同温度下的酶活结果。

[0017] 图3为本发明实施例3中海洋杆菌脂肪酶MNL在不同温度下孵育不同时间的酶活结果。

[0018] 图4为本发明实施例4中海洋杆菌脂肪酶MNL在不同pH下的酶活结果。

[0019] 图5为本发明实施例4中海洋杆菌脂肪酶MNL在不同pH下放置0～4d的酶活结果。

[0020] 为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

[0021] 除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

[0022] 在本发明中，发明人意外发现：海洋杆菌脂肪酶MNL在低温、碱性条件下具有良好的稳定性(在其对硬脂酸‑4‑硝基苯酯的水解反应中，在pH8.0～10.0和10～30℃都具有较高的酶活，pH 8.0、20℃的条件下具有最佳酶活性；同时该脂肪酶在低温和碱性条件下具有良好的稳定性，10～30℃处理24小时仍然具有59％的残余酶活，在pH 8.0的条件下处理4天仍然能保持60％的残余酶活)、同时具有良好的表面活性剂耐受性(尤其是处在离子型表面活性剂的环境下会增强其酶活性，在其他的洗涤剂添加剂如抗再沉积剂及漂白强化剂的作用下也具有较好的稳定性，一些表面活性剂对所得的重组表达脂肪酶还具有激活作用，如MES、STPP等，分别能够提升到原始酶活的231％和126％)，具有去除油污的效果，与市售洗涤剂复配后效果更佳(采用国标规定的JB‑04食用油污布进行实验，并使用了市售洗涤剂作为对照，MNL和市售洗涤剂复配使用，去污值为9.18；对洗涤后的污液进行进行酸碱滴定，测量因脂肪酶水解油脂所产生的游离脂肪酸含量，MNL和市售洗涤剂水解产生的脂肪酸含量为176.83mM)，因此，海洋杆菌脂肪酶MNL可用于洗涤剂产品中，具有较好的应用前景。

[0023] 在本发明的其中一些实施例中，公开了一种海洋杆菌脂肪酶MNL在去除油污中的应用，所述海洋杆菌脂肪酶MNL的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0024] 在本发明的另一些实施例中，公开了海洋杆菌脂肪酶MNL的编码基因在去除油污中的应用，所述海洋杆菌脂肪酶MNL的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0025] 海洋杆菌脂肪酶MNL的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)：

[0026] ATGACTCCGGGCGGTGATAGCCTGGCGGCGTACGCGGAAGATGGTCCGTTCGCAACCACCAGCCAGAGCGGCGGCTTCAGCTGCACCATCTACCGTCCGATCAGCCTGCAAGATGATCACCCGGTGATCCTGTGGGGCAACGGCACCGGTGCGAGCCCGTCTACCTACGGCAGCGGCCTGCGCCACTGGGCGAGCTGGGGTTTCGTTGTTGCGGCGGCGAACACCAGCAACGCGGGCTCTGGTGAAGAAATGCTGGATTGCCTGGATTACTTGCAGGGCACCAGCTACGCGGACCAGCTCGATTTCAGCAACGTTGGCGCGAGCGGTCACAGCCAGGGTGGCGGTGGCACCATCATGGCGGCGCGTGATAACCGTATCACCGCGACCGCGCCGGTTCAGCCGTACATCCTGGGCCTGGGTCACGAAACCTCTAGCCAGTACCAGCAGACCGCGCCGATGCTGCTTCTGAGCGGTTCCGTTGATACCCTGGCGGGCCCGACCCTGAACCAGGCTCCGGTTTACCGTCGCGTTGATGTTCCGGTTTTCTGGGCGACCCTGCGTGGTGCAAGCCACTTTGAACCGGTTGGTAATATGGGTGATTTCCGTGGTATTACTACTGCGTGGTGGTTGTACCAACTGACCGGTGACGCTGATGCTGCTGACCTGTTTACTGGTCCGTGCGAAGTGTGTGGTTTATCTGATTGGGATGTTGAACGTAAAGGTCTG

[0027] 海洋杆菌脂肪酶MNL的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)：MTPGGDSLAAYAEDGPFATTSQSGGFSCTIYRPISLQDDHPVILWGNGTGASPSTYGSGLRHWASWGFVVAAANTSNAGSGEEMLDCLDYLQGTSYADQLDFSNVGASGHSQGGGGTIMAARDNRITATAPVQPYILGLGHETSSQYQQTAPMLLLSGSVDTLAGPTLNQAPVYRRVDVPVFWATLRGASHFEPVGNMGDFRGITTAWWLYQLTGDADAADLFTGPCEVCGLSDWDVERKGL

[0028] 在本发明的另一些实施例中，公开了一种海洋杆菌脂肪酶MNL在制备洗涤用品中的应用，所述海洋杆菌脂肪酶MNL的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0029] 在其中一些实施例中，所述洗涤用品为洗涤剂。

[0030] 在本发明的另一些实施例中，公开了海洋杆菌脂肪酶MNL的编码基因在制备洗涤用品中的应用，所述海洋杆菌脂肪酶MNL的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0031] 在其中一些实施例中，所述洗涤用品为洗涤剂。

[0032] 在本发明的另一些实施例中，公开了一种插入有海洋杆菌脂肪酶MNL的编码基因的重组表达载体在去除油污中的应用，所述海洋杆菌脂肪酶MNL的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0033] 在本发明的另一些实施例中，公开了一种工程菌在去除油污中的应用，所述工程菌转化有重组表达载体，所述重组表达载体为插入有海洋杆菌脂肪酶MNL的编码基因的表达载体，所述海洋杆菌脂肪酶MNL的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0034] 在本发明的另一些实施例中，公开了一种去除油污的方法，包括在洗涤剂中使用上述海洋杆菌脂肪酶MNL。

[0035] 在本发明的另一些实施例中，公开了一种洗涤剂，所述洗涤剂包括上述海洋杆菌脂肪酶MNL。

[0036] 在以下实施例中，未做说明的原料均来源于市售。

[0037] 以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。

[0038] 实施例1海洋杆菌脂肪酶MNL大肠杆菌表达载体的构建

[0039] 根据Genbank的海洋杆菌(Marinobacter nanhaiticus)脂肪酶MNL基因(GenBank登录号：WP_051079885.1)，并根据大肠杆菌密码子偏好性对序列进行优化，委托上海生工生物工程公司进行合成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。由上海生工生物工程公司合成pET‑28a‑MNL质粒。

[0040] 将上述质粒转化至大肠杆菌E.coli Top 10感受态细胞，涂布于LB(含100ug/ml Kanamycin)平板，挑取阳性克隆通过基因测序，结果表明获得了pET‑28a‑MNL表达质粒。

[0041] 实施例2海洋杆菌脂肪酶MNL的重组表达及纯化

[0042] 将实施例1构建得到的pET‑28a‑MNL表达质粒热激转至大肠杆菌Shuffle T7感受态细胞(购自上海维地生物技术有限公司)。将转化液涂布于LB(100ug/ml Kanamycin)的平板，37℃培养10小时后，挑取平板上单菌落于5ml LB培养基中37℃培养10小时后，以5％的接种量接入100ml LB培养基中37℃发酵3小时后，以10％的接种量再接入500ml的LB培养基中37℃培养4小时后，将温度降至18℃，添加0.1mM的IPTG，培养18小时后离心得到菌体。

[0043] 用50mM的Tris‑HCl(pH＝8)缓冲液重悬菌体，经超声破碎后得到裂解液，离心取得上清，上清液经过镍柱亲和层析(洗脱缓冲液为含有300mM咪唑的Tris‑HCl缓冲液，pH8.0)、G‑25脱盐柱纯化，得到目标蛋白，利用SDS‑PAGE电泳对纯化的重组蛋白进行纯度鉴定。

[0044] 结果如图1所示，从图1可以看出，经镍柱亲和层析后能够得到单一的电泳条带，分子量约为30kD，表明获得了纯化的海洋杆菌脂肪酶MNL。

[0045] 实施例3海洋杆菌脂肪酶MNL的最适温度及温度稳定性试验

[0046] 1、最适反应温度

[0047] 采用比色法，测定不同温度(5℃～70℃)条件海洋杆菌脂肪酶MNL的酶活。

[0048] 反应体系包括：50mMTris‑HCl缓冲液(pH 8.0)，1mM对硝基苯酚癸酸酯(p‑nitrophenol decanoate，p‑NPd)，10μL酶液。

[0049] 各温度下反应5min，测定405nm处的吸光值OD405，酶活单位为U/mg。所有实验重复三次。

[0050] 结果如图2所示，海洋杆菌脂肪酶MNL在10℃～30℃具有较高的酶活，在20℃时酶活最高，说明海洋杆菌脂肪酶MNL的最适反应温度是20℃。

[0051] 2、温度稳定性

[0052] 首先将海洋杆菌脂肪酶MNL在不同的温度(20℃、30℃)条件下温育，分别在0min、60min、120min、240min、480min、960min、1440min取样，采用比色法测定其剩余酶活。温度对海洋杆菌脂肪酶MNL稳定性的影响用相对酶活表示，测定的最大酶活定为100％。所有实验重复三次。

[0053] 结果如图3所示。结果表明海洋杆菌脂肪酶MNL在20℃～30℃处理24h后，能保持60％以上的脂肪酶酶活力。

[0054] 本实施例的结果表明：海洋杆菌脂肪酶MNL在低温下具有良好的稳定性。

[0055] 实施例4海洋杆菌脂肪酶MNL的最适pH及pH稳定性试验

[0056] 1、最适反应pH

[0057] 采用比色法，测定不同pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0)条件海洋杆菌脂肪酶MNL的酶活。

[0058] 反应体系参考实施例3，其中使用的各种pH溶液为：50mM柠檬酸‑磷酸盐缓冲溶液(pH5.0)，50mM Na2HPO4‑NaH2PO4溶液(pH 6.0，pH 7.0)，50mM Tris‑HCl溶液(pH 8.0，pH 9.0)，50mM甘氨酸‑氢氧化钠缓冲液(pH 10.0，pH 11.0)。

[0059] 各温度下反应5min，测定405nm处的吸光值OD405，酶活单位为U/mg。所有实验重复三次。测定的最大酶活定为100％。

[0060] 结果如图4所示，海洋杆菌脂肪酶MNL在pH 8～10具有较高的酶活，在pH 8时酶活最高，说明海洋杆菌脂肪酶MNL的最适反应pH是8。

[0061] 2、pH稳定性

[0062] 将海洋杆菌脂肪酶MNL在不同的pH(6.0、7.0、8.0、9.0、10)条件下放置0～4d，采用比色法测定其剩余酶活，反应体系和酶活测定方法同上。pH对海洋杆菌脂肪酶MNL稳定性的影响用相对酶活表示，测定的最大酶活定为100％。所有实验重复三次。

[0063] 结果如图5所示。结果表明海洋杆菌脂肪酶MNL在pH 8～10处理4d后，能保持50％以上的脂肪酶酶活力，在pH 7的条件下处理4d后也能保持接近30％的酶活力。

[0064] 本实施例的结果表明：海洋杆菌脂肪酶MNL在碱性条件下具有良好的稳定性。

[0065] 实施例5表面活性剂对海洋杆菌脂肪酶MNL酶活的影响

[0066] 将海洋杆菌脂肪酶MNL在表1所示的不同浓度的不同表面活性剂(包括离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂等)中，20℃、pH8的条件下孵育1h，测定海洋杆菌脂肪酶MNL对C10底物水解的残余活性，反应体系和酶活测定方法同实施例3。

[0067] 不同表面活性剂对海洋杆菌脂肪酶MNL酶活的影响用相对酶活表示，以没有加任何表面活性剂的实验组测定的酶活为100％。所有实验重复三次。结果如表1所示。

[0068] 表1

[0069]

[0070]

[0071] 表1结果表明，海洋杆菌脂肪酶MNL具有良好的离子型表面活性剂耐受性，处在离子型表面活性剂的环境下会增强其酶活性，在其他的洗涤剂添加剂如抗再沉积剂及漂白强化剂的作用下也具有较好的稳定性；一些表面活性剂对海洋杆菌脂肪酶MNL还具有激活作用，如MES、STPP等，分别在1mM和10mM时能够提升到原始酶活的231％和126％。

[0072] 实施例6海洋杆菌脂肪酶MNL对JB‑04食用油污布的去污效果评价

[0073] 包括以下步骤：

[0074] (1)、将污布试片(JB‑04)在已经校正过的白度计(JJG 512)下进行测量，得到洗前白度值F1；

[0075] (2)、在五个烧杯中分别加入500ml自来水、500ml自来水+商业化洗涤剂(洗衣凝珠，偶爱你品牌)(0.4％)、500ml自来水+海洋杆菌脂肪酶MNL(4mg)、500ml自来水+商业化洗涤剂(0.2％)+海洋杆菌脂肪酶MNL(2mg)和500ml自来水+商业化洗涤剂(0.2％)+诺维信脂肪酶Lipoclean(2mg)，将(1)中的试片完全浸入，将温度控制在30℃±2℃，启动搅拌器搅拌，保持转速为150r/min，持续30min后结束；

[0076] (3)、将(2)中处理完的试片置入烘箱中晾干，温度设置为37℃；

[0077] (4)、将(3)中处理过的试片在白度计下测量，得到测后白度值F2，计算去污值。

[0078] (5)、将(2)中洗涤剩余的污液进行酸碱滴定。向污液中加入2ml的0.1％酚酞溶液，向其中滴加0.05M的氢氧化钠溶液，直至溶液整体呈现浅红色。记录滴加的氢氧化钠体积，计算产生的游离脂肪酸含量。

[0079] (6)、根据国标GB/T 13174‑2021中提到的去污值计算方法进行计算去污值；采用酸碱滴定的方法，消耗掉的氢氧化钠的物质的量可以认为是洗涤中所产生的游离脂肪酸含量。

[0080] 结果如表2所示。

[0081] 表2

[0082]

[0083] 本实施例采用国标规定的JB‑04食用油污布进行实验，并使用市售洗涤剂和诺维信脂肪酶Lipoclean作为对照，从表2结果可以看出：仅使用自来水的空白组去污值4.275，单独使用海洋杆菌脂肪酶MNL时，去污值为7.93，表明其具有良好的去油污能力。仅使用商业化洗涤剂去污值为8.45，而海洋杆菌脂肪酶MNL和市售洗涤剂复配使用，去污值为9.18，去污值大大提高，证明两者复配使用，去油污的效果更强，比诺维信脂肪酶Lipoclean和市售洗涤剂复配效果更好(8.98)。

[0084] 对洗涤后的污液进行进行酸碱滴定，测定因脂肪酶水解油脂所产生的游离脂肪酸含量。仅使用自来水的空白组的脂肪酸含量28μM，仅使用商业化洗涤剂脂肪酸含量为152μM，单独使用海洋杆菌脂肪酶MNL时，脂肪酸含量为99.17μM，而海洋杆菌脂肪酶MNL和市售洗涤剂复配使用，脂肪酸含量提升至176.83μM，比诺维信脂肪酶Lipoclean和市售洗涤剂复配使用时的脂肪酸含量稍低(204.83μM)。

[0085] 本实施例的结果表明：海洋杆菌脂肪酶MNL具有良好的去除油污的能力，在商业化洗涤剂中添加海洋杆菌脂肪酶MNL，其去除油污的能力得到进一步提升，与在商业化洗涤剂中添加诺维信商业化脂肪酶Lipoclean效果相当。

[0086] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

[0087] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。