一种靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物及其制备方法和应用 |
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| 申请号 | CN202110703084.5 | 申请日 | 2021-06-24 | 公开(公告)号 | CN113354619B | 公开(公告)日 | 2024-03-19 |
| 申请人 | 皖南医学院; | 发明人 | 黄慧丹; 朱丽; 张超; 刘晓平; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种靶向泛素化降解酪 氨 酸酶的化合物及其制备方法和应用，以Tyr 抑制剂 曲酸通过连接链共价结合泊 马 度胺或VHL酶靶向配体得到特定结构的靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物，该靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物的制备方法操作简单，条件温和，所得靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物能够显著抑制酪氨酸酶的活性、抑制黑色素的生成，抗黑色素瘤效果显著，且可显著延长蔬菜 水 果的保险期。可见，本发明提供的靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物在医药、食品、 化妆品 中均有广阔的应用前景。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物，其特征在于，所述化合物的结构式为： |
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| 说明书全文 | 一种靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物及其制备方法和应用技术领域[0001] 本发明涉及化学医药和食品技术领域，具体涉及一种靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物及其制备方法和应用。 背景技术[0002] 泛素‑蛋白酶体途径(UPP)是通过降解蛋白来调节细胞内蛋白质水平的关键途径，参与细胞内80％以上蛋白质的降解。UPP途径由泛素、泛素活化酶E1、泛素转移酶E2s、泛素连接酶E3s和蛋白酶体组成。泛素‑蛋白酶体降解途径包括两个主要阶段。第一阶段为泛素与蛋白底物的相互作用：高能硫酯键E1‑泛素复合物的形成，活化泛素(E1‑泛素复合物)转移到E2s上，释放出E1，形成高能键E2‑泛素复合物，接着底物被E3s识别并与之结合，E2‑泛素复合物上的泛素转移到E3s上，形成高能键复合物，继而底物通过赖氨酸的ε‑氨基形成酰胺键与泛素连接，泛素分子逐个相加形成链状结构。第二阶段为蛋白酶体对底物的降解：底物泛素链与蛋白酶体19S的泛素受体相互作用，被逐步降解，在泛素C‑端水解酶、脱泛素酶和寡肽酶的作用下，释放出泛素分子(可再次参与循环)。 [0003] 酶促褐变是自然界中存在的普遍现象，在食品保鲜中，酶促反应所引发的褐变问题，不仅影响食品的外部感官，同时降低食品的品质和营养价值，缩短了食品的货架期，造成严重经济损失，因此寻找合适的食品添加剂来抑制食品的褐变引起了人们的极大关注。而食品褐变的发生是由于食品内部酶促反应生成的深色大分子染料黑色素的沉积，对黑色素生物合成路径的研究发现，酪氨酸酶(Tyr)是其生成过程中的关键限速酶。因而，开发新型靶向酪氨酸酶的褐变调控剂在果蔬保鲜领域逐渐成为人们研究的热点。 [0004] 虽然目前已经开发了一些物质用作酪氨酸酶抑制剂或作为美白成分使用，但其长期安全性和酪氨酸酶抑制活性尚难以令人满意。因此，本领域迫切需要开发新的安全性高、抑制活性好的酪氨酸酶调控剂。 发明内容[0005] 本发明的目的在于提供一种靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物及其制备方法和应用，所述靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物能显著抑制酪氨酸酶的活性、抑制黑色素生成、防止食物发生褐变。 [0006] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下： [0007] 一种靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物，所述靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物的结构式为： [0008] [0009] 所述连接链I的结构式为所述连接链II的结构式为 [0010] 其中，m为1～6中的任意整数、x为1～14中的任意整数；n为1～14中的任意整数。 [0011] m优选为2～3中的任意整数、x优选为3～4中的任意整数；n优选为3～4中的任意整数。 [0012] 本发明提供的所述靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物的制备方法包括以下步骤：将Z‑2、P‑3、DIPEA溶于DMF中，冰浴降温至0℃后加入HATU，然后在室温下反应1‑5h，然后经萃取、浓缩、纯化，即可制备得到所述靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物； [0013] 所述Z‑2、P‑3的结构式分别为： [0014] 。 [0015] 所述Z‑2、P‑3、DIPEA、HATU的物质的量之比为1:(1～1.1):(1～1.1):(1.5～2.0)。 [0016] 所述Z‑2在DMF中的浓度为0.05～0.1M。 [0017] 所述纯化的方法为：以体积比为1～10:1的石油醚、乙酸乙酯的混合液为洗脱剂经聚酰胺柱进行层析纯化。 [0018] 也可以将所述Z‑2替换为Z‑4制备得到靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物；所述Z‑4的结构式为： [0019] 本发明提供的所述靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物的制备方法还包括以下步骤：在N2保护下，将五水硫酸铜、抗坏血酸钠加入去离子水中，溶解完全后，向其中加入V‑7的DMF溶液，混合均匀后，向其中加入S‑2的DMF溶液，室温下反应3.5～5.0h，然后经萃取、浓缩、纯化，即可制备得到所述靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物； [0020] 所述S‑2、V‑7的结构式分别为： [0021] 。 [0022] 所述五水硫酸铜、抗坏血酸钠、V‑7、S‑2的物质的量之比为1:(1～1.1):(1～1.1):(1～1.1)。 [0023] 所述去离子水、V‑7的DMF溶液、S‑2的DMF溶液的体积之比为1：2～5:2～5。 [0024] V‑7的DMF溶液的浓度为0.15～0.5M。 [0025] S‑2的DMF溶液的浓度为0.15～0.5M。 [0026] 所述纯化的方法为：以体积比为15～30:1的二氯甲烷、甲醇的混合液为洗脱剂经聚酰胺柱进行层析纯化。 [0027] 也可以将所述V‑7替换为V‑8、P‑4或P‑5制备得到靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物；所述V‑8、P‑4、P‑5的结构式分别为： [0028] 。 [0031] 含有本发明所述的靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物的药物、洗涤剂、化妆品或蔬菜水果保鲜剂也都在本发明的保护范围之内。 [0032] 本发明以Tyr抑制剂曲酸通过连接链共价结合泊马度胺或VHL酶靶向配体得到特定结构的靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物，该靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物的制备方法操作简单，条件温和，所得靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物能够显著抑制酪氨酸酶的活性、抑制黑色素的生成，抗黑色素瘤效果显著，且可显著延长蔬菜水果的保险期。可见，本发明提供的靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物在医药、食品、化妆品中均有广阔的应用前景。附图说明 [0033] 图1为本发明各实施例中的靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物对酪氨酸酶蛋白的降解作用图； [0034] 图2为本发明各实施例中的靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物对酪氨酸酶蛋白的降解作用的量化数值图； [0035] 图3为实施例1制备的化合物BCP‑1对B16细胞内黑色素含量的影响图； [0036] 图4为实施例1制备的化合物BCP‑1对双孢菇贮藏期间的生理及品质指标的影响； [0037] 图5为实施例1制备的化合物BCP‑1的氢谱核磁图； [0038] 图6为实施例2制备的化合物BCP‑2的氢谱核磁图； [0039] 图7为实施例3制备的化合物BCP‑3的质谱图； [0040] 图8为实施例4制备的化合物BCP‑4的质谱图； [0041] 图9为实施例5制备的化合物BCP‑5的氢谱核磁图； [0042] 图10为实施例6制备的化合物BCP‑5的质谱图； [0043] 图11为实施例6制备的化合物BCP‑5的氢谱核磁图； [0044] 图12为靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物的结构式。 具体实施方式[0045] 下面结合实施例对本发明进行详细说明。 [0046] 本发明各实施例中的靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物在制备过程中所涉及到的中间体的制备方法如下： [0047] [0048] V‑1的制备：将4‑溴苄腈(19.00g，0.110mol)，4‑甲基噻唑(21.00g，0.210mol)，KOAc(20.50g，0.240mol)和Pd(OAc)2(0.70g，0.003mol)在0℃下依次加入200mL DMF中，N2保护，油浴加热至150℃反应5h。反应完全后停止加热降至室温，向反应液中加入500mL水淬灭反应，用乙酸乙酯(300mL×3)萃取。合并有机层并用饱和食盐水(500mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，真空浓缩。以体积比为1:1的石油醚、乙酸乙酯的混合液为洗脱剂经聚酰胺柱进行层析纯化，收集的含产物的洗脱液经浓缩干燥后得黄色固体12.50g，收率60％。HRMS m/z[M++ +H]calcd for C11H8N2S 201.0442[M+H] ,found 201.0451。 [0049] V‑2的制备：称取V‑1(10.00g，0.050mol)溶于300mL MeOH，0℃下加入CoCl2(9.70g，0.075mol)、分批缓慢加入NaBH4(9.50g，0.250mol)，反应剧烈放热，反应液变粘稠，加完撤去冰浴，室温搅拌1h，加水、氨水淬灭，EA萃取，真空浓缩得8.90g黄色油状物，直接进+ +行一步反应，收率87％。HRMS m/z[M+H] calcd for C11H12N2S 205.0755[M+H] , found205.0698。 [0050] V‑3、V‑4的制备：将N‑Boc‑L‑叔亮氨酸(20.00g，0.086mol)及反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸甲酯盐酸盐(12.56g，0.086mol)加入150mL DMF中，室温搅拌至溶解，完全溶解后加入N,N‑二异丙基乙胺(39.14g，0.310mol)，N2保护，0℃下加入HATU(34.54g，0.090mol)，加完撤去冰浴，升温至室温反应11.5h，TLC碘熏检测(V石油醚：V乙酸乙酯＝1:1)显示反应完全，停止搅拌，向反应液中加入300mL水，乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层依次用5％柠檬酸水溶液洗三次，饱和碳酸氢钠水溶液洗三次，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥，抽滤，乙酸乙酯层减压整除溶剂，得黄色油状物V‑3，将所得油状物溶于200mL四氢呋喃与100mL水的溶液中，完全溶解后加入氢氧化锂(33.34g，1.380mol),室温反应24h，TLC检测(V石油醚：V乙酸乙酯＝1:3，加三乙胺)显示反应完全，停止搅拌，将反应液倒入800mL冰水中，有大量白色固体析出，抽滤，干燥得+ +白色固体28.16g，收率94％。HRMS m/z[M+H] calcd for C16H28N2O6 345.1981[M+H] ,found 345.1988。 [0051] V‑5、V‑6的制备：将V‑2(12.08g，0.059mol)及V‑4(19.08g，0.056mol)加入到280mL DMF，室温搅拌至溶解，待完全溶解后加入N,N‑二异丙基乙胺(28.66g，0.220mol)，N2保护，0℃下加入HATU(31.60g，0.084mol)，室温反应24h，TLC检测(V石油醚：V乙酸乙酯＝1:3，加三乙胺)显示反应完全，停止反应，向反应液中加入500mL水，用EA萃取，之后水洗三次，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥，抽滤将EA层旋干，以体积比为1:1的石油醚、乙酸乙酯的混合液为洗脱剂经聚酰胺柱进行层析纯化，收集的含产物的洗脱液经浓缩干燥后得淡黄色固体V‑5 26.22g，收率86％。将所得的淡黄色固体溶于500mL DCM中，室温搅拌至溶解，待完全溶解后冰浴降温至0℃，0℃时缓慢加入190mL 4N盐酸的二氧六环溶液，滴加完毕后室温反应1.5h，TLC检测(V石油醚：V乙酸乙酯＝1:3，加三乙胺)显示反应完全，停止搅拌，直接将反应液旋干，得淡黄色固体，所得固体用V二氯甲烷：V石油醚＝1:1的混合溶液洗，干燥得淡黄色固体V‑6 20.76g，收+ + 率97％。HRMS m/z[M+H]calcd for C22H30N4O3S431.2072[M+H] ,found 431.2089。 [0052] [0053] V‑7的制备：将V‑6(2.00g，4.640mmol)及己炔酸(0.51g，4.640mmol)加入到30mL DMF，室温搅拌至溶解，待完全溶解后加入N,N‑二异丙基乙胺(0.60g，4.640mmol)，N2保护，冰浴降温至0℃，0℃时加入HATU(3.52g，9.280mmol)，室温下反应3h，TLC检测(V石油醚：V乙酸乙酯＝1:3，加三乙胺)显示反应完全，停止反应，向反应液中加入100mL水，乙酸乙酯萃取，之后水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，抽滤，将乙酸乙酯层旋干，以体积比为1:1的石油醚、乙酸乙酯的混合液为洗脱剂经聚酰胺柱进行层析纯化，收集的含产物的洗脱液经浓缩干燥+ +得黄色固体1.89g，收率78％。HRMS m/z[M+H] calcd for C28H36N4O4S 525.2491[M+H] ,found 525.2534。 [0054] [0055] V‑8的制备：将V‑6(2.00g，4.640mmol)及庚炔酸(0.59g，4.640mmol)加入到30mL DMF，室温搅拌至溶解，待完全溶解后加入N,N‑二异丙基乙胺(0.60g，4.640mmol)，N2保护，冰浴降温至0℃，0℃时加入HATU(3.52g，9.280mmol)，室温下反应3h，TLC检测(V石油醚：V乙酸乙酯＝1:3，加三乙胺)显示反应完全，停止反应，向反应液中加入100mL水，乙酸乙酯萃取，之后水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，抽滤将乙酸乙酯层旋干，以体积比为1:1的石油醚、乙酸乙酯的混合液为洗脱剂经聚酰胺柱进行层析纯化，收集的含产物的洗脱液经浓缩干燥+ +得黄色固体2.02g，收率81％。HRMS m/z[M+H] calcd for C29H38N4O4S 539.2647[M+H] ,found 539.2658。 [0056] [0057] P‑1的制备：将3‑氟酞酐(10.00g，0.036mol)、3‑氨基‑2,6‑哌啶二酮(4.62g，0.036mol)及乙酸钠(3.56g，0.044mol)加入150mL乙酸中，室温搅拌至完全溶解，油浴加热至80℃，保持80℃反应15h，TLC检测(V二氯甲烷：V甲醇＝15:1)显示反应完全，停止反应，带降至室温后将反应液旋干，以体积比为50:1的二氯甲烷、甲醇的混合液为洗脱剂经聚酰胺柱进行层析纯化，收集的含产物的洗脱液经浓缩干燥得金黄色固体13.4g，收率81％。HRMS m/z[M++ + H]calcd for C13H9FN2O4 277.0625[M+H] ,found 277.0685。 [0058] P‑2的制备：将P‑1(6.00g，0.022mol)加入60mL DMF中，室温搅拌至完全溶解，完全溶解后缓慢依次加入N‑叔丁氧羰基乙二胺(5.22g，0.032mol)及N,N‑二异丙基乙胺(14.04g，0.110mol)，油浴升温至90℃，保持90℃反应3h，TLC检测(V石油醚：V乙酸乙酯＝1:1)显示反应完全，停止解热。静置待反应液温度降至室温。向反应液中加入100mL水，用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯层旋干，以体积比为3:1的石油醚、乙酸乙酯的混合液为洗脱剂经聚酰胺柱进行层析纯化，收集的含产物的洗脱液经浓缩干燥得金黄色固体3.14g，收率33％。HRMS m/+ +z[M+H]calcd for C20H24N4O6 417.1774[M+H] ,found 417.1708. [0059] P‑3的制备：将P‑2(1.80g，0.0044mol)加入20mL三氟乙酸中，室温搅拌至溶解，反应8h，TLC检测(V二氯甲烷：V甲醇＝10:1)显示检测反应完全，停止反应，减压整除溶剂，得金黄色+ +固体2.20g，收率95％。HRMS m/z[M+H] calcd for C15H16N4O4 316.1172[M+H] ,found 316.1205。 [0060] [0061] P‑4的制备：将P‑3(1.00g，3.170mmol)及己炔酸(0.35g，3.170mmol)加入到20mL DMF，室温搅拌至溶解，待完全溶解后加入N,N‑二异丙基乙胺(0.41g，3.170mmol)，N2保护，冰浴降温至0℃，0℃时加入HATU(2.41g，6.34mmol)，室温下反应3h，TLC检测(V二氯甲烷：V甲醇＝10:1)显示反应完全，停止反应，向反应液中加入50mL水，乙酸乙酯萃取，之后水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，抽滤，减压整除乙酸乙酯，以体积比为5:1的二氯甲烷、甲醇的混合液为洗脱剂经聚酰胺柱进行层析纯化，收集的含产物的洗脱液经浓缩干燥得黄绿色固体+ + 0.70g，收率54％。HRMS m/z[M+H]calcd for C21H22N4O5 411.1624[M+H] ,found 411.1633。 [0062] [0063] P‑5的制备：将P‑3(1.00g，3.170mmol)及庚炔酸(0.400g，3.170mmol)加入到20mL DMF，室温搅拌至溶解，待完全溶解后加入N,N‑二异丙基乙胺(0.41g，3.170mmol)，N2保护，冰浴降温至0℃，0℃时加入HATU(2.41g，6.340mmol)，室温下反应3h，TLC检测(V二氯甲烷：V甲醇＝10:1)反应完全，停止反应，向反应液中加入50mL水，乙酸乙酯萃取，之后水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，抽滤减压整除溶剂，以体积比为5:1的二氯甲烷、甲醇的混合液为洗脱剂经聚酰胺柱进行层析纯化，收集的含产物的洗脱液经浓缩干燥得黄绿色固体0.68g，收率+ + 51％。HRMS m/z[M+H]calcd for C22H24N4O5 425.1780[M+H] ,found 425.1789。 [0064] [0065] L‑1的制备：将二乙二醇(4.46g，0.042mol)加入到50mL THF中，室温搅拌至溶解，待完全溶解后冰浴降温至0℃，N2保护，0℃时加入钠氢(2.00g，0.084mol)，保持0℃反应2h，缓慢滴入溴乙酸叔丁酯(8.20g，0.042mol)，保持0℃搅拌12h，TLC碘熏显示检测(V石油醚：V乙酸乙酯＝3:1)反应完全，停止搅拌，加入80mL水淬灭反应，真空旋蒸除去反应液中的THF，水层用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥，抽滤，真空浓缩，以体积比为10:1的石油醚、乙酸乙酯的混合液为洗脱剂经聚酰胺柱进行层析纯化，收集的含+ 产物的洗脱液经浓缩干燥得淡黄色油状物5.20g，收率56％。HRMS m/z[M+H] calcd for + C10H20O5 221.1344[M+H] ,found 221.1316。 [0066] L‑2的制备：将L‑1(4.0g，0.018mol)加入100mL DCM中，室温搅拌至溶解，依次加入4‑甲基苯‑1‑磺酰氯(6.79g，0.036mol)、三乙胺(4.57g，0.045mol)和4‑二甲氨基吡啶(0.90g，0.0074mol)。室温下反应12h，TLC碘熏检测(V石油醚：V乙酸乙酯＝3:1)显示反应完全，停止反应，真空浓缩，以体积比为5:1的石油醚、乙酸乙酯的混合液为洗脱剂经聚酰胺柱进行层析纯化，收集的含产物的洗脱液经浓缩干燥得淡黄色油状物3.76g，收率56％。HRMS m/z[M++ + H]calcd for C17H26O7S 375.1433[M+H] ,found 375.1445。 [0067] 实施例1 [0068] 靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物BCP‑1的制备方法如下： [0069] [0070] Z‑1的制备：称取曲酸(0.29g，2.080mmol)、L‑2(0.89g，2.490mmol)、Cs2CO3(1.35g，4.160mmol)溶于40mL DMF中，于60℃油浴中加热搅拌反应3h，TLC检测(V石油醚：V乙酸乙酯＝1:1)显示反应完全，停止反应，向反应液中加入100mL水，乙酸乙酯萃取，有机层用饱和食盐水+ 洗，真空浓缩得0.78g褐色油状物，直接投下一步反应。HRMS m/z[M+H]calcd for C16H24O8 + 345.1505[M+H] ,found 345.1511。 [0071] Z‑2的制备：称取Z‑1(0.78g，2.030mmol)溶于50mL DCM中，室温下缓慢滴入30mL TFA，搅拌反应5h，TLC检测(V石油醚：V乙酸乙酯＝1:1)显示反应完全，停止反应，真空浓缩，加入乙酸乙酯，搅拌至完全溶解，水洗，无水硫酸钠干燥，旋干得0.67g褐色油状物，直接进行下一+ +步反应。HRMS m/z[M+H]calcd for C12H16O8 289.0879[M+H] ,found289.0903。 [0072] N‑(2‑((2‑(2,6‑二氧代哌啶‑3‑基)‑1,3‑二氧异吲哚‑4‑基)氨基)乙基)‑2‑(2‑(2‑((5‑羟基‑4‑氧代‑4H‑吡喃‑2‑基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)乙酰胺(BCP‑1)的制备：将Z‑2(0.67g，2.330mmol)，P‑3(0.73g，2.330mmol)及DIPEA(0.30g，2.330mmol)溶于40mL DMF中，冰浴降温至0℃，加入HATU(1.43g，3.760mmol)，室温反应3h，TLC检测(V石油醚：V乙酸乙酯＝1: 3)显示反应完全，停止反应，加水，乙酸乙酯萃取，干燥，真空浓缩，以体积比为1:1的石油醚、乙酸乙酯的混合液为洗脱剂经聚酰胺柱进行层析纯化，收集的含产物的洗脱液经浓缩+ 干燥后得黄绿色固体0.39g，收率29％。HRMS m/z[M+H]calcd for C27H30N4O11 587.1945[M++ H] ,found 587.1958。 [0073] 1H NMR(300MHz,DMSO‑d6)：δ8.09(s,1H),7.95(s,1H),7.57(t,J＝7.5Hz,1H),7.18(d,J＝7.8Hz,1H),7.02(d,J＝6.3Hz,1H),6.73(s,1H),6.30(s,1H),5.69(s,1H),5.08‑5.02(m,1H),4.28(d,J＝4.8Hz,3H),3.94(s,2H),3.88(s,2H),3.69(s,2H),3.58‑3.33(m, 6H),2.93‑2.85(m,2H),1.24(s,2H)ppm(‑OH上的氢由于较活泼核磁图中未出峰). [0074] 实施例2 [0075] 靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物BCP‑2的制备方法如下： [0076] [0077] L‑3的制备：将三乙二醇(5.00g，0.033mol)加入到50mL THF中，室温搅拌至溶解，待完全溶解后冰浴降温至0℃，N2保护，0℃时加入钠氢(1.58g，0.066mol)，保持0℃反应2h，缓慢滴入溴乙酸叔丁酯(6.44g，0.033mol)，保持0℃搅拌12h，TLC碘熏检测显示(V石油醚：V乙酸乙酯＝3:1)反应完全，停止搅拌，加入100mL水淬灭反应，真空旋蒸除去反应液中的THF，水层用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥，抽滤，真空浓缩，以体积比为10:1的石油醚、乙酸乙酯的混合液为洗脱剂经聚酰胺柱进行层析纯化，收集的含+ 产物的洗脱液经浓缩干燥得淡黄色油状物5.60g，收率64％。HRMS m/z[M+H] calcd for + C12H24O6 265.1606[M+H] ,found 265.1651。 [0078] L‑4的制备：将L‑3(5.60g，0.021mol)加入100mL DCM中，室温搅拌至溶解，依次加入4‑甲基苯‑1‑磺酰氯(4.00g，0.021mol)、三乙胺(2.12g，0.021mol)和4‑二甲氨基吡啶(0.90g，0.0074mol)。室温下反应12h，TLC碘熏检测(V石油醚：V乙酸乙酯＝3:1)显示反应完全，停止反应，真空浓缩，以体积比为5:1的石油醚、乙酸乙酯的混合液为洗脱剂经聚酰胺柱进行层析纯化，收集的含产物的洗脱液经浓缩干燥得淡黄色油状物5.10g，收率58％。HRMS m/z[M++ +H]calcd for C19H30O8S 419.1695[M+H] ,found 419.1703。 [0079] [0080] Z‑3的制备：称取曲酸(0.50g，3.520mmol)、L‑4(1.47g，3.520mmol)、Cs2CO3(2.29g，7.040mmol)溶于40mL DMF中，油浴加热至60℃反应3h，TLC检测(V石油醚：V乙酸乙酯＝1:1)显示反应完全，停止反应，向反应液中加入100mL水，乙酸乙酯萃取，有机层用饱和食盐水洗，真空+ 浓缩得1.78g褐色油状物，直接投下一步反应。HRMS m/z[M+H] calcd for C18H28O9 + 389.1767[M+H] ,found 389.1785。 [0081] Z‑4的制备：称取Z‑3(1.78g，4.590mmol)溶于50mL DCM中，室温下缓慢滴入30mL TFA，搅拌反应4h，TLC检测(V石油醚：V乙酸乙酯＝1:1)显示反应完全，停止反应，真空浓缩，加入乙酸乙酯，搅拌至完全溶解，水洗，无水Na2SO4干燥，减压整除溶剂，得1.34g褐色油状物，直接+ +进行下一步反应。HRMS m/z[M+H]calcd for C14H20O9 333.1141[M+H] ,found 333.1167。 [0082] N‑(2‑((2‑(2,6‑二氧代哌啶‑3‑基)‑1,3‑二氧异吲哚‑4‑基)氨基)乙基)‑1‑(5‑羟基‑4‑氧代‑4H‑吡喃‑2‑基)‑2,5,8,11‑四氧杂癸烷‑13‑酰胺(BCP‑2)的制备：将Z‑4(1.34g，4.030mmol)，P‑3(1.27g，4.030mmol)及DIPEA(0.52g，4.030mmol)溶于40mL DMF中，冰浴降温至0℃，加入HATU(3.06g，8.060mmol)，室温反应3.5h，TLC检测(V石油醚：V乙酸乙酯＝1:3)显示反应完全，停止反应，加水，乙酸乙酯萃取，干燥，真空浓缩，以体积比为1:1的石油醚、乙酸乙酯的混合液为洗脱剂经聚酰胺柱进行层析纯化，收集的含产物的洗脱液经浓缩干燥得黄绿+ + 色固体0.58g，收率23％。HRMS m/z[M+H] calcd for C29H34N4O12 631.2207[M+H] ,found631.2218。 [0083] 1H NMR(300MHz,DMSO‑d6)：δ11.09(s,1H),8.09(s,1H),7.96(t,J＝5.9Hz,1H),7.58(t,J＝8.4Hz,1H),7.19(d,J＝9.0Hz,1H),7.02(d,J＝9.0Hz,1H),6.87(s,1H),6.75(t,J＝5.9Hz,1H),6.29(s,1H),5.70(t,J＝6.0Hz,1H),5.05(q,J＝6.0Hz,1H),4.28(d,J＝ 6.0Hz,2H),3.95(t,J＝6.0Hz,2H),3.91(s,2H),3.87(t,J＝6.0Hz,2H),3.55‑3.00(m,8H), 3.40‑3.35(m,3H),2.50(s,2H),2.03‑2.01(m,2H)ppm(‑OH上的氢由于较活泼核磁图中未出峰). [0084] 实施例3 [0085] [0086] (2S，4R)‑4‑羟基‑1‑((R)‑2‑(4‑(1‑((5‑羟基‑4‑氧代‑4H‑吡喃‑2‑基)甲基)‑1H‑1，2,3‑三唑‑4‑基)丁酰胺基)‑3,3‑二甲基丁酰基)‑N‑(4‑(4‑甲基噻唑‑5‑基)苄基)吡咯烷‑2‑羧酰胺(BCP‑3)的制备：将五水硫酸铜(0.48g，1.910mmol)及抗坏血酸钠(0.38g， 1.910mmol)加入2mL水中，N2保护，室温搅拌10min，将V‑7(1.0g，1.910mmol)溶于6mL DMF，滴入反应液中，室温下搅拌10min，将S‑2(0.32g，1.910mmol)溶于6mL DMF中，滴入反应液中，室温下反应3.5h，TLC检测(V二氯甲烷：V甲醇＝15:1)显示反应完全，停止搅拌，向反应液中加入50mL水，乙酸乙酯萃取，水洗三次，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥，抽滤，减压整除溶剂，以体积比为30:1的二氯甲烷、甲醇的混合液为洗脱剂经聚酰胺柱进行层析纯化，收集+ 的含产物的洗脱液经浓缩干燥得淡黄色固体0.50g，收率38％。HRMS m/z[M+H] calcd for + C34H41N7O7S 692.2822[M+H] ,found 692.2854。 [0087] 实施例4 [0088] [0089] (2S，4R)‑4‑羟基‑1‑((R)‑2‑(5‑(1‑((5‑羟基‑4‑氧代‑4H‑吡喃‑2‑基)甲基)‑1H‑1，2,3‑三唑‑4‑基)戊酰胺基)‑3,3‑二甲基丁酰基)‑N‑(4‑(4‑甲基噻唑‑5‑基)苄基)吡咯烷‑2‑羧酰胺(BCP‑4)的制备：将五水硫酸铜(0.47g，1.860mmol)及抗坏血酸钠(0.37g， 1.860mmol)加入2mL水中，N2保护，室温搅拌10min，将V‑8(1.00g，1.860mmol)溶于6mL DMF，滴入反应液中，室温下搅拌10min，将S‑2(0.31g，1.860mmol)溶于6mL DMF中，滴入反应液中，室温下反应3.5h，TLC检测(V二氯甲烷：V甲醇＝15:1)显示反应完全，停止搅拌，向反应液中加入50mL水，乙酸乙酯萃取，水洗三次，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥，抽滤，减压整除溶剂，以体积比为30:1的二氯甲烷、甲醇的混合液为洗脱剂经聚酰胺柱进行层析纯化，收集+ 的含产物的洗脱液经浓缩干燥得淡黄色固体0.46g，收率35％。HRMS m/z[M+H] calcd for + C35H43N7O7S 706.2978[M+H] ,found 706.3009。 [0090] 实施例5 [0091] [0092] S‑1的制备：将曲酸(5.00g，0.035mol)加入50mL氯化亚砜中，室温搅拌3h，停止反应，真空浓缩，加乙酸乙酯溶解，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，得6.75g褐色油+ +状物，直接进行下一步反应。HRMS m/z[M+H]calcd for C7H7ClO3 161.0005[M+H] ,found 161.0012。 [0093] S‑2的制备：将S‑1(6.75g，0.012mol)加入50mL DMF，室温搅拌至溶解，N2保护，待完全溶解后加入叠氮钠(2.73g，0.012mol)，油浴缓慢升温至60℃，保持60℃反应6h，TLC检测(V石油醚：V乙酸乙酯＝1:1)显示反应完全，停止搅拌，向反应液中加入150mL水，用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，抽滤，减压整除溶剂，得淡黄色油状+ +物5.20g。HRMS m/z[M+H]calcd for C6H5N3O3 168.0409[M+H] ,found 168.0421。 [0094] [0095] N‑(2‑((2‑(2,6‑二氧代哌啶‑3‑基)‑1,3‑二氧异吲哚‑4‑基)氨基)乙基)‑4‑(1‑((5‑羟基‑4‑氧代‑4H‑吡喃‑2‑基)甲基)‑1H‑1,2,3‑三唑‑4‑基)丁酰胺(BCP‑5)的制备：将五水硫酸铜(0.31g，1.220mmol)及抗坏血酸钠(0.24g，1.220mmol)加入2mL水中，N2保护，室温搅拌10min，将P‑4(0.5g，1.220mmol)溶于6mL DMF，滴入反应液中，室温下搅拌10min，将S‑2(0.20g，1.220mmol)溶于6mL DMF中，滴入反应液中，室温下反应5h，TLC检测(V二氯甲烷：V甲醇＝15:1)显示反应完全，停止搅拌，向反应液中加入50mL水，乙酸乙酯萃取，水洗三次，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥，抽滤，减压整除溶剂，以体积比为30:1的二氯甲烷、甲醇的混合液为洗脱剂经聚酰胺柱进行层析纯化，收集的含产物的洗脱液经浓缩干燥得淡黄色固+ +体0.24g，收率34％。HRMS m/z[M+H] calcd for C27H27N7O8 578.1995[M+H] ,found 578.1990。 [0096] 1H NMR(300MHz,DMSO‑d6)：δ11.10(s,1H),8.05(s,2H),7.93(s,1H),7.56(dd,J＝11.1,4.8Hz,1H),7.17(dd,J＝8.8,2.6Hz,1H),7.02(dd,J＝7.0,2.4Hz,1H),6.73(s,1H), 6.36(s,1H),5.53(s,2H),5.10–4.95(m,1H),3.25(s,3H),2.95–2.79(m,1H),2.66–2.56(m, 4H),2.11(t,J＝7.4Hz,3H),1.24–1.10(m,3H)ppm(‑OH上的氢由于较活泼核磁图中未出峰). [0097] 实施例6 [0098] [0099] N‑(2‑((2‑(2,6‑二氧代哌啶‑3‑基)‑1,3‑二氧异吲哚‑4‑基)氨基)乙基)‑5‑(1‑((5‑羟基‑4‑氧‑4H‑吡喃‑2‑基)甲基)‑1H‑1,2,3‑三唑‑4‑基)戊酰胺(BCP‑6)的制备：将五水硫酸铜(0.30g，1.170mmol)及抗坏血酸钠(0.23g，1.220mmol)加入2mL水中，N2保护，室温搅拌10min，将P‑5(0.50g，1.170mmol)溶于6mL DMF，滴入反应液中，室温下搅拌10min，将S‑2(0.20g，1.170mmol)溶于6mL DMF中，滴入反应液中，室温下反应5h，TLC检测(V二氯甲烷：V甲醇＝ 15:1)显示反应完全，停止搅拌，向反应液中加入50mL水，乙酸乙酯萃取，水洗三次，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥，抽滤，减压整除溶剂，以体积比为30:1的二氯甲烷、甲醇的混合液为洗脱剂经聚酰胺柱进行层析纯化，收集的含产物的洗脱液经浓缩干燥得淡黄色固体+ + 0.16g，收率23％。HRMS m/z[M+H]calcd for C28H29N7O8 592.2110[M+H] ,found 592.2140。 [0100] 1H NMR(300MHz,DMSO‑d6)：δ11.12(s,1H),9.30(s,1H),8.07(d,J＝4.8Hz,2H),7.95(s,1H),7.60(dd,J＝8.6,7.0Hz,1H),7.20(d,J＝8.6Hz,1H),7.05(d,J＝7.0Hz,1H), 6.75(t,J＝6.1Hz,1H),6.38(s,1H),5.56(s,2H),5.08(dd,J＝12.8,5.4Hz,1H),3.28(t,J＝5.9Hz,3H),2.92(ddd,J＝17.0,13.8,5.3Hz,1H),2.69–2.55(m,4H),2.17–1.98(m,3H), 1.57(t,J＝3.8Hz,5H)ppm. [0101] 测试例1 [0102] 各实施例制备得到的靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物对蛋白的降解活性测定[0103] 实验方法: [0104] 为了检测各实施例制备得到的靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物(化合物BCP‑1、BCP‑2、BCP‑3、BCP‑4、BCP‑5、BCP‑6)对B16小鼠黑色素瘤细胞中酪氨酸酶的降解作用，将化合物用DMAO配成母液并用培养液分别将化合物稀释至1μM、5μM、10μM和30μM放孵箱继续培养72h并给药，设置阳性孔与阴性孔，通过蛋白质印迹法(Western Blot，WB)方法考察化合物对酪氨酸酶的表达的影响。 [0105] 将化合物与细胞进行孵育12h，通过Western Blot方法考察化合物对酪氨酸酶蛋白的降解作用，选取曲酸作为对照。结果如图1、2所示，大部分化合物都可以降解酪氨酸酶。其中化合物BCP‑1以及BCP‑6降解活性最优。BCP‑1在30μM下对酪氨酸酶的降解率超过了 70％。而作为对照的曲酸不能降解酪氨酸酶，也表明基于曲酸设计的PROTACs分子可以应用于酪氨酸酶的降解研究中。 [0106] 测试例2 [0107] 各实施例制备得到的靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物对酪氨酸酶的抑制活性的测定实验方法： [0108] 本实验采用了多巴氧化速率法来测定各实施例制备得到的靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物(化合物BCP‑1、BCP‑2、BCP‑3、BCP‑4、BCP‑5、BCP‑6)对酪氨酸酶活性的抑制的影响。 [0109] 首先，将化合物溶解于一定量的DMSO中，配制成10mmol/L的母液，后期根据实验需要，稀释成不同的浓度。然后用50mM pH 6.8的磷酸盐缓冲溶液将底物L‑DOPA和酪氨酸酶(Tyr)配制成的浓度分别为0.50mM和40μg/mL的溶液，并4℃避光保存待用。在96孔中，依次加入不同浓度化合物、磷酸盐缓冲液(pH 6.8)和0.50mM的L‑DOPA，在37℃孵育10min，加入40μg/mL的酪氨酸酶，混匀后，采用酶标仪在475nm处测混合溶液的吸光度值(A)，用溶剂DMSO代替化合物作为空白对照；和化合物对应浓度的曲酸溶液作为阳性对照，根据各自的吸光度值来计算酪氨酸酶的抑制率IC50，即为使酪氨酸酶活力下降至50％时化合物的浓度。 酪氨酸酶活性抑制率(％)＝[1‑(A1‑A2)/(A3‑A2)]×100％，式中，A1、A2和A3分别为反应液1、 2、和3的吸光度值值。 [0110] 实验结果如表1所示。 [0111] 表1对酪氨酸酶抑制活性IC50 [0112] Compounds Tyr inhibitory IC50BCP‑1 7.76 BCP‑2 8.86 BCP‑3 12.22 BCP‑4 11.94 BCP‑5 45.32 BCP‑6 20.1 曲酸 16.82 [0113] 化合物BCP‑1～BCP‑6相较于曲酸而言，其对酪氨酸酶亲和力并未明显降低，并且部分PROTACs小分子对酪氨酸酶的抑制活性有所提高，其中化合物BCP‑1活性最佳，测定其IC50值为7.76μM。根据酶活结果可知，本发明提供的靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物与酪氨酸酶能保持较好的亲和力，酪氨酸酶可以与本发明提供的靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物发生结合作用。 [0114] 测试例3 [0115] 实施例1制备得到的靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物BCP‑1对B16细胞内黑色素含量的影响 [0116] 为了研究BCP‑1对B16细胞内黑色素含量的影响，本实验采用氢氧化钠裂解法对细胞内的黑色素含量的检测。 [0117] 实验过程如下：细胞培养给药后，于37℃、5％CO2培养箱中培养48h后，消化离心，获得细胞，并用灭菌的PBS溶液洗涤2次，离心后于细胞沉淀中加入1mL 1mol/L NaOH(含10％DMSO)溶液，置于80℃水浴中1h使细胞团块完全溶解，摇匀，将混合液加入到96孔板中，每孔200μL，然后用酶标仪检测各孔在405nm处的吸光值。 [0118] 实验结果以空白实验中细胞内黑色素含量为100％来计算，实验结果如图3所示。经不同浓度的BCP‑1处理后，对B16细胞内黑色素含量是有一定的抑制作用，且黑色素含量与BCP‑1呈现一定的剂量依赖性，即随着BCP‑1浓度的增加，细胞内黑色素含量呈逐步降低的趋势。所以，BCP‑1具有抑制细胞内黑色素含量的作用，并且化合物在30μM浓度下对黑色素的抑制作用优于阳性对照曲酸。 [0119] 测试例4 [0120] 实施例1制备得到的靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物BCP‑1对双孢菇品质的影响 [0121] 实验中考察了化合物BCP‑1对采后双孢菇在4℃贮藏期间(15天)主要生理及品质指标的影响。 [0122] 实验过程如下： [0123] 实验室蘑菇购自中国江苏省南京市的一家当地超市。根据其白度、发育阶段、菇伞的封闭程度及形态(菇帽直径3～4cm，连接菌丝与菌柄的连接完好，无缺陷及机械损伤)进行选择。处理前将蘑菇放入4℃冰箱保存，然后将蘑菇随机分为两组：(1)对照组(不经过化合物处理)；(2)处理组(经过化合物处理)。每组蘑菇均置于聚乙烯保鲜口袋中，用热风机密封，于温度为4±1℃、相对湿度为90～95％的环境下保存15天。样品的检测频率为每三天/次，取样后密封保鲜口袋，且取出的双孢菇不放回，每个处理组9个重复，每个处理组随机选择3个重复。 [0124] 结果表明：经过化合物BCP‑1处理后的双孢菇，能够降低双孢菇在贮藏期间的失重率，延缓其褐变的发生；抑制了细胞膜透性的增长，丙二醛(MDA)含量的上升以及超氧阴离子自由基的生成速率；降低了PPO和PAL活性，同时使抗氧化酶(CAT、SOD)活性维持在较高水平，从而较好的保持双孢菇的品质和营养价值，延长双孢菇的贮藏保鲜期，这些结果表明，靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物BCP‑1对采后食用菌的贮藏保鲜具有潜在的应用前景。 [0125] 综上可见，本发明提供的靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物能够显著抑制酪氨酸酶的活性、抑制黑色素的生成，抗黑色素瘤效果显著，且可显著延长蔬菜水果的保险期。可见，本发明提供的靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物在医药、食品、化妆品中均有广阔的应用前景。 [0126] 上述参照实施例对一种靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物及其制备方法和应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。 |
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