一种从猪油中富集油酸的方法 |
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| 申请号 | CN202410119818.9 | 申请日 | 2024-01-29 | 公开(公告)号 | CN117778104A | 公开(公告)日 | 2024-03-29 |
| 申请人 | 锦州医科大学; | 发明人 | 孟鑫; 任雪娇; 于小磊; 孙晶; 王佳佳; 徐慧敏; 邢慧玉; 吴秋彤; 王美丽; | ||||
| 摘要 | 本 发明 属于 脂肪酸 提取技术领域，具体涉及一种从猪油中富集油酸的方法。所述方法包括如下步骤：混合脂肪酸的制备：猪油经 皂化 、 酸化 制得混合脂肪酸；尿素包合法富集油酸：用尿素包合法除去混合脂肪酸中大部分的 饱和脂肪酸 和单不饱和脂肪酸，富集，纯化得到油酸。本发明以猪油为原材料，采用尿素包合法对猪油中的油酸进行富集，用此条件下得到的油酸进行动物实验，考察其高血脂症小鼠的血脂代谢 水 平的影响，以期进一步丰富优质单不饱和脂肪酸资源，进一步开发猪油的食用方式，为合理利用猪油资源提供新的方式，将猪油的利用价值进一步增加。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种从猪油中富集油酸的方法，其特征在于，包括如下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种从猪油中富集油酸的方法技术领域背景技术[0002] 猪油，是最常使用的动物油脂之一，我国拥有丰富的猪油资源，可供开发利用。猪油与一般的植物油相比，有特殊的香味并且含有大量饱和脂肪酸和高级多烯酸，这些脂肪酸在植物油脂中含量很少，是人体必需脂肪酸和脂溶性维生素的重要来源，其中含有的α‑脂蛋白和花生四烯酸在人体中具有重要功能性，其含有的二十二碳多烯酸具有植物油所没有的促进生长发育的独特功能，尤其是在大脑和神经方面的作用是植物油脂所不能相提并论的。但猪油中饱和脂肪酸的含量过高，长期食用易引发高血脂、高血压等疾病，常会被认为是不健康的食品。而不饱和脂肪酸却具有降低血脂等生理作用。近几年来，我国食用植物油摄入增长，动物油脂摄入量下降。有研究证明，长期只摄入植物油脂而不摄入动物油脂会增加患糖尿病、贫血和心血管疾病等慢性病风险。 [0003] 油酸，Omega‑9‑十八(碳)烯酸，以甘油酯的形式存在于天然动、植物油中，是猪油中含量最高的单不饱和脂肪酸，研究表明，在饮食中摄入适量的油酸可以减少高脂血症等心血管疾病发生的概率，同时，还有助于维持心脑血管健康。 [0004] 目前。油酸的富集方法包括冷冻压榨法、CO2超临界萃取法、分子蒸馏法、表面活性剂法、结晶压滤法等。上述方法在富集油酸时，对设备的要求高，比如CO2超临界萃取法所需要设备复杂且价格昂贵，导致设备成本高，难以被大范围使用。并且，富集油酸的提取工艺复杂。因此，亟需一种新的油酸的富集方法来解决上述问题。 发明内容[0005] 为解决现有技术中提取工艺复杂和设备成本高的问题，为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： [0006] 本发明提供了一种从猪油中富集油酸的方法，包括如下步骤： [0008] 尿素包合法富集油酸：用尿素包合除去混合脂肪酸中大部分的饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸，富集，纯化得到油酸。 [0010] 优选地，猪油与氢氧化钠乙醇溶液的质量体积比为0.2～0.4:1。 [0011] 优选地，皂化反应的条件为：75～85℃加热回流40～60min。 [0012] 优选地，酸化的步骤为：皂化液冷却后，用体积分数20％硫酸调节pH＝3，将溶液加入正己烷进行萃取，将萃取液加入蒸馏水将其冲洗至中性，再加入干燥剂干燥，过滤，减压蒸馏，去除溶剂，获得混合脂肪酸。 [0013] 优选地，将混合脂肪酸加入尿素乙醇溶液中，加热回流，低温包合得到混合液；将混合液过滤，滤液除去乙醇，调节滤液pH为酸性后加入正己烷萃取纯化，得到包合后的混合脂肪酸。 [0014] 优选地，将混合脂肪酸加入尿素乙醇溶液中，于80℃加热回流40min，待回流结束后，将混合液冷却至室温后，置于低温3～5℃下包合7.5～8.5h； [0015] 包合结束后，将混合液进行抽滤，取出滤液，除去乙醇，用硫酸调节pH至2～3，加入正己烷进行萃取，收集上层液，然后加入蒸馏水，将上层液调节至中性，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏，去除溶剂，得到包合后的混合脂肪酸。 [0016] 最优选地，混合脂肪酸加入尿素乙醇溶液回流结束，冷却至室温后，置于低温3～5℃下包合为8h。若在包合时，包合时间过短时，是不能将混合脂肪酸中的油酸完全包合，导致油酸得率低。 [0017] 在混合脂肪酸加入尿素乙醇溶液进行包合过程中，尿素与混合脂肪酸的质量比为1.7：1，即脲酯比为1.7：1。 [0018] 优选地，尿素乙醇溶液是尿素被乙醇溶解所得，乙醇为体积分数95％乙醇。 [0019] 优选地，所述尿素和95％乙醇的料液比为1：4～6。 [0020] 最优选地，所述尿素和95％乙醇的料液比为1：4.27，即醇脲比为4.27：1。 [0021] 在包合时间8h、脲酯比为1.7：1、醇脲比为4.27：1时，油酸的得率最高。其中，脲酯比为尿素包合过程中的尿素与混和脂肪酸质量比。醇脲比为尿素包合过程中的体积分数95％乙醇与尿素质量比。 [0022] 因为我们发现若在包合时，尿素的用量过少时，是不能将混合脂肪酸中的油酸完全包合，导致油酸得率低。当包合时间大于或者小于8h、脲酯比低于或者高于1.7：1、醇脲比低于或者高于4.27：1时，最终的油酸得率都低于脲酯比为1.7：1、醇脲比为4.27：1时的油酸得率。所以本发明在包合过程中是采用尿素对油酸进行富集，严格控制“脲酯比”和“醇脲比”，其中“脲酯比”和“醇脲比”都是与混合脂肪酸与尿素之间的用量相关。 [0023] 故本发明所提供的从猪油中富集油酸的方法中油酸富集的最佳工艺条件为：包合时间：8.00h、醇脲比：4.27：1，脲脂比：1.7：1。即在尿素包合过程中，包合时间为8h，乙醇与尿素质量比为4.27：1，尿素与混合脂肪酸的质量比为1.7：1的时候，油酸得率最大，为53.28％。 [0024] 优选地，富集得到的油酸经纯化得到纯化后的油酸；所述纯化的方法为：将富集得到的油酸进行分子蒸馏，除去残余的溶剂和饱和脂肪酸，得到纯化后的油酸。 [0025] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： [0026] 1、本发明提供了一种从猪油中富集油酸的方法，该方法具有提取工艺简单、设备成本低、油酸得率高的优点。利用本申请所提供的从猪油中富集油酸的方法从猪油中富集油酸的结果：在包合时间8h、脲酯比为1.7：1、醇脲比为4.27：1时，油酸的得率为53.28％。本发明采用单因素试验分别考察包合时间、脲酯比、醇脲比及对油酸得率的影响，利用响应面法分析并优化尿素包合法富集猪油中油酸的工艺，采用尿素包合法富集猪油中的油酸。在此基础上，本发明还对富集得到的油酸对高脂血症小鼠血脂代谢的影响进行了研究。本发明建立了高脂血症小鼠模型，对小鼠进行灌胃不同剂量油酸，灌胃四周后处死，收集血清并测定，血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL‑C)含量与模型组相比显著降低，高密度脂蛋白(HDL‑C)含量显著增加。证明摄入适量的油酸可以有效降低高脂血症小鼠血脂水平。 [0027] 2、本发明以猪油为原材料，采用尿素包合法对猪油中的油酸进行富集，用此条件下得到的油酸进行动物实验，考察其高血脂症小鼠的血脂代谢水平的影响，以期进一步丰富优质单不饱和脂肪酸资源，进一步开发猪油的食用方式，为合理利用猪油资源提供新的方式，将猪油的利用价值进一步增加。附图说明 [0028] 图1为本发明中响应面交互作用分析图，其中，A为包合时间与醇尿比交互作用对油酸得率影响应曲面图；B为包合时间与醇尿比交互作用对油酸得率影响等高线图；C为包合时间与脲酯比交互作用对油酸得率影响响应曲面图；D为包合时间与脲酯比交互作用对油酸得率等高线图；E为脲酯比与醇脲比交互作用对油酸得率影响应曲面图；F为脲酯比与醇脲比交互作用对油酸得率影响等高线图； [0029] 图2为本发明中油酸对小鼠血脂代谢影响，其中，A为油酸对高脂血症小鼠血清TC含量的影响；B为油酸对高脂血症小鼠血清TG含量的影响；C为油酸对高脂血症小鼠血清HDL‑C含量的影响；D为油酸对高脂血症小鼠血清LDL‑C含量的影响。 具体实施方式[0030] 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 [0031] 下面实施例中所用到的材料与仪器如下： [0032] (1)实验材料 [0033] 猪油为锦州医科大学食品与健康学院实验室自制。 [0034] 猪油的制备过程为：将猪肉脂肪组织进行整切洗涤，加热脂肪组织，使油脂溢出，趁热进行过滤，除去残渣，冷却后得到猪油。 [0035] 本发明对猪油经皂化、酸化制得混合脂肪酸，混合脂肪酸中包括油酸及其他脂肪酸。其中，其他脂肪酸中包括大部分的饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸。 [0036] 然后采用尿素包合法除去混合脂肪酸中大部分的饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸，从混合脂肪酸中富集，纯化得到油酸。 [0037] 从混合脂肪酸中富集油酸：用尿素包合法除去混合脂肪酸中大部分的饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸，富集，纯化得到油酸。 [0038] 具体的纯化的方法为：将富集得到的油酸进行分子蒸馏，除去残余的溶剂和饱和脂肪酸，得到纯化后的油酸。 [0039] 氢氧化钠、尿素、无水硫酸钠、95％乙醇、硫酸、氯化钠均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。 [0040] 正己烷、甲醇、石油醚均为色谱纯，购自国药集团化学试剂有限公司。 [0041] 总胆固醇试剂盒(96T)、甘油三酯试剂盒(96T)、低密度脂蛋白试剂盒(96T)、高密度脂蛋白试剂盒(96T)：南京建成生物科技有限公司；蛋黄粉：万邦化工科技有限公司；胆固醇、胆酸钠：食品级，佳味源实业有限公司。 [0042] (2)实验动物 [0043] 60只4周左右SPF级雄性昆明小鼠，由锦州医科大学动物实验中心提供；小鼠的体重为20～25g。 [0044] (3)实验设备 [0045] ESJ‑205‑S型电子天平：沈阳龙腾电子有限公司；恒温水浴锅：上海申胜生物技术有限公司；旋转蒸发仪：赛默飞世尔科技公司；气相色谱‑质谱联用仪：GC‑MS6800安捷伦科技(中国)有限公司；酶标仪：Readmax1900型光吸收全波长酶标仪(上海闪谱生物科技有限公司)。 [0046] 实施例1 [0047] 一种从猪油中富集油酸的方法，包括如下步骤： [0048] 1、混合脂肪酸的制备 [0049] 称取30g猪油，加入到100mL体积分数4％的氢氧化钠乙醇溶液中80℃加热回流40min，得到皂化液，即猪油与氢氧化钠乙醇溶液的混合液。在加热回流的过程中加入蒸馏水，使皂化液溶解，待皂化液冷却后，用体积分数20％硫酸调节pH＝3左右，将溶液移入分液漏斗，加入正己烷萃取。萃取结束后将萃取液加入蒸馏水将其冲洗至中性，再加入2g无水硫酸钠干燥，经滤纸过滤，收集滤液，将滤液用旋转蒸发仪旋蒸，去除溶剂，获得混合脂肪酸。 [0050] 其中，氢氧化钠乙醇溶液的配制方法为：称取4g氢氧化钠，将4g氢氧化钠溶于100mL乙醇溶液。 [0051] 20％硫酸的配制方法为：量取20mL硫酸溶液，将20mL硫酸溶液注入80mL蒸馏水中即可。 [0052] 2、尿素包合法富集油酸 [0053] 称取50mL的体积分数95％乙醇和10g的尿素配制成尿素乙醇溶液，将其置于圆底烧瓶中，于70℃水浴锅中搅拌回流，待尿素溶解后，加入5g上述制备的混合脂肪酸，于70℃继续搅拌回流40min，然后将混合液冷却至室温后，置于4℃下包合9h。 [0054] 包合结束后，将混合液立即进行抽滤，取出滤液，旋蒸除去乙醇，用体积分数20％硫酸调节pH至3，加入20mL的正己烷萃取，收集上层液，然后加入蒸馏水，将上层液调节至中性，用2g无水硫酸钠干燥，经滤纸过滤，收集滤液，将滤液进行旋蒸，去除溶剂，得到包合后的混合脂肪酸，混合脂肪酸中包括油酸及其他脂肪酸。 [0055] 猪油中油酸含量的测定的步骤如下： [0056] 精确称取50mg猪油于干燥洁净的25mL试管中，加入5mL正己烷(色谱纯)，混合使其溶解，再加入预先配制的0.8mol/L的氢氧化钾‑甲醇溶液2mL，混匀，于30℃恒温水浴加热15min至油珠完全溶解。取出试管竖直静置分层，加入0.5g无水硫酸钠，分层后用1mL针头过滤器吸取上层正己烷，经0.22μm滤膜过滤后，用进样针取1μL色谱进样瓶中进行GC‑MS分析，采用峰面积归一化法计算百分含量。 [0057] 其中，氢氧化钾‑甲醇溶液的配制方法为：以配置100mL的0.8mol/L的氢氧化钾‑甲醇溶液为例。具体的步骤为：称取0.8mol氢氧化钾即44.8g溶解于装有20mL甲醇的烧杯中，静置到室温后将溶液转移到100mL容量瓶中，用甲醇洗涤烧杯，洗涤液转移入容量瓶，重复两到三次，最后用甲醇加至100mL容量瓶的刻度线即可。 [0058] 气相色谱条件如下所示： [0059] 色谱柱：J&WDB‑5石英毛细柱30m×0.25mm×0.25μm；升温程序：150℃保持1min，以5℃/min升至210℃，保持3min，以5℃/min升至250℃；载气：高纯氦；流速1mL/min；分流比 10:1。电子轰击(EI)离子源；电子能量70eV；传输线温度250℃；离子源温度250℃。 [0060] 包合后混合脂肪酸中油酸含量的测定的步骤如下： [0061] 精确称取50mg包合后混合脂肪酸于干燥洁净的25mL试管中，加入5mL正己烷(色谱纯)，混合使其溶解，再加入预先配制的0.8mol/L的氢氧化钾‑甲醇溶液2mL，混匀，于30℃恒温水浴加热15min至油珠完全溶解。取出试管竖直静置分层，加入0.5g无水硫酸钠，分层后用1mL针头过滤器吸取上层正己烷，经0.22μm滤膜过滤后，用进样针取1μL放入色谱进样瓶中进行GC‑MS分析，采用峰面积归一化法计算百分含量。 [0062] 其中，氢氧化钾‑甲醇溶液的配制方法，以配置100mL的0.8mol/L的氢氧化钾‑甲醇溶液为例：称取0.8mol氢氧化钾即44.8g溶解于装有20mL甲醇的烧杯中，静置到室温后将溶液转移到100mL容量瓶中，用甲醇洗涤烧杯，洗涤液转移入容量瓶，重复两到三次，最后用甲醇加至容量瓶的刻度线即可。 [0063] 气相色谱条件如下所示： [0064] 色谱柱：J&W DB‑5石英毛细柱30m×0.25mm×0.25μm；升温程序：150℃保持1min，以5℃/min升至210℃，保持3min，以5℃/min升至250℃；载气：高纯氦；流速1mL/min；分流比10:1。电子轰击(EI)离子源；电子能量70eV；传输线温度250℃；离子源温度250℃。 [0065] 油酸得率(％)＝(包合后混合脂肪酸的质量×包合后油酸的含量)×100/(猪油混合脂肪酸的质量×猪油中油酸的含量)。 [0066] 经计算，油酸的得率为54.25％。 [0067] 实施例2 [0068] 一种从猪油中富集油酸的方法，包括如下步骤： [0069] 1、混合脂肪酸的制备 [0070] 称取30g猪油，加入到100mL体积分数4％的氢氧化钠乙醇溶液中80℃加热回流40min，得到皂化液，即猪油与氢氧化钠乙醇溶液的混合液。在加热回流的过程中加入蒸馏水，使皂化液溶解，待皂化液冷却后，用体积分数20％硫酸调节pH＝3左右，将溶液移入分液漏斗，加入正己烷萃取。萃取结束后将萃取液加入蒸馏水将其冲洗至中性，再加入2g无水硫酸钠干燥，经滤纸过滤，收集滤液，将滤液用旋转蒸发仪旋蒸，去除溶剂，获得混合脂肪酸。 [0071] 其中，氢氧化钠乙醇溶液的配制方法为：称取4g氢氧化钠，将4g氢氧化钠溶于100mL乙醇溶液。 [0072] 20％硫酸的配制方法为：量取20mL硫酸溶液，将20mL硫酸溶液注入80mL蒸馏水中即可。 [0073] 2、尿素包合法富集油酸 [0074] 称取62.5mL的体积分数95％乙醇和12.5g的尿素配制成尿素乙醇溶液，将其置于圆底烧瓶中，于70℃水浴锅中搅拌回流，待尿素溶解后，加入5g上述制备的混合脂肪酸，于70℃继续搅拌回流40min，然后将混合液冷却至室温后，置于4℃下包合7h。 [0075] 包合结束后，将混合液立即进行抽滤，取出滤液，旋蒸除去乙醇，用体积分数20％硫酸调节pH至3，加入20mL的正己烷萃取，收集上层液，然后加入蒸馏水，将上层液调节至中性，用2g无水硫酸钠干燥，经滤纸过滤，收集滤液，将滤液进行旋蒸，去除溶剂，得到包合后的混合脂肪酸，混合脂肪酸中包括油酸及其他脂肪酸。 [0076] 猪油中油酸含量的测定的步骤如下： [0077] 精确称取50mg猪油于干燥洁净的25mL试管中，加入5mL正己烷(色谱纯)，混合使其溶解，再加入预先配制的0.8mol/L的氢氧化钾‑甲醇溶液2mL，混匀，于30℃恒温水浴加热15min至油珠完全溶解。取出试管竖直静置分层，加入0.5g无水硫酸钠，分层后用1mL针头过滤器吸取上层正己烷，经0.22μm滤膜过滤后，用进样针取1μL色谱进样瓶中进行GC－MS分析，采用峰面积归一化法计算百分含量。 [0078] 其中，氢氧化钾‑甲醇溶液的配制方法为：以配置100mL的0.8mol/L的氢氧化钾‑甲醇溶液为例。具体的步骤为：称取0.8mol氢氧化钾即44.8g溶解于装有20mL甲醇的烧杯中，静置到室温后将溶液转移到100mL容量瓶中，用甲醇洗涤烧杯，洗涤液转移入容量瓶，重复两到三次，最后用甲醇加至100mL容量瓶的刻度线即可。 [0079] 气相色谱条件如下所示： [0080] 色谱柱：J&W DB‑5石英毛细柱30m×0.25mm×0.25μm；升温程序：150℃保持1min，以5℃/min升至210℃，保持3min，以5℃/min升至250℃；载气：高纯氦；流速1mL/min；分流比10:1。电子轰击(EI)离子源；电子能量70eV；传输线温度250℃；离子源温度250℃。 [0081] 包合后混合脂肪酸中油酸含量的测定的步骤如下： [0082] 精确称取50mg包合后混合脂肪酸于干燥洁净的25mL试管中，加入5mL正己烷(色谱纯)，混合使其溶解，再加入预先配制的0.8mol/L的氢氧化钾‑甲醇溶液2mL，混匀，于30℃恒温水浴加热15min至油珠完全溶解。取出试管竖直静置分层，加入0.5g无水硫酸钠，分层后用1mL针头过滤器吸取上层正己烷，经0.22μm滤膜过滤后，用进样针取1μL放入色谱进样瓶中进行GC－MS分析，采用峰面积归一化法计算百分含量。 [0083] 其中，氢氧化钾‑甲醇溶液的配制方法，以配置100mL的0.8mol/L的氢氧化钾‑甲醇溶液为例：称取0.8mol氢氧化钾即44.8g溶解于装有20mL甲醇的烧杯中，静置到室温后将溶液转移到100mL容量瓶中，用甲醇洗涤烧杯，洗涤液转移入容量瓶，重复两到三次，最后用甲醇加至容量瓶的刻度线即可。 [0084] 气相色谱条件如下所示： [0085] 色谱柱：J&W DB‑5石英毛细柱30m×0.25mm×0.25μm；升温程序：150℃保持1min，以5℃/min升至210℃，保持3min，以5℃/min升至250℃；载气：高纯氦；流速1mL/min；分流比10:1。电子轰击(EI)离子源；电子能量70eV；传输线温度250℃；离子源温度250℃。 [0086] 油酸得率(％)＝(包合后混合脂肪酸的质量×包合后油酸的含量)×100/(猪油混合脂肪酸的质量×猪油中油酸的含量)。 [0087] 经计算，油酸的得率为48.96％。 [0088] 实施例3 [0089] 一种从猪油中富集油酸的方法，包括如下步骤： [0090] 1、混合脂肪酸的制备 [0091] 称取30g猪油，加入到100mL体积分数4％的氢氧化钠乙醇溶液中80℃加热回流1h，得到皂化液，即猪油与氢氧化钠乙醇溶液的混合液。在加热回流的过程中加入蒸馏水，使皂化液溶解，待皂化液冷却后，用体积分数20％硫酸调节pH＝3左右，将溶液移入分液漏斗，加入正己烷萃取。萃取结束后将萃取液加入蒸馏水将其冲洗至中性，再加入2g无水硫酸钠干燥，经滤纸过滤，收集滤液，将滤液用旋转蒸发仪旋蒸，去除溶剂，获得混合脂肪酸。 [0092] 其中，氢氧化钠乙醇溶液的配制方法为：称取4g氢氧化钠，将4g氢氧化钠溶于100mL乙醇溶液。 [0093] 20％硫酸的配制方法为：量取20mL硫酸溶液，将20mL硫酸溶液注入80mL蒸馏水中即可。 [0094] 2、尿素包合法富集油酸 [0095] 称取60mL的体积分数95％乙醇和10g的尿素配制成尿素乙醇溶液，将其置于圆底烧瓶中，于70℃水浴锅中搅拌回流，待尿素溶解后，加入5g上述制备的混合脂肪酸，于70℃继续搅拌回流40min，然后将混合液冷却至室温后，置于4℃下包合7h。 [0096] 包合结束后，将混合液立即进行抽滤，取出滤液，旋蒸除去乙醇，用体积分数20％硫酸调节pH至3，加入20mL的正己烷萃取，收集上层液，然后加入蒸馏水，将上层液调节至中性，用2g无水硫酸钠干燥，经滤纸过滤，收集滤液，将滤液进行旋蒸，去除溶剂，得到包合后的混合脂肪酸，混合脂肪酸中包括油酸及其他脂肪酸。 [0097] 猪油中油酸含量的测定的步骤如下： [0098] 精确称取50mg猪油于干燥洁净的25mL试管中，加入5mL正己烷(色谱纯)，混合使其溶解，再加入预先配制的0.8mol/L的氢氧化钾‑甲醇溶液2mL，混匀，于30℃恒温水浴加热15min至油珠完全溶解。取出试管竖直静置分层，加入0.5g无水硫酸钠，分层后用1mL针头过滤器吸取上层正己烷，经0.22μm滤膜过滤后，用进样针取1μL色谱进样瓶中进行GC－MS分析，采用峰面积归一化法计算百分含量。 [0099] 其中，氢氧化钾‑甲醇溶液的配制方法为：以配置100mL的0.8mol/L的氢氧化钾‑甲醇溶液为例。具体的步骤为：称取0.8mol氢氧化钾即44.8g溶解于装有20mL甲醇的烧杯中，静置到室温后将溶液转移到100mL容量瓶中，用甲醇洗涤烧杯，洗涤液转移入容量瓶，重复两到三次，最后用甲醇加至100mL容量瓶的刻度线即可。 [0100] 气相色谱条件如下所示： [0101] 色谱柱：J&W DB‑5石英毛细柱30m×0.25mm×0.25μm；升温程序：150℃保持1min，以5℃/min升至210℃，保持3min，以5℃/min升至250℃；载气：高纯氦；流速1mL/min；分流比10:1。电子轰击(EI)离子源；电子能量70eV；传输线温度250℃；离子源温度250℃。 [0102] 包合后混合脂肪酸中油酸含量的测定的步骤如下： [0103] 精确称取50mg包合后混合脂肪酸于干燥洁净的25mL试管中，加入5mL正己烷(色谱纯)，混合使其溶解，再加入预先配制的0.8mol/L的氢氧化钾‑甲醇溶液2mL，混匀，于30℃恒温水浴加热15min至油珠完全溶解。取出试管竖直静置分层，加入0.5g无水硫酸钠，分层后用1mL针头过滤器吸取上层正己烷，经0.22μm滤膜过滤后，用进样针取1μL放入色谱进样瓶中进行GC－MS分析，采用峰面积归一化法计算百分含量。 [0104] 其中，氢氧化钾‑甲醇溶液的配制方法，以配置100mL的0.8mol/L的氢氧化钾‑甲醇溶液为例：称取0.8mol氢氧化钾即44.8g溶解于装有20mL甲醇的烧杯中，静置到室温后将溶液转移到100mL容量瓶中，用甲醇洗涤烧杯，洗涤液转移入容量瓶，重复两到三次，最后用甲醇加至容量瓶的刻度线即可。 [0105] 气相色谱条件如下所示： [0106] 色谱柱：J&WDB‑5石英毛细柱30m×0.25mm×0.25μm；升温程序：150℃保持1min，以5℃/min升至210℃，保持3min，以5℃/min升至250℃；载气：高纯氦；流速1mL/min；分流比 10:1。电子轰击(EI)离子源；电子能量70eV；传输线温度250℃；离子源温度250℃。 [0107] 油酸得率(％)＝(包合后混合脂肪酸的质量×包合后油酸的含量)×100/(猪油混合脂肪酸的质量×猪油中油酸的含量)。 [0108] 经计算，油酸的得率51.15％。 [0109] 本发明还对上述从猪油中富集油酸的方法进行了工艺优化，具体研究如下： [0110] (1)响应面法优化油酸富集工艺 [0111] 在单因素试验基础上，选取包合时间(A)、脲酯比(B)、醇脲比(C)为考察因素，以为油酸得率(Y)为响应值，利用Design‑Expert 8.0.6.1软件的Box‑Behnken中心组合设计原则，以油酸得率为评价指标进行三因素三水平的响应面优化分析，考察因素和水平编码见表1，试验设计方案及结果见表2，方差分析见表3和图1。其中，脲酯比为尿素包合过程中的尿素与混和脂肪酸质量比。醇脲比为尿素包合过程中的体积分数95％乙醇与尿素质量比。 [0112] 表1响应面分析因素水平设计 [0113] [0114] 表2响应面实验结果 [0115] [0116] 表3回归模型方差分析 [0117] [0118] [0119] 结合单因素试验的结果，以油酸得率(Y)为响应值，包合时间(A)、脲酯比(B)、醇脲比(C)作为自变量，进行试验，对实验数据进行多元回归拟合，进行通过回归分析，得到各因素与不饱和脂肪酸得率的方程式为：油酸得率＝55.85‑2.48*A‑1.95*B‑0.4500*AB‑2 2 2 0.7425*AC+2.04BC‑5.68*A‑4.10B‑5.06C。 [0120] 图1中的响应面曲线图反应2个因素之间交互作用的变化幅度，若2个因素之间交互作用明显，曲线变化幅度越大，等高线反应2各因素之间交互作用的显著情况，油酸得率A、B、C之间两两交互作用的响应面分析如图A、C、E。与P值相结合可得，两两因素交互作用显著程度顺序为AB＞AC＞BC。 [0121] 由表3可得，该二次方程模型方差分析模型显著(P<0.05)，失拟项P值为0.8470，不显著，说明模型差异不显著，证明该方程与试验的失拟较小，结果能更好反应试验的真实性。根据表得知A、B因素对于油酸得率影响显著(P<0.05)，由F值可知，各因素对油酸得率影响次序为：B＞A＞C，根据DesignExpert8.0.6给出的回归方程，得出油酸富集的最佳工艺条件为：包合时间：8.00h、醇脲比：4.27：1，脲脂比：1.7：1，在此条件下，得出油酸最大得率53.28％。 [0122] 上述结果表明：本发明所提供的从猪油中富集油酸的方法中油酸富集的最佳工艺条件为：包合时间：8.00h、醇脲比：4.27：1，脲脂比：1.7：1。即在尿素包合过程中，包合时间为8h，乙醇与尿素质量比为4.27：1，尿素与混合脂肪酸的质量比为1.7：1的时候，油酸得率最大，为53.28％。 [0123] 对比例1 [0124] 一种从油茶籽油中富集油酸的方法，包括如下步骤： [0125] 1、油茶籽油脂肪酸乙酯的制备 [0126] 取150mL无水乙醇于烧瓶中，加入2g氢氧化钠作催化剂，振荡溶解，再加入300mL油茶籽油，醇油摩尔比为8：1，在65℃下回流搅拌2h后，将样品置于分液漏斗中用蒸馏水洗涤，静置分层后，取上层备用。 [0128] 2、分子蒸馏工艺 [0129] 将原料在进料速率下进行蒸馏脱气、脱除水等极轻组分。一级脱气的条件为：预热温度60℃，进料速率300mL/h，系统压力100Pa，蒸馏温度70℃，刮膜转速150r/min。然后将一级脱气得到的物料重新加入进料器，在蒸馏温度100℃、蒸馏压力10Pa、进料速度150mL/h、刮膜转速180r/min条件下，进行分离。 [0130] 油酸含量的测定和得率的计算如下： [0131] 对分离得到的轻、重组分取样进行分析。以脂肪酸甲酯标准溶液的气相色谱保留时间定性，直接面积归一化法定量。色谱条件：毛细管柱AT‑FFAP(30m×0.25mm×0.25μm)，氢火焰离子检测器(FID)，柱温180℃，载气流速20μL/s，分流比50：1，汽化室温度210℃，检测室温度220℃，进样量1μL，氮气压力50kPa，氢气压力60kPa，空气压力50kPa。 [0132] 经计算，一级分子蒸馏重组分中油酸乙酯含量为88.3％，回收率为64.6％。二级分子蒸馏轻组分中油酸乙酯含量达到91.3％，总回收率为50.6％。 [0133] 对比例2 [0134] 一种从核桃中富集油酸的方法，包括如下步骤： [0135] 1、核桃仁的预处理 [0136] 将新鲜核桃仁烘干，并将其粉碎至20目备用。 [0137] 其中，新鲜核桃仁为陇东地区市售核桃仁。 [0138] 2、提取工艺 [0139] 利用HA121‑50‑06型超临界CO2萃取设备，进行提取。萃取釜容积为1L，压力为20MPa、温度为40℃、CO2泵频率为20L/h，萃取时间4h，采用萃取压力‑温度组合为20MPa、40℃。确定分离釜①的压力6MPa、温度50℃；分离釜②的压力4MPa、温度55℃。将预处理300g核桃仁投入萃取釜中，对萃取釜、分离釜、贮罐分别进行加热或冷却。当系统各部分达到设定温度后，开启CO2钢瓶，从CO2钢瓶出来CO2气体经净化器净化器进入0℃冷箱液化后，由高压调频柱塞泵送入预热器预热，经净化再进入萃取釜，升压到预定设置值使CO2成超临界流体，对核桃仁中的油酸进行萃取。 [0140] 油酸含量的测定和萃取率的计算如下： [0141] I核桃油样甲酯化 [0142] 取100mg油样10mL加入1mL乙醚溶解，加入1mL 0.14mol/L的KOH‑CH3OH溶液，摇匀静置10min，待甲酯化完全后加水至刻度分层，取上层溶液1μL准备进样。 [0143] II GC‑MS测定条件 [0144] 色谱条件：毛细管柱30.0m×0.25mm×0.25μm色谱柱；进样口温度250℃；柱温200℃，程序升温到40℃保持5min以后，以5℃/min升到290℃，保持10min；载气氦气；流速为恒流模式1mL/min，分流进样分流比为1：10，进样量为1mL。质谱条件：电子轰击(EI)源，离子源温度200℃，接口温度250℃；溶剂切除时间1.5min，检测器电压1.14kV，扫描质量范围30～500m/z。检索谱库NIST02。 [0145] III油酸萃取率计算方法： [0146] 油酸萃取率根据下式计算： [0147] 萃取率＝G1/G2×100％ [0148] 式中：G1为样品质量与残料质量之差/g；G2为样品总质量/g。 [0149] 经计算，核桃油酸的萃取率为54.24％。 [0150] 对比例1中使用分子蒸馏工艺从油茶籽油中富集油酸，在制备过程中使用到了的设备包括酯化装置,万能恒温水浴锅、DF‑101S集热式恒温加热磁力搅拌器、Laborota4000型旋转蒸发器、汉维MD‑S80型分子蒸馏装置、,CH‑2高纯氢气发生器、CA‑2型静音无油空气泵,。对比例2中使用HA121‑50‑06型超临界CO2萃取设备进行提取。本发明在进行油酸的富集过程中使用到了的设备包括ESJ‑205‑S型电子天平、恒温水浴锅、旋转蒸发仪。 [0151] 与对比例1与对比例2相比，本发明所提供的方法中使用的仪器都是实验室中常规的仪器，不需要借助其他成本较高的设备就可以完成从猪油富集油酸。而对比例1与对比例2的方法均需要成本较高设备才可以完成对油酸的提取，不能在实验室中借助常规的仪器完成实验，对设备的要求较高。比如，对比例1中需要高成本的设备：汉维MD‑S80型分子蒸馏装置和CH‑2高纯氢气发生器才可以进行油酸的提取；对比例2中需要的高成本的设备： HA121‑50‑06型超临界CO2萃取设备才可以进行油酸的提取,。 [0152] 对比例1从油茶籽油中富集油酸的方法中的提取工艺包括油茶籽油脂肪酸乙酯的制备以及分子蒸馏工艺。其中，分子蒸馏工艺不仅需要借助高成本的设备才可以完成，而且需要进行多次分子蒸馏才可以得到高纯度的目标产物。对比例2中从核桃中富集油酸的方法中的提取工艺不仅需要借助高成本的超临界CO2萃取设备才可以完成，而且在萃取操作时，需要进行的操作步骤复杂，且步骤比较多。本发明在进行油酸的富集方法中的提取工艺包括混合脂肪酸的制备以及尿素包合法富集油酸。只需要将猪油经皂化、酸化制得混合脂肪酸；再利用尿素包合法除去混合脂肪酸中大部分的饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸，富集，纯化得到油酸。本发明的提取工艺不仅不需要借助成本较高的设备就可以完成，并且操作步骤简单、易操作。 [0153] 与与对比例1与对比例2相比，本发明所提供的方法中的提取工艺简单，易操作和完成，使用的设备少且设备成本低。 [0154] 综上，本发明所提供的方法富集得到的油酸的得率略高于对比例1，与对比例2的得率相近。但是上述对比例1和对比例2的两种方法均需要成本较高设备例如高纯氢气发生器、超临界萃取设备等，设备成本高且对设备要求较高。与以上两种方法对比，本申请所提供的从猪油中富集油酸的方法中的工艺简单，所需设备较少，设备成本较低。在油酸得率相同的情况下，本发明所提供的方法只所需要的成本远远低于对比例1与对比例2，并且本发明的提取工艺简单，易操作，只需在实验室借助常规的仪器便可完成，较大程度上节约了设备成本人力成本、原料成本和时间成本。 [0155] 本发明采用上述最佳的工艺条件从猪油中富集油酸，即实施例1。并且，采用实施例1所制备的油酸对高脂小鼠的代谢影响进行了研究，具体的研究如下： [0156] (1)实验动物分组 [0157] 将600只SPF级昆明小鼠饲养在24℃环境中，将它们随机分为6组，每组10只。具体的分组为：空白对照组、高脂模型组、低剂量油酸组、中剂量油酸组、高剂量油酸组、药物对照组。各组小鼠均先适应性饲养，饲喂基础饲料一周后，空白对照组和药物对照组的小鼠饲喂基础饲料，连续饲喂4周；其他4组的小鼠均饲喂高脂饲料，连续饲喂4周，诱导高脂血症小鼠模型。空白对照组的小鼠饲喂基础饲料，高脂模型组的小鼠饲喂高脂饲料，低剂量油酸组、中剂量油酸组、高剂量油酸组的小鼠每天分别灌胃2g/kg、4g/kg、8g/kg的油酸，药物对照组的小鼠每天灌胃5mg/kg的辛伐他汀，连续灌胃四周。各组小鼠均自由饮食饮水直至灌胃结束。 [0158] 其中，高脂饲料按照质量百分比由70％基础饲料、15％猪油、10％蛋黄粉、3％胆固醇和2％胆酸钠组成。 [0159] (2)小鼠指标的检测 [0160] 灌胃结束后所有小鼠均禁食不禁水24h，称量每只小鼠体重后，摘眼球取血放入EP管中静置2h，以6000r/min离心15min，收集血清于–20℃冰箱保存待用。分别参照南京建成生物工程研究所试剂盒上的方法检测血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL‑C)、高密度脂蛋白(HDL‑C)的含量。结果见图2。 [0161] 由图2可知，高脂模型组小鼠血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL‑C)极显著高于空白组(P＜0.01)，而高密度脂蛋白(HDL‑C)极显著低于空白组(P＜0.01)，证明高脂血模型建造较为成功，这也表明长期摄入脂肪含量高的食物，容易患高脂血症等相关疾病。 [0162] 与高脂模型组相比，药物对照组总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL‑C)极显著降低(P＜0.01)，高密度脂蛋白(HDL‑C)极显著升高(P＜0.01)。不同剂量油酸组(包括低剂量油酸组、中剂量油酸组、高剂量油酸组)的小鼠与高脂模型组的小鼠相比，血清指标有不同程度的变化；小鼠血清中，甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL‑C)的低剂量油酸组、中剂量油酸组、高剂量油酸组均极显著低于高脂模型组(P＜0.01)且随油酸灌胃剂量的增大而呈现降低的趋势。与高脂模型组相比，低剂量油酸组、中剂量油酸组、高剂量油酸组的高密度脂蛋白(HDL‑C)水平呈现先升高后降低的趋势。说明适量油酸的摄入可以降低高脂血症小鼠的血脂水平，改善血清的相关指标，降低高脂血症发病风险。 [0163] 上述结果表明：适量的油酸干预可以有效降低高脂血症小鼠的血脂水平，抑制体重的增加且预防由于高脂饮食引起的肥胖和高脂血症带来的危害。 [0164] 本发明以猪油为原料，采用尿素包合法对猪油中的油酸进行富集，提供了一种从猪油中富集油酸的方法。该方法具有提取工艺简单、设备成本低、油酸得率高的优点。并且，本发明通过单因素和响应面相结合探究了包合时间、脲脂比、醇脲比对油酸富集结果的影响，得到结果在条件为包合时间、脲酯比为1.7：1、醇脲比4.27：1为时，油酸得率为53.28％。 [0165] 在上述基础上，本发明采用上述最佳的工艺条件从猪油中富集的油酸，研究其对高脂血症小鼠的降血脂效果：本发明通过建立高脂血症小鼠模型，对小鼠进行灌胃不同剂量油酸，灌胃四周后处死，收集血清并测定，血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL‑C)的含量与高脂模型组相比显著降低，高密度脂蛋白(HDL‑C)的含量显著增加。证明摄入适量的油酸可以有效降低高脂血症小鼠血脂水平。 [0166] 本发明提供了一种从猪油中富集油酸的方法，该方法具有提取工艺简单、设备成本低、油酸得率高的优点。利用本申请所提供的从猪油中富集油酸的方法从猪油中富集油酸的结果：在包合时间8h、脲酯比为1.7：1、醇脲比为4.27：1时，油酸的得率为53.28％。并且，本申请还研究油酸对高脂血症小鼠血脂代谢的影响。由研究结果可知：从猪油中富集的油酸能够改善由于饮食不当而引起的血脂增高，对高脂血症具有较好的预防作用，可以作为一种优质的具有降血脂功能的食品资源，进行进一步的开发，并且丰富猪油在日常生活的食用途径。 [0168] 尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。 [0169] 显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含包合这些改动和变型在内。 |
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