[0001] 本发明涉及精油提取工艺技术领域，特别涉及一种从香橼叶中提取高含量含柠檬醛的精油提取方法。

[0002] 香橼是芸香科柑橘属植物香橼和药材香橼的统称，来源于枸橼Citrus medica L.与香圆Citrus wilsonii Tanaka，其药用部位为成熟干燥果实，具有理气化痰，止呕消肿，疏肝健脾等多种功效。此外，香橼的根、叶、花均可入药，为我国柑橘属名贵中药材。香橼在古代以枸橼为主流品种，自1963年后历版《中国药典》，枸橼仍一直都是药材香橼的基原植物，且药食同源，为历代医家重视。香橼香气浓郁，在古代常用作香料物质，《证类本草》称其“香气馥列”；在西方，香橼可被用于治疗消化不良、抗菌防腐及驱赶蚊虫等。据现代研究表明，香橼主要成分有精油类、黄酮类、生物碱等化合物，具有抗菌、抗氧化、抗炎等药理活性。

[0003] 香橼作为药食两用原材料，始列在2016年国家卫生计生委发布的《既是药品又是食品的名单》中，另外，香橼(CITRUS MEDICA LIMONUM)花/叶/茎/果/果油/提取物等均已被列入《已使用化妆品原料目录(2021年)版》中，可作为药品、食品、香料、香精、化妆品的优质原料。目前，香橼的开发利用主要在香橼果实，如以香橼果切片晒干制作药材，或利用香橼果制备饮料、蜜饯、罐头等，而香橼叶中的芳香油却鲜少有人去开发利用，香橼树枝繁叶茂以及每年修枝整形留下大批量的香橼叶被当成废弃物扔掉，若能合理开发利用香橼叶中所含有效成分，不仅促进香橼产业链的延伸以及发展，又能增加香橼树的经济附加值。同时在“中国香橼皮精油制取及其在卷烟中的应用[R].胡延奇等.香料香精化妆品.2021(03)：6‑14”中提到香橼干皮精油得率0.35％，香橼鲜皮精油得率0.33％，其精油提取率较低。因此，本研究通过响应面法和单因素试验设计优法香橼叶水蒸汽蒸馏提取精油的工艺条件，并对该条件下提取的香橼叶中化学成分进行鉴定，以期为后续深入剖析香橼叶中化学物质基础提供依据。

[0004] 针对现有技术的上述缺陷，本发明提出一种从香橼叶中提取高含量含柠檬醛的精油提取方法，以解决上述背景技术提出的问题。

[0005] 为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

[0006] 一种从香橼叶中提取高含量含柠檬醛的精油提取方法，包括以下步骤：

[0007] S1、预处理：将100～300g新鲜的香橼叶洗净、阴干时间0～96h后剪碎备用；

[0008] S2、蒸馏：取经步骤S1处理后的香橼叶，按照料液比1:7～13加入蒸馏水，在100～300℃的蒸馏温度下计算蒸馏时间，按待水沸腾后蒸馏30～360min，收集油水混合物；

[0009] S3、干燥：将步骤S2制得的油水混合物中加入总质量0.1～0.5倍量的无水硫酸钠，后过滤去除硫酸钠晶体，即得香橼叶精油。

[0010] 优选地，步骤S1中阴干时间为47h。

[0011] 优选地，步骤S2中料液比为1:12，蒸馏温度为221℃，蒸馏时间215min。

[0012] 优选地，该制备方法得到的香橼叶精油提取率为0.62％。

[0013] 优选地，该制备方法得到的香橼叶精油中柠檬醛占总含量的32.169％。

[0014] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种从香橼叶中提取高含量含柠檬醛的精油提取方法，优化使用水蒸气蒸馏法从香橼叶中提取精油的工艺，通过单因素试验和星点响应面法确定香橼叶精油的最佳提取工艺，并利用GC‑MS法对香橼叶精油进行定性分析，鉴定香橼叶精油中的各化学组分及其相对百分含量。最终得到香橼叶精油的最佳提取工艺条件为阴干时间47h、料液比1:12、蒸馏时间215min和蒸馏温度221℃，香橼叶精油提取率为0.62％，同时鉴定出72种成分，主要成分中Z‑柠檬醛与E‑柠檬醛占比32.169％。本发明方法操作简单，易于实施，且制得的香橼叶精油提取率高。
附图说明

[0015] 图1为阴干时间对香橼叶精油提取率的影响；

[0016] 图2为料液比对香橼叶精油提取率的影响；

[0017] 图3为蒸馏时间对香橼叶精油提取率的影响；

[0018] 图4为蒸馏温度对香橼叶精油提取率的影响；

[0019] 图5为阴干时间和料液比对香橼叶精油提取率的影响；

[0020] 图6为阴干时间和蒸馏时间对香橼叶精油提取率的影响；

[0021] 图7为阴干时间和蒸馏温度对香橼叶精油提取率的影响；

[0022] 图8为料液比和蒸馏温度对香橼叶精油提取率的影响；

[0023] 图9为蒸馏时间和蒸馏温度对香橼叶精油提取率的影响；

[0024] 图10为料液比和蒸馏温度对香橼叶精油提取率的影响；

[0025] 图11为总离子流色谱图；

[0026] 图12为香橼叶对单增李斯特菌的抑菌圈；

[0027] 图13为香橼叶对肠炎沙门氏菌的抑菌圈。

[0028] 下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

[0029] ZNHW型数显电热套购自上海予申有限公司；

[0030] 2L/29#精油提取器购自上海门融星生物科技有限公司；

[0031] Agilent 7820A‑Agilent 5977E型气相色谱－质谱联用仪(GC‑MS)购自美国安捷伦科技有限公司；

[0032] JJ324BC型万分之一天平购自双杰测试仪器厂。

[0033] 试验例1单因素试验设计—阴干时间考察

[0034] 按照2020年版《中国药典》精油测定法“甲法”，采用最佳提取工艺条件，对香橼叶精油进行提取，每种药材试验均重复3次。取采摘后的新鲜香橼叶在阴凉通风处放置0h、24h、48h、72h、96h后，把叶片剪碎，分别称取100g香橼叶碎，加入12倍量蒸馏水，220℃下水蒸气蒸馏3h，重复3次试验，收集油水混合物，加入适量无水硫酸钠干燥，过滤去除硫酸钠后测量精油体积，计算提取率，精油提取率(％)＝精油体积(mL)/植物原料质量(g)×100％。

[0035] 结果：香橼叶采收回来经48h的放置阴干，叶片出油率整体呈上升趋势，放置72h后的香橼叶出油率大于0h的叶片，可能因为香橼叶含水率随着放置阴干时间在前72h内呈快速下降，72h后存放在细胞油囊中的精油会慢慢挥发出来，阴干时间越长，挥发损失的精油量也逐渐增大，因此，综合考选择香橼叶放置阴干的时间范围为24‑48h。(详见图1)[0036] 试验例2单因素试验设计—料液比考察

[0037] 按照2020年版《中国药典》精油测定法“甲法”，采用最佳提取工艺条件，对香橼叶精油进行提取，每种药材试验均重复3次。分别取阴干2天的香橼叶，将香橼叶片剪碎，称取100g香橼叶碎，按料液比1:7、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13加入蒸馏水，220℃下水蒸气蒸馏
3h，重复3次试验，收集油水混合物，加入适量无水硫酸钠干燥，过滤去除硫酸钠后测量精油体积，计算提取率，精油提取率(％)＝精油体积(mL)/植物原料质量(g)×100％。

[0038] 结果：随着料液比/倍的逐渐增大，香橼叶精油的提取率先上升后下降。当料液比/倍在7‑10倍时，香橼叶精油提取率变化不明显；当料液比/倍在10‑12倍时，香橼叶精油提取率快速上升；当料液比/倍大于12倍时，香橼叶精油提取率缓慢减小，所以综合考虑选择料液比/为1:12。(详见图2)

[0039] 试验例3单因素试验设计—蒸馏时间考察

[0040] 按照2020年版《中国药典》精油测定法“甲法”，采用最佳提取工艺条件，对香橼叶精油进行提取，每种药材试验均重复3次。分别取阴干2天的的香橼叶，将香橼叶片剪碎，称取100g香橼叶碎，分别加入12倍量蒸馏水，220℃下水蒸气蒸馏，待水沸腾后开始计时，蒸馏30、60、120、180、240、360min，测定每个时间段香橼叶的精油得率，计算提取率，重复3次试验，收集油水混合物，加入适量无水硫酸钠干燥，过滤去除硫酸钠后测量精油体积，计算提取率，精油提取率(％)＝精油体积(mL)/植物原料质量(g)×100％。

[0041] 结果：在蒸馏30min左右开始出油，出油速度急剧变大，直至蒸馏180min出油量最高，之后香橼叶精油的提取率慢慢下降直至趋于平缓，可能是由于蒸馏时间过长收集器中的少部分精油挥发，因此最佳蒸馏时间为180min。(详见图3)

[0042] 试验例4单因素试验设计—蒸馏温度的考察

[0043] 按照2020年版《中国药典》精油测定法“甲法”，采用最佳提取工艺条件，对香橼叶精油进行提取，每种药材试验均重复3次。分别取阴干2天的的香橼叶，将香橼叶叶片剪碎，称取100g香橼叶碎，加入12倍量沸水，分别于100、140、180、220、260、300℃下水蒸气蒸馏120min，每个蒸馏温度重复3次试验，收集油水混合物，加入适量无水硫酸钠干燥，过滤去除硫酸钠后测量精油体积，计算提取率，精油提取率(％)＝精油体积(mL)/植物原料质量(g)×100％。

[0044] 结果：当蒸馏温度为140～220℃之间时，香橼叶精油提取率快速上升，当蒸馏温度为220℃时，精油提取率达到最大值，当蒸馏温度在260～300℃之间时，香橼叶精油的出油率剧烈减少，可能是香橼叶精油在此温度下易挥发，因此最佳蒸馏温度为220℃。(详见图4)[0045] 试验例5响应面试验设计

[0046] 根据单因素试验结果，进行Box‑Behnken响应面法试验设计，以香橼叶精油提取率(Y)为响应值，阴干时间/h(X1)、料液比(X2)、蒸馏时间/min(X3)和蒸馏温度/℃(X4)为考察因素，设计四因素五水平的Box‑Behnken响应面优化试验。对香橼叶精油提取工艺进行优化，每组试验均重复3次。因素水平见表1。

[0047] 表1试验因素水平及编码表

[0048] Tab.1Range of the experimental factors and codes

[0049]

[0050] 根据表1的试验因素水平及编码设计试验，按照2020年版《中国药典》精油测定法“甲法”对香橼叶精油进行提取，响应面中心组合设计试验方案及结果见表2。

[0051] 表2星点响应面试验设计及结果

[0052] Tab.2Star point response surface Design of experiments and results[0053]

[0054] 根据试验结果，得到关于编码值的回归方程：

[0055] 提取率Y％＝0.6‑0.01*X1+0.017*X2+0.045*X3+6.67E‑003*X4‑5.00E‑003*X1*X2+0.014*X1*X3+1.25E‑003*X1*X4+5.00E‑003*X2*X3+0.013*X2*X4‑3.75E‑003*X3*X4‑0.046*
2 2 2 2
X1‑9.583E‑003*X2‑0.041*X3‑0.021*X4。

[0056] 对拟合的方程进行方差分析，结果见表3。由表3可知，模型P＜0.0001，表明该模型具有极显著性；失拟项P＝0.4538(＞0.05)，差异不显著，回归方程具有较好的拟合性，说明2
其他因素对试验结果干扰小，此模型建模成功。方程模型相关系数R ＝0.9608，校正系数
2
Radj ＝0.8871，表明96.08％的试验数据可用该模型进行解释，该模型与实际情况拟合较
2 2 2
好，该回归方程可用于优化香橼叶精油。因素X2、X3及二次项X1 、X3 、X4 具有极显著性(P＜
0.01)，交互项X1X3显著，其他互项对精油提取率影响不显著。从P值以及F值可以看出，4个因素对香橼叶精油提取率影响的大小顺序为：X3(蒸馏时间)＞X2(料液比)＞X4(蒸馏温度)＞X1(阴干时间)。

[0057] 表3方差分析

[0058] Tab.3Variance Analysis

[0059]

[0060] 注：*表示差异显著(0.01＜P＜0.05)；**表示差异极显著(P＜0.01)。

[0061] 对上述模型进行分析，得到各因素之间交互作用对精油得率影响的响应曲面图(详见图5～10)。响应曲面的陡峭和平缓程度与各因素交互作用的强弱呈正相关。阴干时间(X1)与蒸馏时间(X3)的三维响应面图曲线较陡，表明二者的交互作用对得率的影响明显，结合方差结果F值大小可得，交互项对香橼叶精油提取率的影响为：X1X3＞X2X4＞X2X3＞X1X2＝X2X3＞X3X4。

[0062] 结果：回归模型预测得到香橼叶精油的最佳提取工艺条件为阴干时间为46.59h、料液比11.98:1、蒸馏时间215.14min、蒸馏温度221.08℃，在此条件下，香橼叶精油提取率为0.625％，考虑到实际操作的方便性，将最佳工艺条件修正为阴干时间为47h、料液比12:1倍、蒸馏时间215min、蒸馏温度221℃。在此条件下，进行3次验证试验，得到的实际提取率为0.62％，与理论预测值相比只相差0.05％，说明该回归方程能较准确地反映各因素对香橼叶精油提取率的影响，可用于香橼叶精油提取工艺的优化。所得的香橼叶精油呈透明黄绿色，气味浓郁，类似柠檬又夹带花香气息。

[0063] 试验例6香橼叶精油化学成分分析

[0064] 6.1试验方法

[0065] 使用GC‑MS法对香橼叶精油进行定性分析，GC作为进样系统，将待测样品分离后直接导入质谱MS系统进行检测，其中GC条件：使用VF‑Wams色谱柱(0.25mm×30m，0.25μm)，初始温度为50℃，保持1min，然后以3℃/min速率上升至100℃，保持1min，再以5℃/min速率上升至160℃，继续以10℃/min速率上升至230℃保持1min。流速1ml/min，进样口温度230℃，分流比20：1。

[0066] MS条件：离子源为EI源，离子源温度230℃，四极杆温度150℃，电子能量70eV，接口温度230℃，倍增管电压1043V，采集类型为全扫描，质量范围30‑500amu。

[0067] 6.2试验结果如表4所示

[0068] 表4香橼叶、果精油化学成分GC‑MS比较分析结果

[0069] Tab.4GC‑MS comparative analysis results of chemical components of essential oils from leaves and fruits of Citrus media L.

[0070]

[0071]

[0072]

[0073] 总离子流色谱图详见图11，从表4可知，通过GC‑MS获得的数据，经过质谱计算机数据系统检索标准质谱库(质谱数据库NIST14，FFNSC3)，鉴定了香橼叶精油中的各化学组分，按峰面积归一化法得到各组分的相对百分含量。香橼叶精油的化学成分大多集中在保留时间3～25分钟之间，通过和质谱数据库数据比对，初步鉴定出72种化学成分，占色谱总流出物相对含量的99.96％；从化合物类型来看，香橼叶主要成分为烯、醇、醛类化合物，其中烯类化合物叶精油分别为19种；醇类化合物分别为20种；醛类化合物分别为11。柠檬醛(Z‑柠檬醛和E‑柠檬醛)为香橼叶精油含量最高的成分，总占比为32.169％，它是一类单萜化合物，具有浓郁的柠檬气味，为GB 2760‑96规定允许使用的食用香料。

[0074] 试验例7香橼叶精油的抑菌和杀菌效果

[0075] 7.1试验方法

[0076] 7.1.1菌种活化与菌悬液制备

[0077] 用灭菌接种环分别挑取细菌或真菌株于营养琼脂平板上划线培养，细菌置于恒温培养箱37℃下培养24h。然后挑取单菌落接种于营养琼脂斜面培养基上扩大培养，继续按照上面的条件培养，获得活化菌体。从活化的菌体斜面上挑取一环菌体接种于相应液体培养基中，放入恒温振荡培养箱培养至对数生长期，分别吸取以上培养菌液，加入液体培养基稀6 7
释至菌落数为10～10CFU/m L，备用。

[0078] 7.1.2抑菌圈测定

[0079] 采用纸片琼脂扩散法，在无菌的操作台用移液枪吸取精油15μL滴于无菌滤纸片(d＝6mm)上，待纸片充分吸收后贴在已涂布的各菌液培养基平板上，并标记好各药液的名称，每个菌进行3次重复，以无菌水为阴性对照，左氧氟沙星为肠炎沙门氏菌的阳性对照,氨苄青霉素为单增李斯特菌阳性对照；细菌培养条件为恒温培养箱37℃中培养24h。培养结束后，观察并记录抑菌圈的有无以及直径大小作为判断敏感度高低的标准，采用十字交叉法测量抑菌圈直径大小，取其平均值作为测定结果(详见图12、图13)。结果标准为：抑菌圈直径大于20mm时为极敏、直径在15～20mm之间时为高敏，在10～15mm之间的为中敏，抑菌圈直径小于10mm的为低敏。

[0080] 7.1.2最小抑菌浓度(MIC)测定

[0081] 采用微量二倍稀释法，在96孔板的前三排即A/B/C三排每孔中加入空白肉汤100μL，在第1孔加入配好的药液，对药物进行二倍稀释，即第一孔加入药液后用移液枪充分吹打(至少三次以上)使药物与液体培养基充分混匀，然后吸取100μL加入第二孔再充分吹打使之与液体培养基充分混匀，照此重复直至最后一孔，吸取100μL弃去，再在每一孔中加入稀释好的菌液100μL，使其精油浓度梯度稀释；再在同一块板上的E排上做一排阴性对照(仅加空白肉汤不加菌液)和在G排上做一排阳性对照(加菌液不加药液)。每个菌重复三次，待培养结束后使用酶标仪测定96孔板内各溶液的吸光值，抑菌率达到80％的样品浓度就为该样品对该菌的MIC。

[0082] 7.1.3最小杀菌浓度(MBC)测定

[0083] 采用琼脂培养基平板法，从大于MIC的各孔分别吸取0.1ml，倾倒于相应平皿上，按照具体菌种培养条件培养一定时间后观察菌体生长情况，平皿上菌落数小于5个的最小稀释度的药物浓度即为最低杀菌浓度(MBC)。

[0084] 7.2试验结果

[0085] 抑菌圈数据如表5和表6所示；MIC和MBC数据如表7所示。

[0086] 表5对单增李斯特菌的抑菌圈直径

[0087] 受试菌种 抑菌圈直径(mm)单增李斯特菌 21.52±0.13
阳性对照 37.74±0.36
阴性对照 无

[0088] 表6对肠炎沙门氏菌的抑菌圈直径

[0089] 肠炎沙门氏菌 16.84±0.29阳性对照 32.56±0.32
阴性对照 无

[0090] 从表5和表6可知，香橼叶精油对两种菌都具有抑制效果，其中对单增李斯特菌敏感性为极敏，对肠炎沙门氏菌为高敏。

[0091] 表7香橼叶、果精油的MIC值与MBC值

[0092] 受试菌种 MIC(mg/mL) MBC(mg/mL)单增李斯特菌 0.025 0.1
肠炎沙门氏菌 0.025 0.1

[0093] 从表7可知，香橼叶精油对单增李斯特菌和肠炎沙门氏菌最小抑菌浓度分别为0.025mg/mL和0.025mg/mL，最小杀菌浓度分别为0.1mg/mL和0.1mg/mL，表明香橼叶精油具有抑菌和杀菌作用。

[0094] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。