一种乳香挥发油及其提取方法和应用 |
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| 申请号 | CN202311571868.2 | 申请日 | 2023-11-23 | 公开(公告)号 | CN117603759A | 公开(公告)日 | 2024-02-27 |
| 申请人 | 河北万邦复临药业有限公司; | 发明人 | 葛跃; 谢秋芳; 张玉民; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及天然 植物 提取 产物技术领域，具体公开一种乳香挥发油及其提取方法和应用。本发明采用复合酶解‑琼脂提取的思路，在酶解过程中通过配合 表面活性剂 和 金属离子 溶液，结合超声工艺，使复合酶中绝大部分乳香挥发油溶于酶解液中；进一步在琼脂提取时以丙 酮 和甘油作为辅助 试剂 ，丙酮和复合酶中β‑葡聚糖酶协同组用，通过改变琼脂结构使琼脂在较低 温度 下溶解并形成半胶体状态，甘油的加入可以使乳香原料和琼脂充分混匀，还能与琼脂协同作用，使复合酶和未发生酶解反应或酶解反应不彻底的反应底物发生二次酶解反应，琼脂提取辅以 微波 加热，促进乳香细胞内挥发油迅速释放；通过本发明提供的特定的提取工艺，极大地提高了提取效率和得油率。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种乳香挥发油的提取方法，其特征在于，包括如下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种乳香挥发油及其提取方法和应用技术领域背景技术[0002] 乳香来源于橄榄科小乔木卡氏乳香树和橄榄科小乔木卡氏乳香树同属植物的皮部树脂。乳香的主要产地包括非洲的索马里、埃塞俄比亚及阿拉伯半岛南部、土耳其、利比亚、苏丹和埃及等地，是印度、中国和阿拉伯等地区广泛应用的传统药物。 [0003] 乳香表面呈黄白色，半透明，久存则颜色加深，质脆，遇热软化，破碎面有玻璃样或蜡样光泽。乳香主要含挥发油、树脂和树胶等成分，具有活性、消肿、止痛等功效，其潜力已经得到广泛认可，尤其是在抗炎、杀菌、神经调节和抗肿瘤方面的应用。 [0004] 挥发油属于乳香的重要成分之一，研究表明乳香挥发油对某些疾病具有良好的疗效。但是由于乳香中挥发油含量较低，因此需要通过提取方法来提取出乳香中的挥发油。目前，对于乳香挥发油的提取方法大多采用水蒸气蒸馏法或溶剂萃取法，但是这些方法存在收油率低、成本高、存在巨大的资源浪费等问题。因此，提供一种乳香挥发油的提取方法以提高得油率具有重要意义。 发明内容[0005] 针对现有技术中乳香挥发油在提取过程中得油率低的问题，本发明提供一种乳香挥发油及其提取方法和应用。 [0006] 为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是： [0007] 本发明第一个方面提供一种乳香挥发油的提取方法，包括如下步骤： [0009] 步骤2、将所述酶解液升温至45℃‑48℃，加入琼脂、丙酮和甘油，静止15min‑30min后，微波加热至93℃‑95℃下进行微波提取，收集馏出液，萃取，干燥，减压浓缩，得所述乳香挥发油； [0011] 所述金属离子溶液为含有钙离子和镁离子的金属离子溶液； [0012] 所述表面活性剂为Tween 20和Triton X‑100的混合物。 [0013] 相对于现有技术，本发明提供的乳香挥发油的制备方法，首先利用特定的酶解液、表面活性剂和金属离子溶液对乳香原料进行酶解，其中，复合酶中纤维素酶、半乳糖醛酸酶和蛋白酶复合使用有利于坏细胞壁，提高酶解效率；进一步，发明人通过大量筛选发现，β‑葡聚糖酶的添加，有利于与其他三种酶作用，使酶解反应更彻底；特定的表面活性剂添加能提高乳香原料和复合酶的接触面积，增加酶解效率；本发明在研究过程中还添加了特定的金属离子，表面活性剂的添加有利于分散钙离子和镁离子，钙镁离子能与乳香原料中一些无机物反应从而提高其流动性，进而提高酶促反应的进行，钙镁离子与复合酶结合，通过调整酶的构象进而提高复合酶的稳定性与催化效果，钙镁离子还能够与乳香中的多糖、蛋白质等发生络合反应，不仅可以改变乳香原料的分子结构，提高酶解效率，钙镁离子还能通过与复合酶和乳香原料的结合，提高乳香原料和复合酶的接触面积，充分发挥乳香原料和复合酶之间的相互作用，极大地提高乳香挥发油的提取率；在酶解过程中，本发明辅助采用了超声的工艺，超声波的空化作用和震动作用有利于提高细胞壁的破坏率，还能加速乳香原料中的乳香挥发油充分溶于溶剂中，还进一步降低了酶解温度，提高乳香挥发油的提取率； [0014] 本发明对制备得到的酶解液进行进一步处理，在其中加入了琼脂、丙酮和甘油，其中，琼脂在水中能够形成半胶体状态，具有极高的稳定性，其通过形成三维网状结构，有利于吸附乳香挥发油，降低乳香挥发油的损失率；然而，琼脂在较低温度的水中可能会存在不溶解的问题，本发明意外的发现在酶解液中进一步加入丙酮，其能与复合酶中的β‑葡聚糖酶协同作用，通过改变琼脂的结构进而促使琼脂在较低温度下的溶解性，使其在可以低温下形成半胶体状态，进而可以防止由于溶解琼脂的温度过高而促使乳香挥发油进行挥发；甘油的添加有利于使酶解剩余的乳香原料和琼脂混合均匀，进而提高乳香挥发油的相容性，从而提高乳香挥发油的提取率；酶解液中添加的琼脂和甘油能增加乳香组织和复合酶之间的接触面积，使复合酶更好的渗透到乳香细胞中，有利于复合酶更好地与未酶解或酶解不彻底的反应底物进行二次酶解反应，并且酶解反应溶出的乳香挥发油可以更好的吸附在半胶体状态的琼脂中，从而极大地提高了乳香挥发油的提取率；本发明进一步借助微波提取的方法与琼脂结合使用，微波加热还有利于进一步促进乳香细胞内挥发油的迅速释放，通过两种手段协同作用，有利于在更短的时间内得到的更高效的提取率。 [0015] 本发明采用复合酶解‑琼脂提取的思路，在酶解过程中通过配合表面活性剂和金属离子溶液，并结合超声工艺，提高了酶解效率，使复合酶中绝大部分乳香挥发油溶于酶解液中；进一步在琼脂提取时以丙酮和甘油作为辅助试剂，丙酮和复合酶中β‑葡聚糖酶协同组用，通过改变琼脂结构使琼脂可以在较低温度下溶解并形成半胶体状态，甘油的加入不仅可以使乳香原料和琼脂充分混匀，还能与琼脂协同作用，使复合酶和未发生酶解反应或酶解反应不彻底的反应底物发生二次酶解反应，溶出的乳香挥发油吸附于半胶体状态的琼脂中，降低了乳香挥发油的损失，并且，琼脂提取辅以微波加热，促进乳香细胞内挥发油的迅速释放；通过本发明提供的特定的提取工艺，极大地提高了提取效率和得油率。 [0016] 本发明所提供的乳香挥发油的提取方法操作简便，工艺时间短，且所得乳香挥发油的得油率，为提取乳香挥发油的发展提供了新的思路。 [0017] 优选的，步骤1中，所述乳香原料的挥发油含量为5.2％‑5.8％。 [0018] 优选的，步骤1中，所述乳香原料的粒径为15目‑20目。 [0019] 粉碎过细会造成部分挥发成分易挥发损失，通过限定乳香原料的粒径，有利于进一步提高乳香挥发油的得油率。 [0020] 优选的，步骤1中，所述乳香原料和水的质量比为1:(6‑8)。 [0021] 优选的，步骤1中，所述水的温度为55℃‑60℃。 [0022] 优选的，步骤1中，所述浸泡的时间为3h‑5h。 [0023] 控制水的温度和浸泡时间，能够使乳香原料达到一个最佳膨胀状态，提高后续酶解的效率，进而提高乳香挥发油的得油率。 [0024] 优选的，步骤1中，所述金属离子溶液中钙离子和镁离子的摩尔比为1:(0.5‑0.7)。 [0025] 优选的，步骤1中，所述金属离子溶液的浓度为0.7mol/L‑1.1mol/L。 [0026] 优选的，步骤1中，所述表面活性剂中Tween 20和Triton X‑100的质量比为1:(1.3‑1.5)。 [0027] 优选的，步骤1中，所述复合酶中纤维素酶、半乳糖醛酸酶、蛋白酶和β‑葡聚糖酶的质量比为1:(0.7‑0.9):(0.6‑0.8):(0.2‑0.3)。 [0028] 优选的，步骤1中，所述乳香原料、复合酶、表面活性剂和金属离子溶液的质量体积比为1g:(1.3‑1.5)g:(0.6‑0.8)mL:(0.6‑0.7)mL。 [0029] 优选的，步骤1中，所述酶解的时间为55min‑75min。 [0030] 优选的，步骤1中，所述超声的功率为250W‑300W。 [0031] 优选的，步骤1中，所述超声的时间为20min‑30min。优选的，步骤2中，在所述酶解液中加入琼脂、丙酮和甘油后，以30rpm‑40rpm的速率搅拌1min‑1.5min。 [0032] 通过搅拌处理，不仅加快琼脂溶解，还有利于进一步促进复合酶更好地与未酶解或酶解不彻底的反应底物进行二次酶解反应。 [0033] 优选的，步骤2中，所述酶解液、琼脂、丙酮和甘油的质量比为1:(0.03‑0.05):(0.04‑0.06):(0.02‑0.04)。 [0034] 优选的，步骤2中，所述微波提取的功率为300W‑350W。 [0035] 优选的，步骤2中，微波提取结束的条件为：无馏出液流出。 [0036] 优选的，步骤2中，所述萃取使用的有机溶剂为石油醚。 [0037] 本发明第二个方面提供一种乳香挥发油，由上述乳香挥发油的提取方法提取得到。 [0038] 本发明第三个方面提供上述乳香挥发油在制备抑制黑色素沉着产品中的应用。 具体实施方式[0039] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。 [0040] 为了更好的说明本发明，下面通过实施例做进一步的举例说明。 [0041] 实施例1 [0042] 本实施例提供一种乳香挥发油的提取方法，包括如下步骤： [0043] 步骤1、将10g挥发油含量为5.2％的乳香原料加入60g 55℃的水中浸泡3h，然后加入13g复合酶、6mL表面活性剂和6mL浓度为0.7mol/L的金属离子溶液，调节pH至5.8‑6，于38℃下酶解55min，酶解时需要超声辅助，超声的功率为250W，超声的时间为20min，得酶解液； [0044] 其中，乳香原料的粒径为15目，复合酶为质量比1:0.7:0.8:0.2的纤维素酶、半乳糖醛酸酶、蛋白酶和β‑葡聚糖酶的复合酶，表面活性剂为质量比1:1.3的Tween 20和Triton X‑100混合物；金属离子溶液为摩尔比1:0.5的钙离子和镁离子的混合金属离子溶液，钙离子可以以氯化钙的形式添加，镁离子可以以氯化镁的形式添加； [0045] 步骤2、将所述酶解液升温至45℃，加入琼脂、丙酮和甘油，以30rpm的速率搅拌1min，静止15min后微波加热至95℃下进行微波提取，微波功率设置为300W，收集馏出液至无馏出液即完成提取，利用石油醚对馏出液进行萃取，干燥，减压浓缩，得乳香挥发油； [0046] 其中，所述酶解液、琼脂、丙酮和甘油的质量比为1:0.05:0.06:0.04。 [0047] 实施例2 [0048] 本实施例提供一种乳香挥发油的提取方法，包括如下步骤： [0049] 步骤1、将10g挥发油含量为5.8％的乳香原料加入80g 60℃的水中浸泡5h，然后加入15g复合酶、8mL表面活性剂和7mL浓度为1.1mol/L的金属离子溶液，调节pH至5.8‑6，于42℃下酶解75min，酶解时需要超声辅助，超声的功率为300W，超声的时间为30min，得酶解液； [0050] 其中，乳香原料的粒径为20目，复合酶为质量比1:0.9:0.6:0.3的纤维素酶、半乳糖醛酸酶、蛋白酶和β‑葡聚糖酶的复合酶，表面活性剂为质量比1:1.5的Tween 20和Triton X‑100混合物；金属离子溶液为摩尔比1:0.7的钙离子和镁离子的混合金属离子溶液，钙离子可以以氯化钙的形式添加，镁离子可以以氯化镁的形式添加； [0051] 步骤2、将所述酶解液升温至48℃，加入琼脂、丙酮和甘油，以40rpm的速率搅拌1.5min，静止30min后微波加热至93℃下进行微波提取，微波功率设置为350W，收集馏出液至无馏出液即完成提取，利用石油醚对馏出液进行萃取，干燥，减压浓缩，得乳香挥发油； [0052] 其中，所述酶解液、琼脂、丙酮和甘油的质量比为1:0.03:0.04:0.02。 [0053] 实施例3 [0054] 本实施例提供一种乳香挥发油的提取方法，包括如下步骤： [0055] 步骤1、将10g挥发油含量为5.6％的乳香原料加入70g 58℃的水中浸泡4h，然后加入14g复合酶、7mL表面活性剂和6.5mL浓度为1mol/L的金属离子溶液，调节pH至5.8‑6，于40℃下酶解65min，酶解时需要超声辅助，超声的功率为280W，超声的时间为25min，得酶解液； [0056] 其中，乳香原料的粒径为18目，复合酶为质量比1:0.8:0.7:0.25的纤维素酶、半乳糖醛酸酶、蛋白酶和β‑葡聚糖酶的复合酶，表面活性剂为质量比1:1.4的Tween 20和Triton X‑100混合物；金属离子溶液为摩尔比1:0.6的钙离子和镁离子的混合金属离子溶液，钙离子可以以氯化钙的形式添加，镁离子可以以氯化镁的形式添加； [0057] 步骤2、将所述酶解液升温至47℃，加入琼脂、丙酮和甘油，以35rpm的速率搅拌1.3min，静止20min后微波加热至94℃下进行微波提取，微波功率设置为320W，收集馏出液至无馏出液即完成提取，利用石油醚对馏出液进行萃取，干燥，减压浓缩，得乳香挥发油； [0058] 其中，所述酶解液、琼脂、丙酮和甘油的质量比为1:0.04:0.05:0.03。 [0059] 对比例1 [0060] 本对比例提供一种乳香挥发油的提取方法，与实施例1不同在于： [0061] 步骤1中，将镁离子替换为等量的锰离子； [0062] 其他组分和操作与实施例1相同。 [0063] 对比例2 [0064] 本对比例提供一种乳香挥发油的提取方法，与实施例1不同在于： [0065] 步骤1中，将β‑葡聚糖酶替换为等量的纤维素酶； [0066] 其他组分和操作与实施例1相同。 [0067] 对比例3 [0068] 本对比例提供一种乳香挥发油的提取方法，与实施例1不同在于： [0069] 步骤1中，将Tween 20替换为十八烷基三甲基氯化铵； [0070] 其他组分和操作与实施例1相同。 [0071] 对比例4 [0072] 本对比例提供一种乳香挥发油的提取方法，与实施例1不同在于： [0073] 步骤2中，将丙酮替换为等量的乙醇； [0074] 其他组分和操作与实施例1相同。 [0075] 对比例5 [0076] 本对比例提供一种乳香挥发油的提取方法，与实施例1不同在于： [0077] 步骤2中，将琼脂替换为等量的果胶； [0078] 其他组分和操作与实施例1相同。 [0079] 计算实施例1‑3和对比例1‑5得到的乳香挥发油的得油率和转移率，其中，得油率(％)＝挥发油含量/供试品重量*100％，转移率(％)＝得油率/原料中所含挥发油理论含量*100％； [0080] 具体检测结果见表1： [0081] 表1 [0082] [0083] 将本发明提取的乳香挥发油进行药效试验，共设置6个试验组，每组设置12只野生斑马鱼，具体为野生型AB的Danio rerio，其中，第一组为斑马鱼胚胎的对照组，第二组为经苯硫卡胺处理的100％抑制组，第三组为经曲酸处理的阳性对照组，第四组至第六组为不同浓度的乳香挥发油处理的试验组；具体的，第一组的胚胎在200μL水中进行培养，第二组在30mg/L的苯硫异烟胺溶液中培养，第三组在2.5g/L的曲酸溶液中培养，第四组在含有质量浓度为0.5‰的实施例1提取乳香挥发油的水溶液中进行培养；第五组在含有质量浓度为 5‰的实施例1提取乳香挥发油的水溶液中进行培养；第六组在含有质量浓度为1％的实施例1提取乳香挥发油中进行培养；具体培养条件为：28℃下培养48h；孵育完成后，通过显微镜(AZ100，Nikon)测量黑色素强度，并通过Image J进行分析，黑色素抑制率可按下式计算： [0084] 黑色素抑制率(％)＝(对照组黑色素强度‑实验组黑色素强度)/(对照组黑色素强度‑抑制组黑色素强度) [0085] 具体检测结果见表2所示： [0086] 检测项目 黑色素抑制率(％)第一组 0 第二组 100 第三组 50 第四组 40.3 第五组 85.7 第六组 92.3 [0087] 表2可知，利用本发明提供的乳香挥发油的提取方法提取得到的乳香挥发油，还具有抑制黑色素沉着，其黑色素抑制率达到92.3％。 |
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