二聚和三聚核酸染料以及相关的系统和方法
| 专利类型 | 发明授权 | 法律事件 | 公开; 实质审查; 授权; 权利转移; |
| 专利有效性 | 有效专利 | 当前状态 | 授权 |
| 申请号 | CN201210445877.2 | 申请日 | 2006-03-17 |
| 公开(公告)号 | CN102942566B | 公开(公告)日 | 2016-04-20 |
| 申请人 | 百奥提姆股份有限公司; 阿莱罗杰克生物科学股份有限公司; | 申请人类型 | 企业 |
| 发明人 | F·毛; W·-Y·里昂; X·辛; | 第一发明人 | F·毛 |
| 权利人 | 百奥提姆股份有限公司,阿莱罗杰克生物科学股份有限公司 | 权利人类型 | 企业 |
| 当前权利人 | 百奥提姆股份有限公司 | 当前权利人类型 | 企业 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份： | 城市 | 当前专利权人所在城市： |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：美国加利福尼亚州 | 邮编 | 当前专利权人邮编： |
| 主IPC国际分类 | C07D417/14 | 所有IPC国际分类 | C07D417/14 ; C07D219/08 ; C09B15/00 ; C09B23/10 ; C12Q1/68 ; G01N21/64 |
| 专利引用数量 | 3 | 专利被引用数量 | 2 |
| 专利权利要求数量 | 11 | 专利文献类型 | B |
| 专利代理机构 | 上海专利商标事务所有限公司 | 专利代理人 | 樊云飞; |
| 摘要 | 提供了二聚体和三聚体核酸染料以及有关的系统和方法。这种染料可形成发夹样结构，该结构使得所述染料通过(例如) 请求 式释放机理使核酸着色。例如，这种染料在没有核酸存在下的背景 荧光 低，在有核酸存在下，与核酸结合后的荧光高。本 发明 提供的染料可用于各种领域，例如实时PCR中的DNA定量测定。 | ||
| 权利要求 | 1.一种具有下式的化合物： |
||
| 说明书全文 | 二聚和三聚核酸染料以及相关的系统和方法[0001] 本发明专利申请是国际申请号为PCT/US2006/009910，国际申请日为2006年3月17日，进入中国国家阶段的申请号为200680008515.X、发明名称为“二聚和三聚核酸染料以及相关的系统和方法”的发明专利申请的分案申请。 [0002] 相关申请的交叉引用 [0003] 本申请要求2005年3月17日Mao等提交的名为“Dimeric and TrimericNucleic Acid Dyes,and Associated Systems and Methods(二聚和三聚核酸染料以及相关系统和方法)”的美国临时申请号60/663,613的优先权，本申请与2006年3月16日与本文同时提交的待批美国申请号__/__,__有关，该待批申请也要求美国临时申请号60/663,613的优先权。上述各份临时申请和上述申请全文纳入本文作为参考。 [0005] Biotium,Inc.(Hay ward，加利福尼亚(CA))和AlleLogic Biosciences Corp.(Hay ward，加利福尼亚)是涉及本发明的合作研究协议的双方。 [0007] 上述美国临时申请号60/663,613提交了含本文公开的SEQ ID NO:1到SEQID NO:10序列表的原始ASCII软盘和作为该原始软盘副本的另一张ASCII软盘以及该序列表的纸件，该临时申请涉及这些软盘和纸件并将其全文(包括其内容)纳入作为参考。同时提交了该序列表的纸件。据此要求上述美国临时申请号60/663,613已存档的符合规定的 (compliant)计算机可读序列表可用于本申请。本申请序列表的纸件或光盘及其内容与上述美国临时申请号60/663,613所提交的序列表计算机可读副本一致。美国临时申请号60/ 663,613的序列表，同时提交的该序列表纸件和已存档的计算机可读序列表全文(包括其内容)纳入本文作为参考。 [0008] 背景 [0009] 荧光染料已用于检测和分析生物学样品。由于荧光染料灵敏度高，可利用它们来检测非常少量的荧光分子。可利用这种荧光染料检测与细胞相关的不到50个荧光分子。Barak等，J.Cell Biol.90，595(1981)。 [0010] 可用荧光染料作为使活细胞或组织样品成像的探针。例如，利用与网柄菌细胞表面受体结合的荧光染料探针使荧光标记的单分子cAMP成像。Ueda等，Science294，864(2001)。可利用具有不同荧光波长的几种荧光探针在活细胞或组织样品中进行多色成像。与放射性探针相比，荧光探针灵敏度高，毒性较低并易于处理。 [0011] 可用荧光染料检测核酸(包括DNA和RNA)及含核酸的生物学样品。核酸聚合物，例如DNA和RNA参与将遗传信息从一代传递至下一代，以及参与活体的常规机能。因此，核酸令人感兴趣并成为研究目标。能特异性结合核酸并形成具有高度荧光的复合物的荧光核酸是这种研究的有力工具。可利用这些染料检测各种介质，例如纯溶液、细胞提取物、电泳凝胶、微阵列芯片、活的或固定细胞、死细胞和环境样品中是否存在DNA和RNA及其含量。可用这些染料定量检测实时聚合酶链式反应(qPCR)中的DNA，该实时聚合酶链式反应是基因组研究和医学诊断中所用的技术。 [0012] 聚合酶链式反应(PCR)是一种引物延伸反应，它提供一种在体外扩增特定核酸的方法。在PCR期间，反应溶液短时维持于96℃、60℃和72℃这3种温度中的每一种，以分别进行解链或变性、退火和链延伸。利用能快速加热或冷却含反应混合物的试管的自动化热循环仪重复这种三温度时期30或40轮。通过重复该PCR循环，可在数小时内在一种酶促反应混合物中产生DNA样品的百万倍拷贝，从而使得研究人员能测定靶DNA的大小和序列。该DNA扩增技术已用于克隆和其它分子生物学操作。PCR的其它讨论见Mullis等，Methods Enzymol.(1987)和Saiki等，Science(1985)。 [0013] 可用的一种PCR技术是定量实时PCR(qPCR)。简言之，qPCR的机理是以指数方式对靶DNA进行PCR扩增。通过进行PCR反应同时检测扩增反应期间给定时间点的DNA拷贝总数，能追溯计算起始DNA物质的量。 [0014] 荧光DNA检测通常是qPCR所用的一种灵敏、通用以及方便的检测方法。qPCR中使用两种类型的荧光试剂。第一种类型以用一种或多种荧光染料，或一种荧光染料和一种猝灭染料的组合标记的寡核苷酸为基础。这些标记的寡核苷酸会在与靶序列杂交后，或杂交接着切割寡核苷酸后，以与存在的DNA量成比例的方式发出荧光。各种专利和出版物描述了寡聚荧光试剂的机理和应用。参见，例如Holland等，Proc.Natl.Acad.Sci USA(1991)；Lee等，Nucleic Acids Res.(1993)；和美国专利号5,210,015；5,538,848；6,258,569；5,691,146；5,925,517；5,118,801；5,312,728和6,635,427。虽然qPCR的寡聚荧光试剂的优点在于对靶序列高度特异，但它们的设计非常复杂，因而使用昂贵。qPCR所用的第二种类型的荧光试剂以通常称为荧光核酸染料或染色剂的DNA结合荧光染料为基础。由于荧光核酸染料是较简单的分子，它们易于制备，因此使用廉价。它们在qPCR中的应用是用于研究实验室的常规遗传检测。 [0015] 不是所有常规可用的荧光核酸染色剂都能用于qPCR。为适用于qPCR，理想地，荧光核酸染料应符合某些标准。首先，其在PCR和保存期间应是化学稳定的。由于PCR在高温下进行，所述染料应对热稳定。此外，由于PCR所用的Tris缓冲液的pH可从在低温下(4℃)为碱性(pH 8.5)，显著变化至在高温下为中性或微酸性，所述染料应能耐受酸或碱辅助的分解作用。其次，当存在于PCR溶液中时，所述染料不应抑制PCR过程。第三，在无DNA存在时，所述染料应没有荧光或荧光极低，有DNA存在时，应变得有高度荧光。第四，所述染料应能吸收或发出与现有仪器相容的波长，所述仪器通常装配了为以下常规荧光染料优化的光通道(optical channel)：例如FAM、JOE、VIC(Applied Biosystems，Foster City，加利福尼亚)、TAMRA、ROX、德克萨斯红、Cy3和Cy5。第五，所述染料结合DNA时，序列偏好应低或没有。第六，DNA-染料复合物应具有与存在的DNA含量线性相关的荧光强度。 [0016] 考虑到上述标准，就不奇怪可用于qPCR的核酸结合染料极少。溴化乙锭(EB)是一种DNA染料，已用其证明了qPCR使用简单染料的可行性。Higuchi等，Bio-Technol 10(4)，413(1992)。然而，EB的问题是灵敏度低和波长不理想。qPCR广泛使用的染料是Molecular Probes，Inc.(Eugene，Oregon(OR))的SYBR绿I。Wittwer等，Biotechniques 22(1)，130(1997)。SYBR绿I是环状取代的不对称花青染料。Zipper等，Nucleic Acids Res.32(12)，e103(2004)；和美国专利号5,436,134和5,658,751。SYBR绿I的优点在于它能激发并发出与FAM的波长非常匹配的波长(该波长与大多数仪器相容)，以及在于结合DNA时具有高度的荧光。近年来，qPCR使用了称为LC绿的DNA染料，虽然该染料的结构未公开。虽然LC绿染料看来具有与大多数PCR仪器常规使用的FAM光学通道相匹配的理想波长，但它的灵敏度远低于SYBR绿I。最近，有报道说qPCR使用了称为BEBO的DNA小沟结合剂和称为BOXTO的相关染料，二者均是不对称花青染料。Bengtsson等，Nucleic Acids Res.31(8)，e45(2003)；和美国专利申请公布号2004/0132046。与LC绿相似，在灵敏度方面，BEBO和BOXTO远逊于SYBR绿I。 [0017] 虽然SYBR绿I广泛用作qPCR的DNA染料，但它仍有几方面的不足。一个不足是SYBR绿I对PCR过程有抑制作用，从而限制了增加染料浓度可达到的最大信号强度。使用SYBR绿I的qPCR的荧光信号强度先与染料浓度成比例，直至染料浓度达到染料开始明显抑制PCR过程之时。进一步增加染料浓度实际上会因DNA扩增减少而降低了信号强度或增加了循环数(Ct)。另一不足是在碱性条件，例如PCR缓冲液在低温保存时的碱性条件下SYBR绿I化学不稳定。有报道说，4℃保存在Tris缓冲液中的SYBR绿I在数天期间明显分解，染料分解产物明显是强效抑制剂。Karsai等，BioTechniques 32(4)，790(2002)。还有另一不足是SYBR绿I只提供一种荧光颜色。许多商品化可购得的荧光检测仪器具有多条光学通道(FAM光学通道和其它光学通道)，因而能检测多种荧光颜色。 [0018] 需要开发荧光染料或所述染料的制备或利用。 [0019] 概述 [0020] (本发明)提供了产生或设计适合于有用应用(例如qPCR过程)的荧光染料的方法。该方法包括通过可弯曲且基本上中性(例如，中性或略带电荷)的桥(bridge)连接两个或三个单体染料。如本文所述，产生或设计染料的方法可开发的荧光核酸染料具有迄今为止未获得的波长和/或其它光谱特性。 [0021] (本发明)提供了适合于有用领域(例如本文所述的)的荧光染料。按照本文所述方法产生的二聚或三聚染料可形成发夹结构，据信该结构使得所述染料通过本文进一步描述的请求式释放(release-on-demand)机理使核酸着色。本文所述染料可具有以下至少一种特征或所有特征：假使有的话，“荧光背景”也较低(无核酸存在下的荧光)，最好没有荧光背景；PCR抑制作用较低，最好没有PCR抑制作用；荧光信号强度较高；和稳定性较高。对于这些特征中的至少一种，或者对于所有这些特征，所述染料优于现有染料，例如SYBR绿I(只是举例)。本文所述染料可具有某种特性，例如波长和/或另一种光谱特性，例如迄今为止未能获得的波长和/或光谱特性。 [0022] (本发明)提供了能形成分子内二聚体或形成发夹结构的二聚和/或三聚核酸染料或染色剂。据认为，发夹形染料本身可以无荧光或荧光极低，但在有核酸存在下变得有高度荧光。据认为，染料经中间状态与核酸结合，其中部分染料形成开放的随机构象。还认为染料中存在少量的这种开放的随机构象并与发夹状态平衡。据认为，随着核酸含量增加，平衡可从发夹状态向染料的核酸结合状态偏移，因而得到的荧光信号强度基本上与核酸的存在量呈线性比例。 [0023] 上述机理可以称为DNA染色的请求式释放机理，其对于各种应用，例如定量实时PCR(qPCR)是理想的。据信，形成发夹结构可使“有效的染料浓度”低，从而使得本文所述染料对PCR过程的干扰极低，这只是解释。因此，与以前的染料，例如SYBR绿I相比，qPCR可使用较高浓度的本文所述染料。染料浓度较高可能明显增加DNA检测的灵敏度。 [0024] (本发明)提供了测定样品中(是否有)核酸形成或缺乏核酸形成的方法。样品可以含或不含靶核酸。这种方法可包括提供含样品和荧光核酸染料的检验溶液(testsolution)，其中所述荧光核酸染料如下式所示： [0025] [0026] 其中桥是含有约8至约150个非氢原子的实质上脂族、基本上中性的接头(linker)；Q1是选自荧光核酸染料成分、无荧光核酸染料成分、荧光非核酸染料成分和无荧光非核酸染料成分的染料成分；Q2是选自荧光核酸染料成分、无荧光核酸染料成分、荧光非核酸染料成分和无荧光非核酸染料成分的染料成分。这些染料成分可以是任何合适的染料成分，例如本文所述的那些。所述荧光核酸染料成分可选自吖啶染料、不对称花青染料、对称花青染料、菲啶 (phenanthridinium)染料、派洛宁染料和苯乙烯基染料(只是举例)。所述Q1染料成分和所述Q2染料成分中至少一种染料成分是报道染料成分(reporter dye constituent)，所述Q1染料成分和所述Q2染料成分中至少一种染料成分是荧光核酸染料成分或无荧光核酸染料成分。所述报道染料成分和所述荧光核酸染料成分可以相同或不同。 该方法可包括用检验溶液进行足以扩增靶核酸的步骤(如果样品含有靶核酸的话)。所述过程可以是PCR过程，例如实时PCR过程(只是举例)。该方法可包括用波长足以被报道染料成分吸收的光照射检验溶液及测定(是否有)荧光发出或缺乏荧光。 [0027] (本发明)提供了测定样品中(是否有)核酸形成或缺乏核酸形成的另一种方法。样品可以含或不含靶核酸。这种方法可包括提供含样品和荧光核酸染料的检验溶液，其中所述荧光核酸染料如下式所示： [0028] [0029] 其中桥是含有约15至约150个非氢原子的实质上脂族(substantially aliphatic)、基本上中性(substantially neutral)的接头；Q1是选自荧光核酸染料成分、无荧光核酸染料成分、荧光非核酸染料成分和无荧光非核酸染料成分的染料成分；Q2是选自荧光核酸染料成分、无荧光核酸染料成分、荧光非核酸染料成分和无荧光非核酸染料成分的染料成分；Q3是选自荧光核酸染料成分、无荧光核酸染料成分、荧光非核酸染料成分和无荧光非核酸染料成分的染料成分。这些染料成分可以是任何合适的染料成分，例如本文所述的那些。所述荧光核酸染料成分可选自吖啶染料、不对称花青染料、对称花青染料、菲啶 染料、派洛宁染料和苯乙烯基染料(只是举例)。所述Q1染料成分、所述Q2染料成分和所述Q3染料成分中至少一种染料成分是报道染料成分，所述Q1染料成分、所述Q2染料成分和所述Q3染料成分中至少一种染料成分是荧光核酸染料成分或无荧光核酸染料成分。所述报道染料成分和所述荧光核酸染料成分可以相同或不同。该方法可包括用检验溶液进行足以扩增靶核酸的步骤(如果样品含有靶核酸的话)。所述步骤可以是PCR步骤，例如实时PCR步骤(只是举例)。该方法可包括用波长足以被报道染料成分吸收的光照射检验溶液及测定(是否有)荧光发出或缺乏荧光。 [0030] 在上式中，桥可以直接如下式所示。 [0031] -L1-[A1-(CH2)α-]a[A2-(CH2)β-]b[A3-(CH2)γ-]c[A4-(CH2)δ-]d[A5-(CH2)ε-]e[0032] [A6-(CH2)ζ-]f[A7-(CH2)η-]g[A8-(CH2)θ-]h[A9-(CH2)ι-]i-A10-L2- [0033] 在该式中，L1和L2各自独立为含单键的部分；任选含有至少一个选自N、O和S的杂原子，具有1至约12个碳(包括端点)的聚亚甲基单元；或任选含有至少一个选自N、O和S的杂原子的芳基；A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9和A10各自独立为核酸结合增强基团(NABEG)；任选含有至少一个选自N、O和S的杂原子的支链烷基；或任选含有至少一个选自N、O和S的杂原子的至少一个饱和5-或6-元环；α、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ和ι各自独立为0或1至约20的整数(包括端点)；a、b、c、d、e、f、g、h和i各自独立为0或1至约20的整数(包括端点)。桥可含有合适数量的非氢原子，例如约8至约100或约150个(包括端点)、约12至约60(包括端点)个或约15至约40(包括端点)个(只是举例)。桥可含有最多一个正电荷(只是举例)。桥可以是任何合适的接头分子，例如本文上述的任何分子。在一个例子中，桥如下式所示： [0034] -(CH2)x-C(=O)NH-(CH2)α-[O-(CH2)β]b-[O-(CH2)γ]c-NH(O=C)-(CH2)x- [0035] 其中x各自独立为选自1-11的整数(包括端点)；α是选自2至约20的整数(包括端点)；β和γ独立为2或3；b是0或1至约20的整数(包括端点)；c是0或1。 [0036] (本发明)也提供了与上述方法有关的合成物(composition)。提供了直接如下述任一结构所示的染料(只是举例)。 [0037] [0038] [0039] 在以上染料结构中，Ψ表示阴离子，例如碘或氯阴离子(只是举例)。 [0040] (本发明)也提供了直接如下式所示的合成物。 [0041] [0042] 在该式中，桥是含有约15至约150个非氢原子和最多一个正电荷的实质上脂族接头；Q1是荧光核酸染料成分；Q2是荧光核酸染料成分；Rr是反应基团或官能团。所述反应基团或官能团可以是任何合适的基团，例如本文所述的那些。该合成物可以是任何合适的合成物，例如本文所述的那些。使用该合成物或染料的方法可包括将该合成物与选自以下的底物分子(substrate molecule)偶联：例如固体表面的分子、核苷酸、寡核苷酸、肽、蛋白质、半抗原、药物、微粒、合成聚合物、天然聚合物、生物细胞和病毒。 [0043] (本发明)也提供了含或不含核酸的样品的制备方法。该方法可包括提供样品与合成物或染料(例如本文所述那些)的混合物，其中如果样品中存在核酸，则形成核酸-染料复合物。该方法还可包括培育该混合物。(本发明)也提供了测定样品中是否存在核酸的方法。该方法可包括提供样品与某合成物或染料(例如本文所述那些)的混合物，其中如果样品中存在核酸，则形成核酸-染料复合物；用光照射混合物，如果形成核酸-复合物则该光的波长足以使其被吸收；和测定(是否有)荧光发出或缺乏荧光。(本发明)也提供了测定样品中核酸形成或缺乏核酸形成的试剂盒。该试剂盒装有至少一种足以扩增样品中靶核酸的组合物(如果样品含有靶核酸的话)和合成物或染料，例如本文所述那些。 [0044] 本文进一步描述了这些及其它各方面、特征和实施方式。 [0046] 本文参考以下简述的附图详述了各方面、特征和实施方式。这些附图是说明性的，无需按比例绘制。这些附图说明了各方面或特征，这些附图完整或部分说明了一个或多个实施方式或实施例。一幅图中用于指示某具体元件或特征的参照数字、字母和/或符号可用于另一附图以表示相似的元件或特征。 [0047] 图1(FIG.1)是DNA通过请求式释放机理结合的示意图，其中染料的三种构象态基本上平衡。 [0048] 图2(FIG.2)是a)二聚染料AOAO-7(o)，和b)单体AO染料，DMAO(Δ)在PBS缓冲液中的标准化吸光度与波长(nm)关系图或标准化吸收光谱。 [0049] 图3(FIG.3)是a)二聚染料AOAO-7(·)，和b)单体AO染料，DMAO(▲)在PBS缓冲液中及DNA存在时的标准化吸光度与波长(nm)关系图或标准化吸收光谱。 [0050] 图4(FIG.)是DMAO(Δ)和AOAO-7(o)在DNA加入前(分别是a)和c))与DMAO(▲)和AOAO-7(·)在DNA加入后(分别是b)和d))在PBS缓冲液中的相对荧光与波长(nm)关系图或荧光发射光谱。 [0051] 图5(FIG.5)是a)TOTOT-1(按照美国专利号5,582,977)(暗线)，和b)TOTO-3(明线)在缓冲液中的标准化吸光度与波长(nm)关系图或标准化吸收光谱。 [0052] 图6(FIG.6)是a)TOTOT-1(按照美国专利号5,582,977)(暗线)，和b)TOTO-3(明线)在缓冲液中及DNA存在时的标准化吸光度与波长(nm)关系图或标准化吸收光谱。 [0053] 图7(FIG.7)包括单链DNA(◇)和双链DNA(◆)在溶液中及AOAO-12(0.2μM)存在时相对荧光与DNA浓度(μg/mL)或滴定度的关系图。图7也包括一张表示相对荧光与DNA浓度的关系的插入图，该插入图显示二者之间基本上呈线性关系。 [0054] 图8(FIG.8)是利用低染料浓度(△)和高染料浓度(▲)SYBR绿I与低染料浓度(□)和高染料浓度(■)AOAO-12的相对荧光与循环数(Ct)或PCR扩增的关系图，其中Ct通常指荧光信号达到假定阈值(arbitrary threshold)的循环次数，在PCR扩增图中通常对应于荧光信号恰好从基线开始升高之处。对于各种染料，以染料在PBS缓冲液中吸光度最大时的光密度(OD)检测相对染料浓度，1×和2×AOAO-12在471nm的染料浓度分别对应于0.1和0.2的OD，0.5×和1×SYBR绿I在495nm的染料浓度分别对应于0.025和0.05的OD。 [0055] 图9(FIG.9)包括利用最佳浓度的AOAO-12(□)和SYBR绿I(△)作为荧光探针的相对荧光与循环数(Ct)或PCR扩增的关系图。对于各种染料，以染料在PBS缓冲液中吸光度最大时的光密度(OD)检测相对染料浓度，AOAO-12在471nm的染料浓度对应于0.4的OD，SYBR绿I在495nm的染料浓度对应于0.025的OD。图9也包括分别利用AOAO-12(■)和SYBR绿I(▲)的Ct与Log DNA样品拷贝数的插入图，各情况中显示二者之间基本上呈线性关系。 [0056] 图10(FIG.10)是单体染料Q1和Q2形成二聚体染料的可能组合A、B、C、D和E的示意图。组合A包含相同的两种报道荧光核酸染料或光谱相似的两种报道荧光核酸染料。组合B包含一种报道荧光核酸染料和一种非报道DNA结合分子。组合C包含一种非报道(non-reporter)DNA结合分子和一种报道非DNA结合染料。组合D包含一种报道荧光核酸染料和一种非报道无荧光非核酸染料。组合E包含一种报道荧光核酸染料和一种报道荧光非核酸染料。 [0057] 图11(FIG.11)是利用TO单体染料(○)、TOTO-1单体染料(△)和TOTO-12二聚体染料(□)(24号化合物，表2)的荧光强度与循环数(Ct)或PCR扩增的关系图。 [0058] 图12(FIG.12)是的杂二聚体染料AORO-7在PBS缓冲液中(○)，和杂二聚体染料染料AORO-7在PBS缓冲液中及DNA存在时(+)的吸光度与波长(nm)关系图或吸收光谱。 [0059] 图13(FIG.13)是分别记录在500nm(实线、暗线)或约560nm(虚线，明线)激发的杂二聚体染料AORO-7的任意荧光强度(arbitary fluorescence intensity)与波长(nm)关系图或发射光谱。 [0060] 图14(FIG.14)包括利用杂二聚体染料AORO-7的相对荧光与循环数(Ct)或PCR扩增的关系图。图14也包括相对荧光信号与温度(℃)的插入图或解链曲线。 [0061] 图15(FIG.15)是A)用AORO-12(短划线)监测和B)用SYBR绿I(实线)监测4种扩增子TBP(○)、SDHA(Δ)、RPL4(◇)和HMBS(□)的相对荧光变化与温度(℃)的关系图或解链曲线。 [0062] 图16(FIG.16)是AOAO-12在60℃监测的相对荧光与处于96℃的时间(分钟)，或96℃热稳定性的关系图。 [0063] 详述 [0064] 本文描述了可用于各种应用，例如检测核酸的荧光染料或染色剂。这种染料可以是二聚体或三聚体核酸染料，例如没有核酸存在时背景荧光低，但有核酸存在时变得具有高度荧光的染料。如本文所述，二聚体和三聚体核酸染料可用于各种应用，例如检测核酸。本文也描述了制备和使用荧光染料或染色剂相关的方法，例如含有荧光染料或染色剂的有用系统或试剂盒。 [0065] 除非另有隐含或明确地推断或表述，在本文中应知道以单数出现的词语包括其复数形式，以复数出现的词语包括其单数形式。此外，除非另有隐含或明确地推断或表述，应该知道对于本文所述的任何给定组分，为该组分所列举的任何可能的候选对象或备选方案通常可以单独使用或彼此联用。此外，除非另有隐含或明确地推断或表述，应该知道这种候选对象或备选方案的清单只是说明性而非限制性的。还有，除非另有隐含或明确地推断或表述，应该知道本文给出的任何数字或数值是近似值，并且任何数值范围应包括限定该范围的最小值和最大值，而无论是否出现“包括端点”等术语。此外，除非另有隐含或明确地推断或表述，应该知道任何非约束性的、开放的或开放式的(open-ended)的语言应分别包括任何相对非约束性到限制性的语言、开放到封闭的语言或开放式到封闭式(closed-ended)的语言。词语“包含”可包括“包含”-、“基本上由…构成”-和/或“由…构成”-型的语言(只是举例)。 [0066] 下文总体上描述了各种术语或者本文用这些术语来帮助理解。应该知道，这些各种术语的相应通用描述适用于其相应的语言学或语法变化或形式。也应知道，以非通用或更具体的方式使用时，以下任何术语的通用描述可能不适用或不完全适用。也应知道本文所用的术语或提供的描述(例如与各种实施方式有关的)不是限制性的。还应知道本文所述实施方式或本文所述应用不是限制性的，因为这些实施方式或应用可以不同。 [0067] 术语“染色剂”和“染料”通常可以互换使用，指能吸收光谱范围约250nm至约1,200nm的光的芳族分子。术语“染料”通常指荧光染料、无荧光染料或二者。术语“荧光染料”通常指被另一种波长合适的光激发时能发光的染料。 [0068] 术语“荧光猝灭剂(fluorescence quencher)”通常指能使另一荧光分子的荧光猝灭的分子。荧光猝灭可通过三种方式的至少一种发生。第一类荧光猝灭通过荧光共振能量转移(FRET)而发生( Ann.Phys.(1948)；和Stryer等，Proc.Natl.Acad.Sci(1967))，其中猝灭剂吸收荧光分子发出的光。FRET猝灭剂的吸收峰通常与荧光染料的发射峰有明显重叠，从而使FRET猝灭剂成为有效的荧光猝灭剂。FRET猝灭剂通常是无荧光染料，但也可以是荧光染料。当猝灭剂是荧光染料时，只能利用该染料的吸收特性。第二类荧光猝灭通过光诱导电子转移(PET)而发生，其中该猝灭剂是富含电子的分子，其通过将电子转移给电子激发的染料而使荧光分子的荧光猝灭。第三类荧光猝灭通过染料凝聚(aggregation)(例如形成H-二聚体)而发生，其中两个或多个染料分子彼此物理接触从而使电子能量散逸成这些分子的振动模式。在两种相同的荧光染料之间、或两种不同的荧光染料之间、或一种荧光染料和一种FRET猝灭剂之间或一种荧光染料和一种PET猝灭剂之间可发生该类型的接触荧光猝灭。其它类型的荧光猝灭剂包括稳定的自由基化合物和某些重金属复合物，尽管不常用。 [0069] 术语“核酸”通常指双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、双链RNA(dsRNA)、单链RNA(ssRNA)和/或其衍生物。核酸可以是天然的或合成的。 [0070] 术语“荧光核酸染色剂”或“荧光核酸染料”通常指能结合核酸而形成荧光染料-核酸复合物的染料。荧光核酸染料通常本身无荧光或荧光弱，但与核酸结合后变得有高度荧光。术语“无荧光、核酸结合分子”通常指某种核酸结合分子，其可以是或不是染料，在与核酸结合后并不变得具有荧光。术语“荧光DNA染料”通常指与DNA结合后变得有荧光的染料。术语“荧光、非核酸染料”通常指不与核酸结合的荧光染料。术语“无荧光、非核酸染料”通常指既无荧光亦不能与核酸结合的染料。这种染料通常称为荧光猝灭剂。常利用荧光猝灭剂与荧光染料形成FRET对。术语“报道染料”通常指其所发出的荧光有助于最终检测荧光信号的荧光染料。 [0071] 术语“聚合酶链式反应”或“PCR”通常指扩增DNA量的技术。术语“定量、实时PCR”或“qPCR”通常指监测PCR过程中DNA量增加的技术。 [0072] 荧光核酸通常主要可分为两大类：插入剂(intercalator)和小沟结合剂。荧光插入剂一般是通过将自身插在毗邻的碱基对之间而与双链DNA或双链RNA结合的染料。小沟结合剂一般是与双链DNA的小沟结合的染料。还有通过多种方式，包括带正电的染料和带负电的核酸之间的静电相互作用而与核酸结合的其它染料。 [0073] 虽然许多荧光核酸染料已可商品化购得，也已开发了改善非qPCR用染料的方法，但是不是所有核酸染色剂均适用于qPCR领域。此外，对于何种结构元件是良好qPCR染料所需知之甚少。 [0074] 从性能的观点看，理想的qPCR染料通常应符合现在描述的各种标准。染料在高温时(约60℃－约96℃)在PCR缓冲液中应热稳定，当介质变为碱性时应在低温下(约-20℃－4℃)水解稳定。染料不应抑制PCR过程，这点通常是最重要的标准，因为在PCR抑制最严重的情况中，PCR甚至无法启动，在中等(严重)的情况中，Ct数会滞后，或者只能使用浓度极低的染料，从而限制了荧光信号。没有DNA存在时染料应无荧光或荧光极低，但有DNA存在时应变得有高度荧光。染料吸收或发出的波长应与和qPCR联用的仪器，例如之前描述的现有仪器相容。染料结合DNA的序列时，偏好应低或没有。DNA-染料复合物的荧光强度应与存在的DNA存在量线性相关。本文所述的染料可以符合或不符合一条或多条上述标准。 [0075] (本发明)提供了设计荧光核酸染料(例如适用于qPCR的)的方法。该方法包括用合适的接头共价连接两个或三个单体染料以形成二聚体染料或三聚体染料。本文所述的染料处于溶液中时，可因形成分子内二聚体而主要采取发夹状构象。该发夹状构象或状态对于核酸是失活的，不能与核酸相互作用。据信，当染料处于溶液中并有核酸存在时，其也采取开放的随机构象或状态，这种构象量少并基本上与发夹构象平衡。染料的这种开放的随机构象或状态对于核酸是有活性的，或能与核酸相互作用或结合。据认为，当染料处于核酸含量增加的环境中时，平衡可从发夹状态向中间(状态)、开放的随机状态或DNA结合状态偏移。该机理有时称为“请求式释放DNA-结合机理”，据信其降低了在其它情况的染料相关PCR抑制。结果，该染料用于PCR过程的浓度高于其它可能的情况，因此提供的核酸检测灵敏度高于其它可能的情况。可以极大降低PCR抑制，并且明显增加核酸检测灵敏度。 [0076] 本文所述二聚体染料或三聚体染料可以具有任何数量的所需特征。例如，这种染料的背景荧光可低于其单体染料成分的背景荧光。背景荧光较低通常对应于核酸检测灵敏度较高。因此，这种染料通常与提高的核酸检测灵敏度相关。此外，例如本文所述染料比SYBR绿I对热和/或水解更稳定。另外，例如本文所述染料的吸收和发射波长不同于现有qPCR染料相关的那些波长。 [0077] 荧光二聚体核酸染料的通用结构(结构1)如下式所示。 [0078] 结构1 [0079] [0080] 在结构1中，染料Q1和染料Q2各自独立选自荧光核酸染料、无荧光核酸染料、荧光非核酸染料和无荧光非核酸染料。可以能促进或确保得到的二聚体染料所需特性的方式选择和组合Q1和Q2。染料Q1和染料Q2中至少一种染料是报道染料。此外，染料Q1和染料Q2中至少一种染料是荧光核酸染料或无荧光核酸染料。所述报道染料和所述荧光核酸染料可以相同或不同。桥在相对有限的程度可以带正电或者基本上电中性，其可以是基本上可弯曲的成分从而促进分子内二聚体形成进而产生二聚体染料。 [0081] 荧光三聚体染料的通用结构(结构2)如下式所示。 [0082] 结构2 [0083] [0084] 在结构2中，染料Q1、染料Q2和染料Q3各自独立选自荧光核酸染料、无荧光核酸染料、荧光非核酸染料和无荧光非核酸染料。可以能促进或确保得到的三聚体染料所需特性的方式选择和组合Q1、Q2和Q3。染料Q1、染料Q2和染料Q3中至少一种染料是报道染料。此外，染料Q1、染料Q2和染料Q3中至少一种染料是荧光核酸染料或无荧光核酸染料。所述报道染料和所述荧光核酸染料可以相同或不同。桥在相对有限的程度可以带正电或者基本上电中性，其可以是基本上可弯曲的成分从而促进分子内二聚体形成进而产生三聚体染料。 [0085] 荧光核酸染料的通用结构(结构3)如下式所示。 [0086] 结构3 [0087] [0088] 在结构3中，染料Q1和染料Q2各自可如以上结构1和结构2所述；桥可以是上述的实质上脂族接头；Rr可以是反应基团或官能团。如本文所述，Q1是荧光核酸染料成分；Q2是荧光核酸染料成分；桥可以是含有约15至约150个非氢原子和最多带一个正电荷的实质上脂族接头；Rr可以是反应基团或官能团(只是举例)。 [0089] 桥 [0090] 桥可以是具有不超过1个正电荷的基本上可弯曲的接头分子。桥可以是基本上中性和基本上可弯曲的接头分子。可选择桥的成分以实现这种有限的正电荷或这种基本上的中性。下文会进一步讨论基本上中性的特性，包括实际中性。基本上可弯曲的特性通常与桥实质上脂族的性质有关，包括实际脂族性质。这种实质上脂族性质通常指桥的非芳香性或桥的非刚性。 [0091] 在结构1中，桥与Q1和Q2共价相连。以二聚体染料为例，桥可具有例如约8至约150个非氢原子，约8至约100个非氢原子、约12至约60个非氢原子、约15或约20至约40或约50个非氢原子。在结构2中，桥与Q1、Q2和Q3共价相连。以三聚体染料为例，桥可具有例如约15至约150个非氢原子，约20至约150个非氢原子、约20至约100个非氢原子、或约30至约70个非氢原子。 [0092] 桥可掺入至少1个独立的核酸结合增强基团(NABEG)。NABEG是能以静电、疏水或氢键相互作用的形式与核酸结合的部分。NABEG可以选自：伯胺；仲胺；叔胺；铵；脒；任选含有选自N、O、S的杂原子及其任何组合的芳基；具有含高负电性杂原子的键的部分；和它们的任何组合(只是举例)。 [0093] 伯胺、仲胺和叔胺及脒是碱性基团，因而在生理pH下带正电或者至少部分带正电。铵基或季铵化氮原子永久带正电。总的来说，带正电或部分带正电的基团通过静电相互作用增强了核酸与染料的结合，可利用这种特性开发高度灵敏的荧光核酸染色剂。用正电荷过多的桥制备本发明染料通常不理想。例如，本发明二聚体染料或三聚体染料的合适桥可含有不超过一个正电荷。桥可以是基本上可弯曲且中性的接头或基本上中性的接头。在本文中，基本上中性指略微带电荷。例如，桥可包含弱碱性成分，例如吡啶基团或吡嗪基团，从而当其处于水溶液中时可存在非常少量的正电荷。再例如，以桥包含至少一个NABEG为例(任选)，正电荷的精确含量通常与该NABEG的pKa有关。通常NABEG的pKa越高，NABEG越可能被质子化，因而带上正电。例如，合适的弱碱性NABEG基团的pKa是约11或更小、约8或更小或约 7或更小。 [0094] 有形成分子内二聚体，主要是H-二聚体的趋势是所制备核酸染料的尤其有用的特性。例如，以本文所述二聚体染料为例，形成H-二聚体可产生发夹状结构，其中H-二聚体形成发夹的茎部分，桥形成弯曲部分，如图1所示。West等，J.Phys.Chem.(1965)；Rohatgi等，J.Phys.Chem.(1966)；Rohatgi等，Chem.Phys.Lett.(1971)；和Khairutdinov等，J.Phys.Chem.(1997)已描述了与某些染料有关的H-二聚体形成现象。当桥是可弯曲且中性或基本上中性的烃接头(任选含有一个或多个中性NABEG)时，有助于形成分子内H-二聚体。 [0095] H-二聚体形成的特征在于染料吸收光谱的大蓝移。例如，图2显示了单体染料AO(吖啶橙)和形成分子内二聚体的相关二聚体染料AOAO-7的吸收光谱。AOAO-7二聚体相关的471nm峰表明形成分子内H-二聚体。一旦结合DNA，单体和二聚体的吸收光谱变得相似，表明发夹结构打开。例如图3所示，AOAO-7二聚体的471nm峰消失表明DNA结合后发夹结构打开。 [0096] 本文所述染料中形成H-二聚体可能主要有两种益处。一种主要益处是如大的荧光信号增益所表明，背景荧光降低(有时降低惊人)，同时与DNA结合后的荧光有实质性增加。通过比较DNA不存在和存在时单体吖啶橙染料DMAO和二聚体吖啶橙染料AOAO-7的荧光光谱可明白上述益处。例如，如图4所示，与单体DMAO染料相比，二聚体AOAO-7染料的荧光背景较低，与DNA结合后荧光较高。 [0097] 分子内二聚体相关的荧光猝灭可以十分有效，从而可用至少一种正常情况下认为极不理想的单体染料(例如至少一种背景荧光高的染料)构建本文所述染料。图4显示的这种例子表征了吖啶橙(AO)及其二聚体。虽然AO是最早知道并具有理想波长的核酸结合染料，但因其背景荧光较高而未广泛用于核酸检测。如图4所示，二聚体染料AOAO-7的背景荧光远低于单体AO染料。 [0098] H-二聚体通过分子内，而不是分子间相互作用形成。H-二聚体通过共价连接两种或三种染料，例如一对理想的单体染料而形成。可以较为简单地形成H-二聚体，而无需使用其它试剂，例如可能干扰染料有用应用的其它试剂。例如，可以在溶液中由一种核酸结合染料成分和一种非核酸结合荧光染料成分的配对物形成二聚体染料，而不用其它试剂。再例如，可以在溶液中由两种核酸结合染料成分和一种非核酸结合荧光染料成分制备三聚体染料，仍不用其它试剂。形成H-聚体为将染料限制在非DNA结合状态提供了有用的方法，该状态对PCR没有抑制作用，并且仅当存在DNA时转变为开放随机状态转或DNA结合状态。因此，有效染料浓度或处于开放随机状态的染料浓度可以维持在低水平，即使为增加qPCR灵敏度使用的染料总浓度高。 [0099] 如上所述，本文所述染料中形成H-二聚体可以与另一种主要益处有关。该出乎意料的益处是染料中形成H-聚体可明显降低qPCR应用中染料对PCR的抑制作用。例如，对于给定浓度的DNA样品，荧光DNA染料的荧光信号通常与该染料的浓度成比例，直至染料饱和。例如，染料浓度越高则形成的DNA-染料复合物越多，因而荧光越高或越亮，直至染料饱和。因此，为使qPCR应用的灵敏度最高，最好希望开始时染料的浓度足够高。然而，实际上，以前用于qPCR的所有DNA染料均不同程度地抑制DNA扩增过程。通常这种现有染料的浓度越高对扩增或PCR过程的染料抑制作用越大。因此，这种现有染料在qPCR应用的的浓度通常比在非qPCR应用中的浓度低得多。 [0100] 从下文对qPCR所用最广泛的DNA染料(SYBR绿I)的讨论可以知道，qPCR应用中降低染料浓度会损失终点时的荧光信号强度。生产商未给出qPCR所用SYBR绿I的浓度，因此不容易与其它染料精确比较或这种比较不是常规的。然而，按照比尔定律，染料的浓度与其光密度线性相关，因此可利用qPCR所用的SYBR绿I溶液和qPCR所用另一种染料溶液的光密度特征来至少定性比较各自的浓度。例如，qPCR所用SYBR绿I溶液的典型光密度是0.025-0.05，而用于qPCR的本文表2第19号染料溶液的光密度通常是约0.04至约0.8，或者更常见是约0.1至约0.4。当染料浓度从0.5×(对应于495nm吸收峰的光密度为0.025)增加至1×(对应于同一吸收峰的光密度为0.05)时，SYBR绿I染料显示明显的抑制作用。如图8所示，虽然1×浓度的SYBR绿I的终点荧光信号高于0.5×浓度的SYBR绿I，但1×染料浓度的循环数或Ct值延迟。该延迟的Ct值表明SYBR绿I在染料浓度较高时明显抑制PCR。当染料浓度从1×(对应于471nm吸收峰的光密度为0.1)增加至2×(对应于同一吸收峰的光密度为0.2)时，二聚体染料，AOAO-12显示抑制作用很低或没有抑制。如图9所示，因为AOAO-12显示PCR抑制作用很低或没有抑制，它能以较高浓度使用并提供比SYBR绿I的荧光信号高数倍的荧光信号。简言之，AOAO-12在宽浓度范围内显示PCR抑制作用很低或没有抑制，因此可以较高浓度使用以增加荧光信号。 [0101] 据信，图1所示意说明的“请求式释放”机理可解释为何本文所述染料会如上所述没有实质性PCR抑制作用，从而能使用较高浓度的染料。即，据信，如图1所示，溶液中二聚体染料在封闭的发夹构象和开放的随机构象之间存在动态平衡。发夹构象通常远比开放的随机构象稳定并且占优势。紫外/可见光光谱支持了染料中发夹构象占优势，该光谱显示与单体光谱相比，二聚体光谱有实质性偏移。发夹构象是染料的失活形式，而开放构象是能结合DNA的染料活化形式。存在DNA时，处于开放构象的染料转变为结合有DNA的构象，更多处于发夹构象的染料转变为开放构象，处于开放构象的染料维持于极低浓度。换言之，大多数染料局限于非DNA结合的发夹构象，只在对存在较多的DNA产生响应时才释放成开放构象或DNA结合构象。该“请求式释放”机理使得该染料能以较高浓度使用而对PCR过程本身无不利影响。与本文所述染料不同，SYBR绿I不具有有助于降低染料有效浓度的非DNA结合构象，因而显示依赖于浓度的PCR抑制作用高。 [0102] 本文所述核酸染色剂较简单，可在相当普通的基础上以所需规模制备，例如以克或几十克计的量。这些核酸染色剂对检测DNA扩增和相对常规的研究领域通用。例如，可利用荧光核酸染料以基本上无序列选择性的方式和相对通用的方式检测DNA的存在与含量。 [0103] 桥可直接如下式(式1)所示。 [0104] 式1 [0105] -L1-[A1-(CH2)α-]a[A2-(CH2)β-]b[A3-(CH2)γ-]c[A4-(CH2)δ-]d[A5- [0106] (CH2)ε-]e [0107] [A6-(CH2)ζ-]f[A7-(CH2)η-]g[A8-(CH2)θ-]h[A9-(CH2)ι-]i-A10-L2- [0108] 在式1中，取代基L1和L2(各自简称为“L”)各自是桥的一部分。L1与Q1染料成分和Q2染料成分中的一种染料成分共价相连，L2与除上述一种染料成分以外的Q1染料成分和Q2染料成分中的染料成分共价相连。L1和L2各自独立为含单键的部分；任选含有至少一个选自N、O和S的杂原子，具有1至约12个碳的聚亚甲基单元；或任选含有至少一个选自N、O和S的杂原子的芳基。与(CH2)亚甲基单元有关的下标，即α、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ和ι可以相同或不同，各自独立表明相关亚甲基单元的大小，可以是0或1至约20或1至约12的整数。与式1中括号部分有关的下标，即a、b、c、d、e、f、g、h和i可以相同或不同，各自独立表明该式中相关括号部分的大小，可以是0或1至约20或1至约10或1至约5的整数。 [0109] A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9和A10可以相同或不同，各自独立为核酸结合增强基团(NABEG)；任选含有至少一个选自N、O和S的杂原子的支链烷基；或任选含有至少一个选自N、1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 O和S的杂原子的至少一个饱和5-或6-元环。A 、A、A 、A、A、A 、A、A、A 和A 可以使得桥最多含有一个正电荷，或者基本上中性，在后一情况中，这些取代基本身各自可以独立为本身基本上中性，包括实际中性。NABEG可选自：具有含至少一个高负电性杂原子或S的至少一个连接键的部分；和任选含有至少一个选自卤素、N、O和S的杂原子的芳基。具有含至少一个高负电性杂原子或S的至少一个连接键的部分的例子包括但不限于：含有至少一个酰胺键、氨酯键(urethane bond)、脲键、硫脲键、醚键或硫醚键的部分。 [0110] 直接如下式(式2)所示，A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9和A10之一可以是通过支链B’和接头L与Q3共价相连的支链单元。 [0111] 式2 [0112] [0113] 在式2中，T可以是取代的碳、取代的氮或任选含有至少一个选自O、N和S的杂原子的芳基。B’直接如下式(式3)所示。 [0114] 式3 [0115] -(CH2)α′-[A11-(CH2)β′-]a′[A12-(CH2)γ′-]b′[A13-(CH2)δ′-]c′A14-[0116] 式3的-(CH2)α’与式2的T共价相连，式3的A14与式2的L3共价相连。如上文式1中A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9和A10各自所述的，A11、A12、A13和A14各自独立为中性或基本上中性的核酸结合增强基团(NABEG)；任选含有至少一个选自N、O和S的杂原子的中性支链烷基；或任选含有至少一个选自N、O和S的杂原子的至少一个中性饱和5-或6-元环。与(CH2)亚甲基单元有关的下标，即α’、β’、γ’和δ’可以相同或不同，各自独立表明相关亚甲基单元的大小，可以是0或1至约20的整数。与式3中括号部分有关的下标，即a’、b’和c’可以相同或不同，各自独立表明该式中相关括号部分的大小，可以是0或1至约20的整数。 [0117] 如上文式1中各L成分所述的，在式2中，L3可以独立为含单键的部分；任选含有至少一个选自N、O和S的杂原子，具有1个碳至约12个碳的聚亚甲基单元；或任选含有至少一个选自卤素、N、O和S的杂原子的芳基。得到的分子是三聚体核酸染色剂。 [0118] 直接如下式(式4)所示，A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9和A10之一可以是通过支链B’和接头L3与反应基团Rr共价相连的支链单元。 [0119] 式4 [0120] [0121] 在式4中，T、B’和L3如以上式2和式3所定义，除了L3与Rr共价相连。得到的分子可以是以上结构3所示的核酸染色剂。 [0122] 具有反应基团Rr的染料可用于标记含有合适官能团或经衍生而含有合适官能团的各种分子。应该知道，可用术语“反应基团”指“反应基团”或“官能团”，可用术语“官能团”指“反应基团”或“官能团”。任一术语和两种术语均可指染料上的键形成基团(bond-forming group)，或待标记底物分子上的键形成基团。为简明起见(但不限于)，本文将染料上的键形成基团通常称为反应基团，底物分子上的键形成基团通常称为官能团。具有反应基团或官能团-Rr的染料可具有最多一个正电荷(只是举例)。 [0123] 将染料与底物分子偶联通常可赋予偶联于底物分子上的该染料检测核酸的特性。反应基团和官能团通常分别是能形成共价键的亲电基团和亲核基团。按照一备选方案，反应基团是能在紫外线光活化或光分解后与烃分子反应的光可活化基团。按照另一备选方案，反应基团是能通过狄尔斯-阿德耳反应与共轭二烯反应的亲二烯体。按照还有另一备选方案，反应基团是能与亲二烯体反应的1,3-二烯。可根据施陶丁格(Staudinger)化学方法或叠氮基和末端炔基之间的反应(称为克里克化学方法)选择其它反应基团/官能团配对。 下表1列出了有用的反应基团、官能团和相应的连接键的例子(只是举例)。 [0124] [0125] [0126] *如本领域所知，活化的酯通常如式-COΩ所示，其中Ω是良好的离去基团，例如琥珀酰亚胺氧基(succinimidyloxy)(-OC4H4O2)、磺基琥珀酰亚胺氧基(sulfosuccinimidyloxy)(-OC4H3O2-SO3H)或-1-氧基苯并三唑基(-OC6H4N3)；或用于形成活化的芳酯的芳氧基或用吸电子取代基，例如硝基、氟、氯、氰基、三氟甲基或其组合取代一次或多次的芳氧基；或由碳二亚胺活化的羧酸，从而形成酸酐或混合酸酐-OCORa或- OCNRaNHRb，其中Ra和Rb可以相同或不同，二者独立为C1-C6烷基、C1-C6全氟烷基或C1-C6烷氧基；或环己基、3-二甲基氨基丙基或N-吗啉基乙基。 [0127] **酰基叠氮化物也可重排成异氰酸酯。 [0128] 反应基团可以是能与胺、硫醇或醛反应的基团。反应基团可以是与胺反应的基团，例如琥珀酰亚胺基酯；或与硫醇反应的基团，例如马来酰亚胺、卤代乙酰胺或磺酸甲硫醇酯(MTS)；或与醛反应的基团，例如胺、氨氧基(aminooxy)或酰肼。 [0129] 反应基团可与各种底物分子偶联。例如，合适的底物分子可以是固体表面(例如硅晶片的表面、聚丙烯基板或容器的表面)的分子、核苷酸、寡核苷酸、肽、蛋白质、半抗原、药物、微粒、合成聚合物、天然聚合物、生物学细胞和病毒。待标记的分子可以是能与核酸相互作用的核苷酸、寡核苷酸、肽或分子。例如，可用DNA结合染料标记qPCR领域的寡核苷酸探针。Shiguro，T.等，NucleicAcids Res.24:4992-7(1996)。 [0130] A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9和A10可以相同或不同，它们各自独立为选自以下的NABEG：具有含至少一个高负电性杂原子或S的至少一个连接键的部分；和任选含有至少一个选自卤素、N、O和S的杂原子的芳基。具有含至少一个高负电性杂原子或S的至少一个连接键的部分的例子包括但不限于：含有至少一个酰胺键、氨酯键、脲键、硫脲键、醚键或硫醚键的部分。A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9和A10可以使得桥最多含有一个正电荷，或者基本上中性，在后一情况中，这些取代基本身各自可以是基本上中性，包括实际中性。 [0131] 如上所述，桥可含有任何合适数量的非氢原子，例如对于二聚体染料，可以含约10至约100个非氢原子，或约12至约60个非氢原子；对于三聚体染料，可以含约20至约100个非氢原子。例如，对于二聚体染料，桥可以含约15至约40个非氢原子；对于三聚体染料，可以含约30至约70个非氢原子。 [0132] 桥可以直接如下式(式5)所示(只是举例)。 [0133] 式5 [0134] -(CH2)xC(=O)NH(CH2)α-[O-(CH2)β]b-[O-(CH2)γ]c-NH(O=C)-(CH2)x- [0135] 例如，在一个这种例子中，桥的L1是-(CH2)x-，桥的L2是-(CH2)x-，其中各x独立为1-11的整数(包括端点)；桥的A1是-C(=O)NH-；桥的a是1；桥的A2是-O-；桥的A3是-O-；α可以是2至约20的整数(包括端点)；β和γ各自独立为2或3；b可以是0或2至约20的整数；c可以是0或 1；桥的d、e、f、g、h和I各自是0；桥的A10是-NH(O=C)C-。桥可以恰如上所述，其中c是1(只是举例)。此外，桥可以恰如上所述，其中c是1，并且其中x可以是5；α和γ可以相同，可以是2或3； β可以是2；b可以是0、1、2或3(只是举例)。 [0136] 单体染料 [0137] 用于二聚体和三聚体染料的各种单体染料成分或功能分子Q1、Q2和Q3可以选自：1)荧光核酸染料；2)无荧光、核酸结合分子；3)荧光、非核酸染料；和4)无荧光、非核酸染料。 通常以能促进或确保在没有DNA存在下形成分子内二聚体，但在DNA结合后形成高度荧光的DNA-染料复合物的方式选择Q1、Q2和Q3并使其通过桥共价连接。如上所述，形成分子内二聚体足以提供有用的发夹构象二聚体染料。这种二聚体构象可具有所需特性，例如背景荧光低，PCR抑制作用低。如上所述，可能使用较高浓度的本文所述二聚体染料来产生所需或强烈的荧光信号。 [0138] 通过比较二聚体染料或三聚体染料在水溶液中的吸收光谱与也在水溶液中的一种或多种相关单体的吸收光谱来证实形成分子内二聚体。与相关单体染料的光谱相比，形成任何分子内二聚体染料会导致二聚体或三聚体中单体染料成分的光谱明显偏移。在这点上，明显的偏移可以是约10nm或更大(只是举例)。例如，在图2中，AOAO-7有关的光谱相比于DMAO的光谱明显偏移。 [0139] 当形成的分子内二聚体是H-二聚体时，光谱通常发生明显的蓝移。在这点上，明显的偏移可以是约10nm或更大(只是举例)。也可能形成其它类型的分子内二聚体，从而可导致光谱向另一方向偏移、各单体染料成分的光谱各自向不同方向偏移、光谱偏移不明显或没有光谱偏移。在这点上，明显的偏移可以是约5nm或更大(只是举例)。当没有观察到明显偏移时，通常需要用其它分析技术来证实形成了任何分子内二聚体。这种分析技术包括但不限于：例如核磁共振(NMR)光谱法、红外光谱法和荧光光谱法。导致发夹结构的任何分子内染料凝聚通常是理想的。 [0140] Q1、Q2和Q3的各种组合可以是有用的或理想的。如图10所示，可以通过Q1和Q2的5种不同组合构建二聚体染料(只是举例)。再例如，下表2列出了所制备的染料和相关中间体的例子。 [0141] [0142] [0143] [0144] [0145] [0146] 虽然表2所示的许多结构显示了一个或多个碘阴离子，但是可用任何其它合适的阴离子(例如本文所述的那些)，例如氯阴离子(只是举例)替代所示的碘阴离子。 [0147] 本发明二聚体染料可含有荧光核酸染料Q1和荧光核酸染料Q2，其中Q1和Q2可以相同或不同。当Q1和Q2相同时，得到的染料是同二聚体，例如表2的第6-22、24-26和28-36号染料(仅是举例)。当Q1和Q2是具有相似吸收和发射光谱的不同荧光核酸染料时，得到的二聚体是异二聚体，例如表2的第23号染料(仅是举例)。这种异二聚体在功能上与同二聚体相似。在任一情况中，Q1和Q2是报道染料，从而在DNA结合后它们均产生被检测的荧光信号，如图10组合A所示意的。或者，异二聚体染料可以包含具有基本上不同的吸收和发射光谱的两种不同荧光核酸染料。在该情况中，两种染料中只有一种选作报道染料。 [0148] Q1和Q2可形成荧光共振能量转移(FRET)配对物。在此情况中，波长较短的染料用作荧光供体染料，而波长较长的染料用作接受或报道染料。为发生有效的FRET，供体染料的发射光谱和吸收光谱需要充分重叠。FRET的进一步讨论见 Ann.Phys.(1948)和Stryer等，Proc.Natl.Acad.Sci(1967)。FRET染料可以在一种波长激发，而在基本上较长的波长再发射荧光。 [0149] 当包含光谱基本上不同的Q1和Q2的异二聚体不是FRET染料时，Q1和Q2之一可选作报道染料，但二者不能同时选作报道染料。另一非报道染料用作形成分子内二聚体所必需的伴侣，为该二聚体染料提供额外的核酸结合能力。具有个报道染料(荧光核酸染料Q1)和一个非报道染料(无荧光核酸结合分子Q2)的异二聚体的例子见图10组合B。 [0150] 异二聚体染料可以包含无荧光核酸结合分子Q1和荧光非核酸染料Q2。在本文，Q2是报道染料，而Q1用作DNA锚定染料和形成分子内二聚体所必需的配对伴侣。图10的组合C示意性说明了该类型异二聚体的DNA结合模式。 [0151] 异二聚体染料可含有荧光核酸染料Q1和无荧光非核酸染料Q2。在这种情况中，Q1是报道染料，Q2用作形成分子内二聚体所必需的伴侣。图10的组合D示意性说明了该类型异二聚体的DNA结合模式。 [0152] 异二聚体染料可含有荧光核酸染料Q1和荧光非核酸染料Q2。如果Q1和Q2具有相似的吸收和发射光谱，则Q1和Q2均是报道染料，虽然只有Q1与核酸结合。图10的组合E示意性说明了该类型异二聚体的DNA结合模式。当Q1和Q2形成FRET配对时，波长较短的染料用作荧光供体染料，而波长较长的染料用作接受或报道染料(acceptor or reporter dye)。当Q1和Q2的光谱基本上不同且不是FRET对时，Q1和Q2之一可选作报道染料，但二者不能同时选作报道染料。后一情况的例子是AORO-7(表2的第27号染料)，如图12和13所示，其含有AO和亚硝基氨(rosamine)染料，AO分别在503nm和523nm具有吸收峰和发射峰，亚硝基氨染料分别在600nm和约620nm具有吸收峰和发射峰。图14显示了利用AORO-7的PCR扩增图，其中利用Bio-Rad Laboratories(Hercules，加利福尼亚)的iCycler IQ多色实时PCR检测系统的第3通道将荧光非核酸亚硝基氨染料组分选作报道染料。 [0153] 二聚体染料可含有选自两种相同的荧光核酸染料和两种不同的荧光核酸染料的一对单体染料。 [0154] 三聚体染料可含有荧光核酸染料Q1、荧光核酸染料Q2、荧光核酸染料Q3，其中Q1、Q2和Q3可以相同或不同。例如，Q1、Q2和Q3可以是相同的荧光核酸染料。三聚体染料可含有荧光核酸染料Q1、荧光核酸染料Q2、荧光非核酸染料Q3，其中Q1和Q2用作DNA锚定分子，Q3是报道染料。本发明三聚体染料可含有无荧光核酸结合分子Q1、无荧光核酸结合分子Q2和第三种荧光非核酸染料Q3，其中Q1和Q2用作DNA锚定分子，Q3是报道染料。 [0155] 下文进一步讨论了荧光核酸染料、无荧光核酸结合分子、荧光非核酸染料、无荧光非核酸染料以及它们的例子。 [0156] 荧光核酸染料 [0157] 适用于构建染料的单体荧光核酸染料的例子包括但不限于：吖啶染料、不对称花青核酸染色剂、菲啶 染料、对称花青核酸染色剂、DAPI的衍生物和Hoechst染料的衍生物。DAPI和Hoechst染料通常不能直接与桥相连，因为它们不具有用于形成键的反应基团。在本文中，衍生物指经充分修饰，例如通过加入反应基团(只是举例)而能形成键的碱染料(base dye)，例如DAPI或Hoechst染料。 [0158] 吖啶染料 [0159] 单体荧光核酸染料可以是直接如以下通用结构(结构4)所示的吖啶染料(只是举例)。 [0160] 结构4 [0161] [0162] 吖啶橙(AO)是将dsDNA染上绿色荧光和将RNA染上红色荧光的一种吖啶染料。Traganos等，J.Histochem.Cytochem.25(1)，46(1977)。与一些其它吖啶染料不同，AO的消光系数高(>50,000)，吸收波长长(λ吸收=500nm(结合有DNA))。然而。AO对核酸的亲和力非常低，在没有核酸存在下该染料具有明显的固有荧光。在这点上，固有荧光的水平可能是重要的，因为这样使得该染料不能用于检测低水平(例如低的纳克/mL范围)的核酸，或者例如不能检测没有脱色步骤的凝胶中核酸。因此，对于DNA或RNA定量，特别是与诸如实时qPCR等领域有关的高灵敏度DNA检测，AO本身用处不大。 [0163] 吖啶染料可在环结构的各种位置具有各种取代基。取代基的性质及其取代位置可强烈影响所产生染料的光谱特性。3-和6-位的供电子取代基和9-位的吸电子取代基通常使染料的吸收和发射光谱红移。典型的供电子基团的例子包括但不限于：氨基、羟基、烷氧基和烷基巯基。典型的吸电子基团的例子包括但不限于：氰基、全氟烷基、羧酰胺基、磺酰胺基、硝基和卤素基团。与核心结构稠合的任何其它环结构也能增长所产生染料的波长。 [0164] 现描述了结构4的各部分。在结构4中，与本文提供或描述的各种其它单体染料结构一样，后面有下标的符号“R”，例如R1(只是举例)可以表示该结构的一个取代基，而该结构不是桥的一部分，或者可以表示桥与该结构的连接之处，在此情况中其不是该结构的取代基。各R1可以独立为：H；具有1个碳-6个碳的烷基或烯基；卤素；-OR4；-SR5；-NR6R7；-CN；-NH(C=O)R8；-NHS(=O)2R9；或-C(=O)NHR10；任何毗邻的R1对任选形成5-或6-元饱和或不饱和的环，该环还可任选含有至少一个选自N、O和S的杂原子；R1中的一个是上述的-L-Rr，或者R1中的一个表示桥与该结构的连接之处，在该情况中，R1只是示范性的，而实际上不是单体染料的取代基。在R1包括R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10中至少一个的情况中，R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10中任何一个适用的基团可以独立为H或具有1个碳-6个碳的烷基，对于任何适用的毗邻R6和R7对，R6和R7可独立组合形成5-或6-元饱和或不饱和环，该环可任选含有至少一个选自N、O和S的杂原子。 [0165] R2通常是：H；具有1个碳-6个碳的烷基或烯基；任选含有至少一个选自卤素、N、O和S的杂原子的芳基；卤素；-OR11；-SR12；-NHR13；-CN或-C(=O)NHR14；或表示桥与该结构的连接之处。在R2包括R11、R12、R13和R14中至少一个的情况中，R11、R12、R13和R14中任何一个适用的基团可以独立为H或具有1个碳-6个碳的烷基。 [0166] R3通常是：H；或具有1个碳-6个碳的烷基；或表示桥与该结构的连接之处。 [0167] Ψ是阴离子，例如平衡染料相关正电荷的阴离子。Ψ可以是生物学相容的。合适阴离子的例子包括但不限于：卤素离子、硫酸根、磷酸根、高氯酸根、四氟硼酸根和六氟磷酸根。阴离子可以是氯离子或碘离子(只是举例)。 [0168] R1、R2和R3中只有一个必须表示桥与该结构相连之处。R2和R3中有一个可以表示桥与该结构相连之处(只是举例)。如本文所述，桥可以与单体吖啶染料，例如本文所述任何吖啶染料和另一种合适的单体染料共价相连而形成二聚体染料，或者与单体吖啶染料和两种其它合适的单体染料共价相连而形成三聚体染料。R1、R2和R3中通常只有一个可以任选是上述-L-Rr。二聚体染料或三聚体染料可只含有一个-L-Rr。 [0169] 单体吖啶染料可以直接如以下结构(结构5)所示(只是举例)。 [0170] 结构5 [0171] [0172] 在结构5中，各R1通常独立为H或C1-C2烷基；R2和R3之一表示桥与该结构相连之处；R2和R3之一任选是上述-L-Rr；当R2不表示桥与该结构相连之处并且不是L-Rr时，R2选自H、-CH3、-NH2、-NHCH3、-CN和-C(=O)NH2；当R3不表示桥与该结构相连之处并且不是L-Rr时，R3选自H或-CH3；R6和R7各自独立为H或C1-C2烷基；Ψ是上述阴离子。对于各对毗邻的R6或R7和R1，R6或R7和R1可独立组合形成5-或6-元饱和或不饱和环(只是举例)。 [0173] 在一个例子中，结构5所示的单体吖啶染料可以是各R1是H；R2是H；R3表示桥与该结构相连之处；各R6是-CH3；各R7是-CH3；Ψ是上述阴离子。 [0174] 二聚体染料可包含结构5所示的两种相同单体吖啶染料分子和式5所示的桥(只是举例)。 [0175] 不对称花青染料 [0176] 单体荧光核酸染料可以是直接如以下通用结构(结构6)所示的不对称花青染料(只是举例)。 [0177] 结构6 [0178] [0179] 不对称花青染料的通用结构(以上结构6)包含作为取代的吲哚 (benzazolium)环的杂环；甲烷或多次甲基(polymethine)桥；和作为取代的吡啶 (pyridinium)或喹啉(quinolinium)环的杂环。结构中的虚线表示形成一个或多个稠合芳环所需的原子，任选包含一个或多个季铵化或未季铵化的氮。当虚线表示含一个或多个氮原子的6-元环时，得到的稠环称为氮杂吲哚环(aza-benzole ring)。 [0180] 在结构6中，R1和R1’通常各自位于吲哚 环上，独立为H或具有1个碳-6个碳的烷基或烯基；卤素；-OR9；-SR10；-NR11R12；-CN；-NH(C=O)R13；-NHS(=O)2R14；或-C(=O)NHR15。R1和R1’之一可以是在X或吲哚氮的间位的取代基，其中该取代基赋予至少一种下文会进一步讨论的所需特性(只是举例)。在R1或R1’包括R9、R10、R11、R12、R13、R14和R15中至少一个的情况中，R9、R10、R11、R12、R13、R14和R15中任何一个适用的基团可以独立为H；或任选含有1-2个氮的具有1个碳-12个碳的烷基；或芳基；和任何适用的R11和R12可组合形成5-或6-元饱和或不饱和环，该环可任选含有至少一个选自N、O和S的杂原子。 [0181] 如上所述，结构6的R1和R1’之一可以是能赋予染料至少一种所需特性的取代基。一种这样的所需特性是DNA小沟-结合(特性)。小沟结合分子通常具有新月形结构以适合双链DNA的小沟。DNA小沟结合染料分子或非染料分子(可包括中性分子)的例子包括但不限于：DAPI、Hoechst染料、偏端霉素A、纺锤菌素和基于N-甲基吡咯和N-甲基咪唑的聚酰胺的许多合成小沟结合剂的任何一种。Biotium，Inc.(Hayward，加利福尼亚(CA))的目录，2005- 2006；Boger等，Acc.Chem.Res.37，61(2004)；和Dervan，P.B.，Bioorg.&Med.Chem.9，2215(2001)。通常用小沟结合剂取代基对5-或6-元环进行间位取代来产生新月形的小沟结合剂，所述取代基包括但不限于：取代或未取代的苯并 唑-2-基、取代或未取代的苯并咪唑- 2-基、取代或未取代的苯并噻唑-2-基、取代或未取代的咪唑-2-基、取代或未取代的 唑- 2-基、取代或未取代的噻唑-2-基、取代或未取代的N-甲基吡咯基-2-氨基羰基、取代或未取代的N-甲基吡咯基-3-羧酰胺基、取代或未取代的1-甲基咪唑-2-羧酰胺基、取代或未取代的1-甲基咪唑-4-氨基羰基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的吡啶基、取代或未取代的吡嗪基和取代或未取代的三嗪基。可以如美国专利公布号2004/0132046所述用小沟结合剂取代基间位取代DNA染料。 [0182] R1和R1’之一可以是上述-L-Rr。R1和R1’之一可以表示桥与该结构的相连之处。 [0183] X选自O和S。X是S的染料的吸收和发射波长通常长于X是O的染料。 [0184] R2可以是甲基或乙基，或者可以表示桥与该结构的相连之处。R2可以是甲基或乙基(只是举例)。 [0185] 下标n表示任何任何次甲基桥中双键单元的数目，其选自0、1和2。次甲基桥较长的染料的波长通常长于次甲基桥较短的染料。n可以是0或1(只是举例)。 [0186] 取代基R3、R4和R5独立为H或-CH3。这些取代基的任何毗邻的对可任选形成5-或6-元环。R3、R4和R5可以是H(只是举例)。 [0187] 取代基R6、R8和R8’通常独立为H；或任选含有至少一个选自N、O和S的杂原子的具有1个碳-10个碳的烷基或烯基；卤素；-OR16；-SR16；-NR16R17；任选含有1-3个选自卤素、N、O和S的杂原子的取代或未取代的芳基。R8和R8’可组合形成稠合芳环，该芳环还可用C1-C2烷基、C1-C2烷氧基、C1-C2烷基巯基(alkylmercapto)或卤素取代1-4次。在R6、R8和R8’中的任何一个包括R16和R17中至少一个的情况中，R16和R17中任何一个适用的基团可以独立为H；或任选含有1-2个氮并具有1个碳-12个碳的烷基；或芳基；和任何适用的R16和R17可组合形成5-或 6-元饱和或不饱和环，该环可任选含有至少一个选自N和O的杂原子。 [0188] R6可以表示桥与该结构相连之处。R6可以是上述-L-Rr。 [0189] R7可以是H；任选含有芳基和至少一个选自N、O和S的杂原子的具有1个碳-10个碳的烷基或烯基；任选含有1-3个选自卤素、N、O和S的杂原子的取代或未取代的芳基；上述-L-Rr；或者可以表示桥与该结构相连之处。 [0190] Ψ是本文上述的阴离子。 [0191] R1、R1’、R6、R7和R8中只有一个必须表示桥与该结构相连之处。如本文所述，桥可以与单体不对称花青染料和另一种合适的单体染料共价相连而形成二聚体染料，或者与单体不对称花青染料和两种其它合适的单体染料共价相连而形成三聚体染料。R1、R1’、R6、R7和R8中通常只有一个可以任选是上述-L-Rr。二聚体染料或三聚体染料可只含有一个-L-Rr。更典型的是，二聚体染料或三聚体染料可以只含有一个-L-Rr。 [0192] 不对称花青染料可以是直接如以下结构(结构7)所示，其中R1’、R6、R7、R8和R8’各自如以上结构6所述(只是举例)。 [0193] 结构7 [0194] [0195] 例如，结构7所示的不对称花青染料可以是：R1'是H；具有1个碳-6个碳的烷基或烯基；卤素；-OR9；-SR10；-NR11R12；-CN；-NH(C=O)R13；-NHS(=O)2R14；-C(=O)NHR15；与小沟结合有关的取代基；或上述-L-Rr；或表示桥与该结构相连之处。此外，当R1’包括R9、R10、R11、R12、R13、R14和R15中至少一个时，R9、R10、R11、R12、R13、R14和R15中任何一个所述基团可以独立为H；或任选含有1-2个氮的1个碳-12个碳的烷基；或芳基；和当R1’包括R11和R12时，R11和R12可组合形成5-或6-元饱和或不饱和环，该环可任选含有至少一个选自N和O的杂原子。X可选自O和S，n可选自0、1和2。R6可以是H；任选含有至少一个选自N、O和S的杂原子的1个碳-10个碳的烷基或烯基；卤素；-OR16；-SR16；-NR16R17；任选含有1-3个选自卤素、N、O和S的杂原子的取代或未取代的芳基；或上述-L-Rr；或表示桥与该结构相连之处。R7可以是H；任选含有芳基和至少一个选自N、O和S的杂原子的具有1个碳-10个碳的烷基或烯基；任选含有1-3个选自卤素、N、O和S的杂原子的取代或未取代的芳基；或上述-L-Rr；或表示桥与该结构相连之处。R8可以是H；任选含有至少一个选自N、O和S的杂原子的1个碳-10个碳的烷基或烯基；卤素；-OR16；-SR16；-NR16R17；任选含有1-3个选自卤素、N、O和S的杂原子的取代或未取代的芳基；或上述-L-Rr；或表示桥与该结构相连之处。R8’可以是H；任选含有至少一个选自N、O和S的杂原子的1个碳-10个碳(包括端点)的烷基或烯基；卤素；-OR16；-SR16；-NR16R17；任选含有1-3个选自卤素、N、O和S的杂原子的取代或未取代的芳基。R8和R8’可组合形成稠合芳环，该芳环还可独立地用C1-C2烷基、C1-C2烷氧基、C1-C2烷基巯基或卤素取代1-4次。就包含R16和R17中至少一个的任何R6、R8或R8’而言，所述R16和R17中的任何一个可以独立为H；或任选含有1-2个氮的1个碳-12个碳的烷基；或芳基。就包含R16和R17的任何R6、R8或R8’而言，R16和R17可组合形成5-或6-元饱和或不饱和环，该环可任选含有至少一个选自N和O的杂原子。R1’、R6、R7和R8中只有一个表示桥与该结构相连之处。R1’、R6、R7和R8中通常只有一个可任选是上述-L-Rr。Ψ是上述阴离子。 [0196] 在一个例子中，不对称花青染料可以是直接如以下结构(结构8)所示，其中R7表示桥与该结构相连之处，Ψ是上述阴离子。 [0197] 结构8 [0198] [0199] 二聚体染料可包含结构8所示两种相同单体不对称花青染料分子和式5所示的桥(只是举例)。 [0200] 在荧光核酸染料，例如结构1所示的染料中，当Q1染料成分是不对称花青染料(例如结构6-8任一所示)，Q2染料成分是不对称花青染料(例如结构6-8任一所示)时，桥(例如式1所示的桥)的a、b、c、d、e、f、g、h和i总和可大于3，或者桥(例如式1所示的桥)的A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9和A10中至少一个可以是NABEG，所述NABEG包括含有至少一个连接键的部分，所述连接键包括至少一个酰胺键、氨基甲酸酯键、脲键或硫脲键；或任选含有至少一个选自卤素、N、O和S的杂原子的芳基。 [0201] 菲啶 染料 [0202] 单体荧光核酸染料可以是直接如以下通用结构(结构9)所示的菲啶 衍生物(只是举例)。 [0203] 结构9 [0204] [0205] R1通常可表示桥与该结构相连之处，但是应该知道本文考虑通过各种技术可对以上结构9作出许多改变，例如通过合成技术以将桥与该结构的其它地方相连或可修饰该结构以使染料具有各种所需波长。Ψ是上述阴离子。 [0206] 结构9所示两种单体菲啶 染料分子与式5所示桥组合可形成二聚体染料(只是举例)。 [0207] 单体荧光核酸染料可以是直接如以下通用结构(结构10)所示的呫吨衍生物(只是举例)。 [0208] 结构10 [0209] [0210] 已知某些带阳离子电荷的呫吨染料能与核酸结合。例如，派洛宁Y是已知的荧光DNA结合染料，其中R1、R2、R1'和R2'是甲基，R3、R3'、R4、R4'和A是H，其已用于DNA凝胶染色。Adkin，S.和Burmeister，M.，Anal.Biochem.240(1)，17(1996)。预计具有以上结构10所示通用骨架的染料可具有相似的核酸染色特性，并能提供其它荧光颜色。例如，派洛宁Y的最大吸收在548nm，而最大发射在565nm，提供红色荧光。 [0211] R1、R2、R1'和R2'通常各自独立为H或任选含1-2个选自N和O的杂原子的C1-C6(包括端点)烷基(只是举例)。再例如，R1和R2对与R1'和R2'对中至少一对可独立组合形成任选含1个选自N和O的杂原子的5-或6-元环。R1和R1'可以相同，R2和R2'可以相同。 [0212] R1、R2、R1'和R2'中的一个可以表示桥与该结构相连之处。任选地，R1、R2、R1'和R2'中的一个是上述-L-Rr。 [0213] R3、R4、R3'和R4'可以独立为H或C1-C3(包括端点)烷基(只是举例)。R3、R4、R3'和R4'可以相同。R3和R1对、R2和R4对、R3'和R1'对和R4和R2'对中至少一对可独立组合形成饱和或不饱和、取代或未取代的5-或6-元环。 [0214] 如上所述，A是C1-C3烷基；或-L-Rr，其中L是C1-C12脂族接头，Rr是反应基团；或者表示桥与该结构相连之处。 [0215] R1、R2、R1'、R2'和A中只有一个可表示桥与该结构相连之处。 [0216] Ψ是上述阴离子。 [0217] 结构10所示两种单体呫吨染料分子与式5所示桥组合可形成二聚体染料。 [0218] 其它单体荧光红色染色剂，例如DAPI、DIPI、Hoechst染料、LDS 751、羟基弟脒(stilbamidine)、苯乙烯基染料、部花青染料、花青染料或FluoroGold(只是举例)可适合或可衍生从而适合本文所述应用。Haugland，R.P.，Handbook ofFluorescent Probes and Research Products(《荧光探针和研究产物手册》)，第9版。应该知道许多其它单体核酸染料可适合或可衍生从而适合本文所述应用。可利用合成知识将这些染料直接与桥偶联或将其衍生从而能与桥偶联。 [0219] 无荧光核酸染料 [0220] 无荧光核酸结合分子通常是没有荧光或荧光太微弱因而无法用作荧光核酸染料的核酸结合分子。无荧光核酸结合分子包括无荧光核酸结合染料和无色的合成或天然核酸结合分子。 [0221] 许多无荧光染料已用作比色法核酸凝胶染色剂。与荧光核酸染色剂溴化乙锭相比，这些无荧光染料的检测灵敏度通常低的多，但认为其使用较安全，例如就人用毒性而言较安全。无荧光核酸结合染料的例子包括但不限于：尼罗蓝、结晶紫、亚甲基蓝、硫素、甲基绿、碱性蓝66、碱性红29、二氢吲哚蓝、番红O、詹纳斯绿B、松柏氰醇和全染色染料。Adkins等，Anal.Biochem.240，17(1996)。这些染料的大多数可购自Aldrich Chemical Company，Inc.(密尔沃基，威斯康星州)。 [0222] 荧光非核酸染料 [0223] 单体染料Q1、Q2和Q3之一可以是荧光非核酸染料。通常，一般不认为是荧光核酸染料的所有荧光染料可认为是荧光非核酸染料。在本文中术语“荧光非核酸染料”通常指一般不认为是核酸染料的荧光染料。例如，所述染料一般不会被认为是荧光小沟结合剂或荧光插入剂。再例如，虽然某些荧光非核酸染料显示与核酸有一定弱相互作用，但这些相互作用通常不足以导致明显的荧光光谱改变从而可用这些染料检测核酸。 [0224] 可从各种来源，例如Biotium，Inc.(Hayward，加利福尼亚)商品化购得各种荧光非核酸染料。荧光非核酸染料的例子包括但不限于：荧光素染料、磺化荧光素染料、罗丹明染料、磺化罗丹明染料、花青染料、磺化花青染料、香豆素(coumarine)染料、芘染料、 嗪和Bodipy染料(Molecular Probes，Inc.(Eugene，OR))。如上所述，合适的荧光非核酸染料可含有反应基团Rr。可以衍生合适的荧光非核酸染料使之含有反应基团Rr。合适的反应染料可通过Rr和桥的合适官能团而与桥共价相连。 [0225] 选择合适的荧光非核酸染料可依据配对的一种或多种其它单体染料。通常，合适的荧光非核酸染料应能与配对的一种或多种染料形成分子内二聚体。在单体染料通过桥与另一种或多种配对的单体染料共价相连的前后，水性介质中单体染料成分的至少一种的吸收光谱发生明显变化通常能证实形成了分子内二聚体。 [0226] 无荧光非核酸染料 [0227] 通常，术语“无荧光非核酸染料”指既无荧光也不能结合核酸的染料。这种染料通常一般用作FRET领域的荧光猝灭剂。例如，将荧光供体染料与肽的一端，以及将无荧光非核酸染料(猝灭剂)与该肽的另一端共价相连来构建产荧光肽酶底物，从而能猝灭供体的荧光。酶切割肽后供体和猝灭剂分离从而释放荧光信号。再例如，无荧光非核酸染料已用于设计所谓的qPCR用TaqMan探针。TaqMan探针由与靶DNA序列互补的寡核苷酸、与该寡核苷酸一端相连的荧光供体染料、与该寡核苷酸另一端相连以使该供体染料的荧光猝灭的猝灭剂构成。在实时PCR期间，标记的寡核苷酸与靶DNA结合，从而导致该寡核苷酸被酶促切割，进而产生荧光信号。 [0228] 无荧光非核酸染料可主要用作形成分子内二聚体的配对伴侣，其负责请求式释放的DNA结合机理。应该对无荧光非核酸染料进行选择以确保无荧光非核酸染料与在DNA结合后与其配对的荧光核酸结合染料之间的FRET最低。通常，FRET所致荧光核酸染料的荧光损失应最低，例如不超过所发出总荧光的约70%。可根据对荧光核酸结合染料的发射光谱和无荧光染料的吸收光谱的评估选择无荧光非核酸染料。如上所述，理想地，这些光谱的重叠应最小从而使得FRET所致荧光信号损失最小。使FRET最小化的另一种可能的方法是充分使用长桥，从而使得FRET所致荧光信号损失最少，因为FRET的效率取决于染料成分之间分子内间隔(separation)六次方的倒数。 [0229] 有用的可商品化购得的无荧光猝灭剂的例子包括但不限于：Fluka(Buchs，瑞士)的DABCYL、Biosearch Technologies，Inc.(Novato，加利福尼亚)的Black HoleQuencher(BHQ)、Epoch Biosciences(Bothell，华盛顿)的Eclipse Dark Quencher(DQ)、Integrated DNA Technologies(Skokie，伊利诺斯州)的IOWA Black(IWB)和Molecular Probes，Inc.(Eugene，OR)的QSY。 [0230] 使用方法 [0231] 本文所述核酸染料特别适用于定量实时PCR(qPCR)。利用通过荧光核酸染料而与荧光DNA检测结合的PCR能测定PCR过程的产物量而无需停止PCR运行或在PCR运行期间对反应取样。采用PCR不仅能定量测定DNA样品的原始含量，还能获得序列信息。qPCR的灵敏度和特异性使其在许多实际应用，包括疾病的诊断和预后以及农业和法医的物种鉴定中十分有用。 [0232] 在qPCR中使用染料可包括在试管中将适用于PCR反应的染料和其它组分(例如，一种或多种扩增酶、足以扩增靶核酸序列的一种或多种引物和脱氧核苷三磷酸)加入含DNA样品的溶液中，将该密封的试管置于qPCR仪器中，记录所检测的荧光信号。可记录为达到专断测定阈值的荧光信号所需的Ct值或循环数。Ct值与DNA样品拷贝数的对数线性相关。利用Ct值与log DNA拷贝数的标准关系图，根据Ct值可测定DNA样品的DNA拷贝数。图8、9、11和14显示了利用所选择染料的PCR扩增图(只是举例)。 [0233] 荧光核酸染料的其它应用包括但不限于：定量测定溶液或凝胶中的DNA、活或死细胞中核酸染色和用微阵列检测核酸。通常，使用荧光核酸染料可包括使染料(任选地与任何其它试剂组合)与含有或认为含有核酸聚合物的样品接触；培育得到的染料和样品的混合物足够时间以形成染料-核酸复合物；检测染料-核酸复合物的荧光信号。 [0234] 可如本文所述制备用于合适的应用的染料。可用水性溶剂或水混溶和生物相容的有机溶剂将染料制备为浓度高于最终染色溶液中所用浓度的约100倍的储备溶液(仅仅是举例)。单独使用或与合适的有机溶剂联用来制备染料储备溶液的合适水性溶剂的例子包括但不限于：水、PBS缓冲液和Tris缓冲液。制备染料储备溶液的合适有机溶剂的例子包括但不限于：DMSO、DMF、甲醇或乙醇。然后用合适的水性溶剂，例如水或生物学缓冲液将储备溶液稀释成具有所需染料终浓度的染色溶液。通常，可通过待分析样品的性质和所进行分析的性质确定染色溶液的具体染料浓度。例如，用于细胞样品的染色溶液中染料浓度通常是约1nM或更高，或最高约100μM。再例如，用于电泳凝胶的染色溶液中染料浓度通常是约1μM或更高，或最高约50μM。 [0235] 可通过所进行分析的性质确定用染料染色核酸的方法。对细胞或组织样品(可预先固定或不固定)的核酸染色时，通常将样品与染色溶液培育数分钟到2小时以使染料渗透细胞膜并与核酸混合。在一些情况中，核酸可以存在于含纯化核酸或粗制细胞提取物的溶液形式中。在这种情况中，将染料储备溶液加入核酸溶液通常立刻产生可检测的荧光信号，其强度与核酸含量成比例。例如图7所示DNA滴定曲线。可利用DNA含量与荧光强度之间基本呈线性关系来定量测定DNA，或在使用细胞提取物时估计细胞数量。在某些例子中，可将核酸包埋在惰性基质，例如印迹、凝胶或试验带中，或与固体表面，例如微阵列芯片或任何其它固体表面相连。在这种情况中，一般通过将染色溶液涂布到含核酸的基质表面或微阵列芯片表面或其它固体表面，培育足以形成染料-核酸复合物的时间来进行染色。 [0236] 可通过其发射或激发(光谱)检测荧光核酸-染料复合物。例如，可以(并且典型地)用波长是或接近该复合物的最大吸收波长的光激发荧光核酸-染料复合物。再例如，可用波长为300nm-400nm的紫外光激发核酸-染料复合物，该紫外光是用于凝胶目测应用的大多数透照器(transluminator)上可用的激发光常规来源。例如，可利用各种仪器，例如板读数计、显微镜、荧光计、量子计数器和流式细胞器检测荧光信号。再例如，可通过目测法，例如目检或照相记录检测荧光信号。 [0237] 合成 [0238] 可按照合成单体染料成分、合成桥和偶联单体染料成分与桥来描述染料的合成。 [0239] 现在描述单体染料和含官能团或反应基团的单体染料的合成。 [0240] 合成单体染料和官能分子 [0241] 可通过已知的方法或任何合适的方法从头制备(from scratch)，或通过修饰已有合适的或所需的核心结构的可商品化购得的物质制备合适的单体染料和含官能团或反应基团的单体染料。可从商品化购得的吖啶染料制备许多单体吖啶染料。可用作合成的合适起始物质的商品化购得吖啶染料的一些例子直接如下文所示。 [0242] [0243] 3,6-二氨基吖啶 吖啶黄 吖啶橙 [0244] 可按照已知的方法或任何合适方法制备其它吖啶核心结构。Albert，A.，Theacridines:their preparation,physical,chemical,and biological properties and uses(《吖啶：其制备、物理、化学和生物学特性及应用》)，Edward Arnold Ltd.，伦敦； Eldho等，Synth.Commun.29，4007(1999)；和Joseph等，Bioconjugate Chem.15，1230，(2004)。如下文反应1直接示意的，可在有路易斯酸存在下通过缩合合适的二苯胺与合适的羧酸或羧酸等价物形成吖啶核心结构。 [0245] 反应1 [0246] [0247] 如下文进一步描述的，在反应1中，R'、R"和R'"是合适的取代基。二苯胺起始物质可以商品化购得或可采用已知方法或任何合适的方法从合适的芳基卤与合适的芳基胺合成。Yang等，J.Organomet.Chem.576，125(1999)；Hartwig等，J.Org.Chem.64，5575(1999)；和Wolfe等，J.Org.Chem.65，1158(2000)。 [0248] 取代基的性质和取代基所连的位置对染料的光谱特性有深远影响。通常，2-、3-、6-和7-位的供电子基团可增长染料的吸收和发射波长。典型的供电子基团可以是，例如胺基、烷基氨基、二烷基氨基、羟基、烷氧基、巯基或烷硫基。更典型的供电子基团可以是，例如氨基、烷基氨基、二烷基氨基或烷氧基。通常，9-位的吸电子基团会增长染料的吸收和发射波长。典型的吸电子基团可以是，例如氰基、全氟烷基、氨基羰基、烷基氨基羰基、烷基羰基、醛基、烷氧基羰基、氨基磺酸酯基(sulfonato)、烷基氨基磺酸酯基或卤素基团。更典型的吸电子基团可以是氰基、全氟烷基或卤素基团。 [0249] 一旦构建了吖啶核心结构，通常用卤代烷基烷化10-氮，该卤代烷基一般含有其它反应基团或可转变为反应基团的官能团。所述其它反应基团用于偶联吖啶染料和桥。下文方案1直接说明了制备具有合适反应基团的单体吖啶橙染料的几种方法。 [0250] 方案1 [0251] [0252] 直接如下文方案2所示，不难用氰基取代10-烷基化吖啶的9-位，该氰基可进一步水解为羧酰胺基团。 [0253] 方案2 [0254] [0255] 制备反应性单体不对称花青染料的方法已有描述。Carreon等，Org.Lett.6(4)，517(2004)。这种染料可直接如以下结构(结构11)所示。 [0256] 结构11 [0257] [0258] 美国专利号5,863,753公开了一系列反应性不对称花青染料，包括在喹啉 或吡啶 氮的邻位具有取代基的染料的制备方法。按照美国专利号5,436,134，据称这种在喹啉或吡啶 氮的邻位的取代基(特别是环状取代基)能赋予不对称花青染料所需的特性。通常将这些环状取代的不对称花青染料称为SYBR染料。Zipper等，Nucleic Acids Res.32(12)，e103(2004)。一些反应性SYBR染料可购自MolecularProbes，Inc.(Eugene，OR)，虽然这些染料的确切结构尚未知。Haugland，R.P.，Handbook ofFluorescent Probes and Research Chemicals(《荧光探针和研究化学品手册》)，第9版。 [0259] 美国专利申请公布号2004/0132046公开了具有小沟结合能力的单体不对称花青染料的制备方法。通常，这些染料因在染料的吲哚(benzazolyl)环上具有其它吲哚取代基而具有新月形结构。可采用相似方法(例如直接如以下方案3所示的)制备具有合适反应基团的类似单体染料。 [0260] [0261] 直接如以下方案4所示，可从商品化购得的3,8-二氨基-6-苯基菲啶制备反应性菲啶 染料。 [0262] 方案4 [0263] [0264] 如以上方案4所示，可用含反应基团的菲啶 中间体制备表2的第35号染料，只是举例。 [0265] 直接如以下方案5所示，可通过缩合2当量的间-氨基苯酚衍生物和1当量的二羧酸酐来制备在9-位有反应基团的派洛宁衍生物。 [0266] 方案5 [0267] [0268] 许多单体无荧光核酸结合染料是用于纺织业和墨水工业的已知色素，并可商品化购得。制备这些染料的参考见文献。许多合适的反应性单体荧光非核酸染料和无荧光非核酸染料可商品化购得或采用已知方法不难制备。 [0269] 合成桥 [0270] 当单体染料与通常可商品化购得的双官能或三官能基团偶联时通常形成桥。桥的末端部分一般来自单体染料自身，而桥的中间部分来自可商品化购得的双官能或三官能分子。在一些情况中，桥的显著部分(例如，最多约90%)可先与单体染料相连再最终装配成二聚体或三聚体染料。在一些其它情况中，可先单独制备桥的大部分，然后再连接诸单体染料。以异二聚体合成为例，通常先将单保护的双官能接头基团与一种单体染料相连，然后脱保护再与第二种单体染料偶联。可采用相似的分步保护-脱保护方案合成异三聚体染料。 [0271] 偶联单体染料与桥 [0272] 对于一些均二聚体，可采用一步偶联反应偶联具有合适反应基团的单体染料与二或三官能接头来装配二聚体或三聚体染料，或者对于异二聚体和三聚体或含有多个桥元件A的一些均二聚体，可以采用多步反应。所选择的均二聚体和异二聚体的合成途径例子直接如以下方案6所示。 [0273] 方案6 [0274] [0275] 制备均三聚体染料的例子直接如以下方案7所示。 [0276] 方案7 [0277] [0278] 具有反应基团的二聚体染料的制备方法的例子直接如以下方案8所示。 [0279] 方案8 [0280]实施例 [0281] 实施例1：制备10-(3-碘丙基)吖啶橙，碘化物 [0282] 将1当量的1,3-二碘丙烷加入10mL氯苯配制的5g吖啶橙(Aldrich)混悬液中。90-100℃搅拌得到的混合物过夜。将热的反应混合物倒入约200mL EtOAc中。过滤收集橙色沉淀物，真空干燥，得到约8g。 [0283] 实施例2：制备10-(5-羧基戊基)吖啶橙，氯化物盐 [0284] 采用实施例1的方法制备溴化10-(5-乙氧基羰基戊基)吖啶，除了用6-溴己酸乙酯(ethyl 6-bromohexanoic acid)替代1,3-二碘丙烷。将粗产物(5g)悬浮在约100mL甲醇与溶解于30mL H2O的3当量NaOH中。室温搅拌混悬液24小时。蒸发除去甲醇，用浓HCl酸化剩下的水溶液。加入约50mL饱和NaCl以沉淀产物。过滤收集产物，然后在45℃真空干燥24小时。 [0285] 实施例3：制备DMAO(表2的第1号染料) [0286] 在试管中将10-(3-碘丙基)吖啶橙，碘化物(100mg)悬浮在20mL甲醇配制的2M二甲胺中，然后60℃搅拌过夜。将混合物冷却至室温，然后倒入50mL EtOAc中。离心收集沉淀物，然后在40℃真空干燥24小时。 [0287] 实施例4：制备TMAO(表2的第2号染料) [0288] 将CH3OH(2mL)配制的DMAO(表2的第1号染料)(11mg，0.023mmol)和CH3I(0.5mL)的混合物温和回流4天。抽滤收集橙色产物(10mg)。 [0289] 实施例5：制备PMAO(表2的第5号染料) [0290] 将CH3OH(10mL)配制的10-(3-碘丙基)吖啶橙碘化物盐(100mg，0.l8mmol)和N,N,N’,N’-四甲基-l,3-丙二胺(0.3mL，1.8mmol)回流过夜。冷却至室温后，抽滤收集沉淀物。将沉淀物重悬在CH3OH(5mL)中，回流过夜，抽滤收集沉淀物。真空干燥至恒重得到暗红色固体(14mg)。 [0291] 实施例6：制备AOAO-2Q(表2的第9号染料) [0292] 将10-(3-碘丙基)吖啶橙碘化物盐(81mg，0.15mmol)和PMAO(100mg，0.15，mmol)在DMF(1.5mL)中的混合物在130℃加热7小时。冷却至室温后，加入CH3OH(15mL)，混悬液加热至回流1小时。抽滤得到暗红色固体状产物(83.1mg)。 [0293] 实施例7：制备AOAO-2(表2的第7号染料) [0294] 在室温将Et3N(0.15mL，1.05mmol)和TSTU(320mg，1.05mmol)加入10-(5-羧基戊基)吖啶橙氯化物盐(438mg，1.03mmol)的DMF(5mL)混悬液中。混合物在室温搅拌15分钟，然后加入Et3N(0.1mL)和3,3'-二氨基-N-甲基二丙胺(50mg，0.344mmol)。混合物在室温搅拌过夜后，加入EtOAc(20mL)以沉淀产物。将粗产物再次溶解于DMF中，用EtOAc使之再次沉淀出来。离心分离固体(250mg)。 [0295] 实施例8：制备AOAO-3(表2的第8号染料) [0296] 采用合成AOAO-2的方法从10-(5-羧基戊基)吖啶橙(432mg，1.03mmol)和乙二胺(25mg，0.42mmol)制备该染料(393mg)。 [0297] 实施例9：制备溴化10-(8-溴辛基)吖啶橙 [0298] 将吖啶橙(2g，7.53mmol)和1,8-二溴辛烷(dibromoactane)(12mL，67.8mmol)的氯苯(15mL)混合物在110℃加热过夜。加入EtOAc(50mL)，混悬液回流1小时。冷却至室温后，抽滤得到橙色固体状产物(3.56g)。 [0299] 实施例10：制备AOAO-5(表2的第11号染料) [0300] 溴化10-(8-溴辛基(bromoactyl))吖啶橙(0.5g，0.94mmol)和吖啶橙(0.3g，11.2mmol)的DMF(5mL)混合物在130℃加热过夜。加入EtOAc以沉淀产物。用DMF和EtOAc反复沉淀得到暗红色固体状产物(214mg)。 [0301] 实施例11：制备AOAO-7(表2的第13号染料) [0302] 采用制备AOAO-2的方法从10-(5-羧基戊基)吖啶橙氯化物盐(121mg，0.29mmol)和1,5-二氨基-戊烷二盐酸盐(20mg，0.12mmol)合成该染料(30mg)。 [0303] 实施例12：制备AOAO-8(表2的第15号染料) [0304] 采用制备AOAO-2的方法从10-(5-羧基戊基)吖啶橙氯化物盐(241mg，0.58mmol)和哌嗪(20mg，0.23mmol)合成该染料(182mg)。 [0305] 实施例13：制备AOAO-11(表2的第18号染料) [0306] 采用制备AOAO-2的方法从10-(5-羧基戊基)吖啶橙氯化物盐(180mg，0.43mmol)和1,8-二氨基-辛烷(25mg，0.17mmol)合成该染料(112mg)。 [0307] 实施例14：制备AOAO-12(表2的第19号染料) [0308] 采用制备AOAO-2的方法从10-(5-羧基戊基)吖啶橙氯化物盐(147mg，0.35mmol)和2,2’氧双(乙基-胺)二盐酸盐(25mg，0.14mmol)合成该染料(76mg)。 [0309] 实施例15：制备AOAO-13(表2的第20号染料) [0310] 采用制备AOAO-2的方法从10-(5-羧基戊基)吖啶橙氯化物盐(96mg，0.23mmol)和4,7,10-三氧杂-1,13-十三烷二胺(20mg，0.09mmol)合成该染料(64mg)。 [0311] 实施例16：制备1,3-二-((2-(N-叔丁氧羰基-氨基)乙基)氨基羰基)苯(第101号染料，直接如下所示) [0312] [0313] 在室温将Et3N(0.4mL，2.71mmol)和TSTU(820mg，2.71mmol)加入间苯二酸(220mg，1.32mmol)的DMF(2mL)溶液中。混合物在室温搅拌30分钟。然后加入Et3N(1mL)和单-叔丁氧羰基-乙二胺(460mg，2.86mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜，然后在1N HCl(100mL)和EtOAc(50mL)之间分配。用EtOAc(50mL)萃取水层，用1N HCl(2×50mL)、H2O(50mL)和饱和NaCl(50mL)洗涤合并的有机层，无水Na2SO4干燥。用EtOAc:己烷(9:1)作为洗脱剂通过柱层析纯化粗产物得到无色固体产物(356mg)。 [0314] 实施例17：制备l,3-二-((2-氨基乙基)氨基羰基)苯，三氟乙酸盐(第102号染料，直接如下所示) [0315] [0316] 在0℃将1,3-二-((2-(N-叔丁氧羰基-氨基)乙基)氨基羰基)苯(356mg，0.79mmol)加入TFA(5mL)中。0℃搅拌混合物1小时，真空浓缩溶液至干。将无色残留物溶解于CH3OH(2mL)中，滴加入Et2O(30mL)中。离心收集沉淀物，真空干燥至恒重得到固体产物(425mg)。 [0317] 实施例18：制备AOAO-9(表2的第16号染料) [0318] 采用制备AOAO-2的方法从10-(5-羧基戊基)吖啶橙氯化物盐(109mg，0.26mmol)和1,3-二((2-氨基乙基)氨基羰基)苯，三氟乙酸盐(50mg，0.1mmol)合成该染料(55mg)。 [0319] 实施例19：制备1,3-二((5-(N-叔丁氧羰基-氨基)戊基)氨基羰基)苯(第103号染料，直接如下所示) [0320] [0321] 按照制备1,3-二-((2-(N-叔丁氧羰基-氨基)乙基)氨基羰基)苯的方法从间苯二酸(254mg，1.53mmol)和单-叔丁氧羰基尸胺(640mg，3.15mmol)合成该染料(555mg)。 [0322] 实施例20：制备1,3-二-((5-氨基戊基)氨基羰基)苯，三氟乙酸盐(第104号染料，直接如下所示) [0323] [0324] 按照第102号染料(555mg，1.04mmol)的方法制备该染料(560mg)。 [0325] 实施例21：制备AOAO-10(表2的第17号染料) [0326] 采用制备AOAO-2的方法从10-(5-羧基戊基)吖啶橙氯化物(95mg，0.23mmol)和第104号染料(50mg，0.09mmol)制备该染料(22mg)。 [0327] 实施例22：制备AOAO-14(表2的第21号染料) [0328] 采用制备AOAO-2的方法从10-(5-羧基戊基)吖啶橙氯化物(166mg，0.40mmol)和二酰胺基(diamido)-dPEG-二胺(Quanta Biodesign of Powell，俄亥俄州)(100mg，0.15mmol)合成该染料(150mg)。 [0329] 实施例23：制备10-((((3-(N-叔丁氧羰基-氨基)丙基)-N,N-二甲基)铵)丙基)吖啶，二碘化物(第105号染料，直接如下所示) [0330] [0331] 将碘化10-(3-碘丙基)吖啶橙(500mg，0.89mmol)和3-(N-叔丁氧羰基-氨基)丙基-N,N-二甲胺(1.8g，8.9mmol)的CH3OH(50mL)混合物回流过夜。冷却至室温后，抽滤收集沉淀物，真空干燥至恒重得到橙色固体状的第105号染料(292mg)。 [0332] 实施例24：制备10-((((3-铵)丙基)-N,N-二甲基)铵)丙基吖啶，三氟乙酸盐(第106号染料，直接如下所示) [0333] [0334] 在0℃将第105号染料(50mg，0.06mmol)加入TFA(2mL)中。0℃搅拌混合物30分钟。真空浓缩溶液至干，将残留物溶解于CH3OH(3mL)中。将溶液滴加入Et2O(30mL)中，离心收集沉淀物，真空干燥至恒重得到橙色固体状的第106号染料(28mg)。 [0335] 实施例25：制备AOAO-4(表2的第10号染料) [0336] 采用制备AOAO-2的方法从10-(5-羧基戊基)吖啶橙氯化物盐(31mg，0.075mmol)和第106号染料(28mg，0.036mmol)合成该染料(23mg)。 [0337] 实施例26：制备10-(6-(N-邻苯二甲酰亚胺基)己基)吖啶橙溴化物盐(第107号染料，直接如下所示) [0338] [0339] 将吖啶橙(2g，7.54mmol)和N-(6-溴己基)邻苯二甲酰亚胺(4.7g，15.1mmol)的氯苯(20mL)混合物在110℃加热2天。加入EtOAc(50mL)，将混悬液加热至回流1小时。冷却至室温后，抽滤收集橙色固体状的产物第107号染料(3.76g)。 [0340] 实施例27：制备10-(5-((5-羧基戊基)氨基羰基)戊基)吖啶橙，碘化物(第108号染料，直接如下所示) [0341] [0342] 将Et3N(40μL，0.28mmol)和TSTU(81mg，0.27mmol)加入氯化10-(5-羧基戊基)吖啶橙(107mg，0.258mmol)的DMF(3mL)混悬液中。混合物在室温搅拌15分钟。然后加入Et3N(0.2mL)以及6-氨基己酸(67mg，0.51mmol)的H2O(1mL)溶液。混合物在室温搅拌1小时，真空浓缩至干。用H2O研磨残留物得到橙色固体状的第108号染料(125mg)。 [0343] 实施例28：制备9-氰基-10-(5-羧基戊基)吖啶橙，氯化物(第109号染料，直接如下所示) [0344] [0345] 室温下将10-(5-羧基戊基)吖啶橙(0.15g，0.361mmol)和氰化钠(35mg，0.722mmol)的DMF(3mL)混合物户外(in open air)搅拌2天。加入CH3CN(10mL)，得到的混悬液在室温搅拌1小时。离心收集深蓝色沉淀物，真空干燥至恒重得到第109号染料(130mg)。 [0346] 实施例29：制备AOAO-12R(表2的第22号染料) [0347] 室温下将Et3N(32μL，0.23mmol)和TSTU(68mg，0.227mmol)加入第109号染料(98.3mg，0.223mmol)的DMF(2mL)溶液中。混合物在室温搅拌15分钟。然后加入Et3N(100μL)和2,2'-氧双-(乙基胺)二盐酸盐(16mg，0.09mmol)。混合物在室温搅拌2天。将溶液浓缩至约1mL，加入EtOAc(2mL)。离心收集沉淀物。将产物再次溶解于DMF，再用EtOAc沉淀得到深蓝色固体状的第22号染料(54.4mg)。 [0348] 实施例30：制备9-氨基羰基-10-(5-羧基戊基)吖啶(第110号染料，直接如下所示)[0349] [0350] 将第109号染料(30mg，0.068mmol)在75%H2SO4(1mL)中的溶液于60℃加热2天。冷却至室温后，将混合物加入Et2O(10mL)中。离心收集沉淀物，再次溶解于CH3OH(1.5mL)。加入EtOAc(10mL)，离心收集固体沉淀物，真空干燥至恒重得到深粉色固体状的第110号染料(20.4mg)。 [0351] 实施例31：制备N-羧基戊基噻唑橙(直接如下所示) [0352] [0353] 采用已公开的方法制备该染料(Carreon等，Org.Let.6(4)，517(2004))。 [0354] 实施例32：制备TOTO-3(表2的第14号染料) [0355] 采用合成AOAO-2的方法从N-羧基戊基噻唑橙(460mg，1.04mmol)和乙二胺(25mg，0.42mmol)合成该染料(354mg)。 [0356] 实施例33：制备10-(5-((2-(N-叔丁氧羰基-氨基)乙基)氨基羰基)戊基)吖啶橙氯化物盐(第111号染料，直接如下所示) [0357] [0358] 将Et3N(106μL，0.76mmol)和TSTU(230mg，0.76mmol)加入氯化10-(5-羧基戊基)吖啶橙(302mg，0.73mmol)的DMF(3mL)混悬液中。混合物在室温搅拌15分钟。然后加入Et3N(350μL)和单叔丁氧羰基-乙二胺(150mg，0.92mmol)。混合物在室温搅拌1小时，然后真空浓缩至干。将残留物溶解于CH3CN(2mL)，加入EtOAc(20mL)沉淀。离心收集沉淀物，干燥至恒重得到橙色固体状的第111号染料(365mg)。 [0359] 实施例34：制备10-(5-((2-铵乙基)氨基羰基)戊基)吖啶橙，三氟乙酸盐(第112号染料，直接如下所示) [0360] [0361] 在5℃将第111号染料(347mg，622mmol)一次性加入三氟乙酸(3mL)中。混合物在5℃搅拌1小时，真空浓缩至干。将残留物溶解于CH3OH(3mL)，滴加入Et2O(50mL)中。离心收集沉淀得到橙色固体状的第112号染料(297mg)。 [0362] 实施例35：制备AOTO-3(表2的第23号染料) [0363] 将Et3N(20μL，0.142mmol)和TSTU(42.2mg，0.142mmol)加入N-羧基戊基噻唑橙(62mg，0.142mmol)的DMF(1mL)溶液中。混合物在室温搅拌15分钟。然后加入Et3N(70μL)和第112号染料(50mg，0.095mmol)。混合物在室温搅拌2小时，然后真空浓缩至干。将残留物再次溶解于DMF(1mL)，加入EtOAc(2mL)。离心收集沉淀物。用DMF和EtOAc反复沉淀得到橙红色固体状的产物(50.4mg)。 [0364] 实施例36：制备TOTO-12(表2的第24号染料) [0365] 采用合成AOAO-2的方法从N-羧基戊基噻唑橙(94.5mg，0.2145mmol)和2,2'-氧双(乙基胺)二盐酸盐(15mg，0.085mmol)合成该染料(19.4mg)。 [0366] 实施例37：制备TO(3)TO(3)-12(表2的第25号染料) [0367] 采用合成AOAO-2的方法从N-羧基戊基噻唑蓝(99mg，0.212mmol)(Carreon等，Org.Let.6(4)，517(2004)；和Benson等，Nucleic Acid Res.21(24)，5727(1993))和2,2'-氧双(乙基胺)二盐酸盐(15mg，0.085mmol)合成该染料(32.6mg)。 [0368] 实施例38：制备TO(3)TO(3)-2(表2的第26号染料) [0369] 采用合成AOAO-2的方法从N-羧基戊基噻唑蓝(76mg，0.173mmol)和3,3'-二氨基-N-甲基二-丙胺(10mg，0.069mmol)合成该染料(28.4mg)。 [0370] 实施例39：制备10-(5-((5-(N-叔丁氧羰基-氨基)戊基)氨基羰基)戊基)-吖啶橙，氯化物(第113号染料，直接如下所示) [0371] [0372] 采用合成第111号染料的方法从氯化10-(5-羧基戊基)吖啶橙(200mg，0.483mmol)和单叔丁氧羰基-尸胺(130mg，0.628mmol)制备该染料(280mg)。 [0373] 实施例40：制备10-(5-((5-铵戊基)氨基羰基)戊基)吖啶橙，三氟乙酸盐(第114号染料，直接如下所示) [0374] [0375] 采用合成第112号染料的方法从第113号染料(280mg，0.467mmol)制备第114号染料(234mg)。 [0376] 实施例41：制备AORO-7(表2的第27号染料) [0377] 采用合成AOTO-3的方法从第114号化合物(35mg，0.061mmol)和亚硝基氨染料(Biotium，Inc.(Hayward，加利福尼亚))(40mg，0.063mmol)制备该化合物(29mg)。 [0378] 实施例42：DMAO和AOAO-7的吸收和荧光(光谱) [0379] 分别在没有或有DNA(2mg／ml鲑鱼精子DNA)存在下检测DMAO和AOAO-7在PBS缓冲液中的吸收光谱(图2和图3所示)和荧光发射光谱(图4所示)。调整所有染料的浓度以使495nm的光密度为0.05。在吸收(光谱)图中将光谱标准化至1。与DMAO相比，AOAO-7在吸收(光谱)中显示在471nm有新的较短波长峰，这表明AOAO-7内有两种吖啶单体聚集。与游离染料相比，AOAO-7和DMAO在结合DNA后的吸收(光谱)分别显示5nm和10nm-红移。游离AOAO-7的荧光比DMAO的低约5倍。AOAO-7较低的背景荧光优选用于实时qPCR。AOAO-7的每个吖啶单体的荧光接近DMAO的，表明与DNA结合时AOAO-7的两个单体不再彼此猝灭，两个单体之间的接头对量子产率未显示不利影响。 [0380] 实施例43：TOTO-1和TOTO-3的吸收光谱 [0381] 以类似于实施例42所述的方式，在没有DNA存在(图5所示)和有2mg／ml鲑鱼精子DNA存在下(图6所示)检测TOTO-1和TOTO-3在PBS缓冲液中的吸收光谱。如图5所示，游离染料的光谱表明具有桥(中性或基本上无正电荷)的TOTO-3形成分子内H-二聚体或发夹结构，而TOTO-1(具有多个正电荷)光谱偏移较少。如图6所示，在有DNA存在下TOTO-1和TOTO-3的吸收光谱大致向同一位置偏移，表明TOTO-3二聚体与DNA结合后打开了发夹结构，TOTO-1和TOTO-3均形成相似类型的DNA-染料复合物。 [0382] 实施例44：AOAO-12对不同量的DNA的荧光响应 [0383] 在有0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10μg/ml终浓度的鲑鱼精子DNA或单链20聚体寡核苷酸的混合物存在下，用微量滴定板读数计(SpectraMax of Molecular Devices Corporation(Sunnyvale，加利福尼亚))检测0.1μM AOAO-12在200mL PBS中的荧光。如图7所示，用荧光对DNA浓度作图。可以看出荧光对DNA呈线性响应直到2.0μg/ml(插入图)。DNA浓度较高时，响应变得非线性。AOAO-12结合双链DNA发出的荧光强于结合单链DNA的。 [0384] 实施例45：比较qPCR中AOAO-12与SYBR绿I的信号强度 [0385] 本实施例证明在qPCR的荧光信号强度方面AOAO-12的特性优于SYBR绿I。所有实时扩增(反应)均在含有以下成分的20μL反应溶液中进行：10mM Tris(pH8.0)、50mM KCl、3.5mM MgCl2、2mM各种dNTP和1单位的AmpliTaq DNA聚合酶(ABI，Foster City，加利福尼亚)和各种浓度的荧光监测染料。用0.5μM正向引物5'-GAGGTCTTCACAGGTCATA-3'(SEQ ID NO:2)、0.5μM反向引物5'-CTCTTCAGCCAGCTTATC-3'(SEQ ID NO:3)扩增pTOTO质粒中的ATPB片段(SEQ ID NO:1)。热方案设定为95℃，1分钟；然后是在95℃持续15秒，在55℃持续15秒和在72℃持续15秒，共50轮。在55℃阶段检测荧光。与早期的报道一致(Nath，K.等，Effects of ethidium bromide and SYBR Green I ondifferent polymerase chain reaction systems(“溴化乙锭和SYBR绿I对不同聚合酶链式反应系统的影响”)，J.Biochem Biophys Methods 42，15(2000))，SYBR绿I如图8所示对PCR反应显示有抑制作用，其中SYBR绿I浓度较高时Ct延迟。与SYBR绿I浓度相比，可将较高浓度的AOAO-12加入反应而不会显示抑制作用。结果，用AOAO-12时的最终荧光强度可高出数倍，从而能进行更灵敏的检测。或者，利用AOAO-12可在热循环荧光计中使用灵敏度较低的光学器件，从而使仪器成本降低。 [0386] 实施例46：人基因组DNA的滴定 [0387] 在类似于实施例45所述的条件下，用SYBR绿I(495nm的最终吸收峰对应于0.025的光密度，或A495=0.025)或AOAO-12(最终A495=0.1)扩增人基因组DNA的UBC片段(SEQ ID NO:8)，除了(1)使用不同正向和反向引物组(5'-ACTGGTAAGACCATCACC-3'(SEQ ID NO:9)和5'-GCAATGAAATTTGTTGAA-3'(SEQ IDNO:10))，和(2)一系列稀释10倍的人DNA用作模板。图8显示了含SYBR绿I或AOAO-12的反应的扩增图，该反应从人DNA的105份拷贝下至10份拷贝开始。插入图显示用两种染料均监测到Ct值与起始拷贝数的对数逆相关。AOAO-12的荧光强度明显优于SYBR绿I。 [0388] 实施例47：qPCR中的TO，TOTO-1和TOTO12 [0389] 本实施例证明在qPCR中TOTO-12的特性优于TO(噻唑橙，一种不对称花青染料)或TOTO-1。按照实施例5进行所有实时扩增，除了用TO、TOTO-1和TOTO-12。如图11所示，在qPCR中，TOTO-1完全抑制PCR反应，而TOTO-12的Ct和荧光强度优于TO。TOTO-12二聚体染料优于TO和TOTO-1染料中每一种。 [0390] 实施例48：AORO-7的吸收和荧光(光谱) [0391] 如图12所示，以类似于实施例42所述的方式获得PBS缓冲液中单用AORO-7或在有2mg／ml鲑鱼精子DNA存在下的AORO-7的吸收光谱。图13显示了AORO-7与DNA结合的发射光谱。异二聚体染料AORO-7含有单体AO染料和荧光非核酸亚硝基氨RO染料。记录了AO和RO部分分别导致的两个发射峰。使用Bio-RadLaboratories(Hercules，加利福尼亚)的Chromo4在通道1中(激发设置为490nm，在530nm收集发射光谱，或Ex490/Em530)或通道3中(Ex580/Em630))的AORO-7可以记录qPCR，但只在通道2(Ex520/Em570)中微弱(数据未显示)。由于荧光共振能量转移(FRET)作用可忽略不计，各种单体染料成分AO或RO均可选作报道染料。 [0392] 实施例49：qPCR中的异二聚体染料AORO-7 [0393] 该实施例证明了AORO-7在qPCR中的用途。按照实施例5进行实时扩增，除了在最终溶液中使用600nm处光密度为0.025的AORO-7。如图14所示，AORO-7可有效地用于监测qPCR反应进程，检测扩增子的解链曲线(插入图)。用Bio-RadLaboratories(Hercules，加利福尼亚)的iCycle IQ多色实时PCR检测系统的通道3(Ex580/Em630)能监测该qPCR这一发现为采用本文公开的方法将波长理想的几乎任何染料特制为qPCR的DNA报道染料提供了实例，因而拓宽了qPCR监测的光谱应用。目前，大多数TaqMan探针使用占据SYBR绿I相同通道的FAM或VIC。在qPCR中优选使用序列特异性探针，例如TaqMan探针，和波长不同的非序列特异性染料，例如AORO-7，其中所述探针提供序列特异性，而所述染料提供扩增子的其它参数，例如解链温度。 [0394] 实施例50：用AOAO-12监测的解链峰 [0395] 据报道，SYBR绿I因能在qPCR扩增后检测扩增子的解链温度而是有利的，解链温度能提供关于扩增子的有价值信息，因为它是扩增子大小和GC含量的函数。从TaqMan反应不能收集解链温度。从有AOAO-12(图A)或SYVR绿(图B)存在下进行的扩增反应中测定4种扩增子，即HMBS(SEQ ID NO:4)、RPL4(SEQID NO:5)、SDHA(SEQ ID NO:6)和TBP(SEQ ID NO:7)的解链曲线，见图15。用AOAO-12收集的解链峰与用SYBR绿I收集的解链峰相关良好。因为AOAO-12以高亲和力与DNA结合，但不如SYBR绿I紧密，AOAO-12的解链温度比SYBR绿I的低两度。因为较高浓度的AOAO-12可用于实时PCR反应，解链峰明显较高。该数据证明了AOAO-12的相对用途。 [0396] 有报道说含SYBR绿I的qPCR反应易于形成引物二聚体，该倾向与SYBR绿I的浓度密切相关。估计是SYBR绿I与DNA结合得非常紧密，从而干扰了TaqDNA聚合酶的性能。由于AOAO-12对DNA的亲和力较低，应能减轻这种干扰作用。从图15可明显看出AOAO-12的这种特性，即在有SYBR绿I存在下的HMBS扩增反应具有额外的引物二聚体峰，而在有AOAO-12存在下的相同扩增反应只显示干净、明确的单峰。 [0397] 实施例51：AOAO染料的稳定性 [0398] 证明了含单体AO的二聚体染料的稳定性。具体地说，AOAO-12与PCR产物一起维持于PCR反应的缓冲液中。将混合物加热至96℃，维持40分钟。在加热期间，使混合物快速降温至60℃以监测荧光。如图16所示，AOAO-12在96℃维持40分钟稳定，基本上没有荧光丧失。该数据证明AOAO-12在PCR中的耐用性(robustness)。 [0399] 实施例52：制备TOTO-13(表2的第29号染料) [0400] 采用合成AOAO-2(表2的第7号染料)的方法从N-羧基戊基噻唑橙(102mg，0.23毫摩尔)(实施例31)和4,7,10-三氧杂-1,13-十三烷二胺(23mg，0.1摩尔)制备该染料(102mg)。 [0401] 实施例53：制备溴化N-(5-羧基戊基)-4-(4-(二甲基氨基)苯乙烯基)吡啶 4-N,N-二甲基氨基苯醛(3g，20毫摩尔)、溴化N-(5-羧基-戊基)甲基吡啶 (5.6g，20毫摩尔)和哌啶(2mL)的乙醇(100mL)混合物在60℃加热过夜。真空蒸发混合物至干。将残留物再次溶解于甲醇，然后用乙醚沉淀得到产物(6.7g)。 [0402] 实施例54：制备STST-19(表2的第31号染料) [0403] 采用制备AOAO-2(实施例7)的方法从溴化N-(5-羧基戊基)-4-(4-(二甲基氨基)苯乙烯基)吡啶 (实施例53)(200mg，0.5毫摩尔)和2,2'-氧双(乙基胺)二盐酸盐(36mg，0.2毫摩尔)制备该染料(85mg)。 [0404] 实施例55：制备STST-27(表2的第30号染料) [0405] 采用制备AOAO-2(实施例7)的方法从溴化N-(5-羧基戊基)-4-(4-(二甲基氨基)苯乙烯基)吡啶 (实施例53)(200mg，0.5毫摩尔)和4,7,10-三氧杂-1,13-十三烷二胺(44mg，0.2毫摩尔)制备该染料(81.8mg)。 [0406] 本文描述了一种有用的染料，二聚体或三聚体染料。这种染料可具有许多理想的特性，例如背景荧光较低，PCR抑制作用较低、荧光信号强度良好和稳定性良好。最多具有一个正电荷的染料通常可用于许多领域，例如用于标记另一种分子以及用于检测是否存在核酸。此外，基本上中性的这种染料通常可用于许多领域，例如用于PCR方法或用于检测是否存在核酸，或用于定量实时PCR。 [0407] 已描述了许多有用的二聚体和三聚体染料。例如，已描述了适用于与另一种分子共价偶联，或标记另一种分子的染料，从而将该染料检测核酸的能力赋予该分子；适用于检测可能含有或不含有核酸的样品中是否存在核酸的染料；和适用于检测样品中的核酸形成或缺乏核酸形成的染料，如经过合适的核酸扩增步骤的样品(如果样品中含有靶核酸的话)。也描述了任何上述染料的制备方法和任何上述染料的使用方法。本文考虑了使用本文所述合成物的任何使用方法。本文考虑了适用于检测样品中的核酸形成或缺乏核酸形成的试剂盒，所述试剂盒含有本发明的合适染料以及足以扩增样品中靶核酸(如果该样品存在靶核酸的话)的合适组合物，例如含有本文所述有用组合物的任何试剂盒。 |
||
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈