聚阳离子载体粒子

专利类型 发明公开 法律事件 公开;
专利有效性 公开 当前状态 公开
申请号 CN202380056250.4 申请日 2023-06-08
公开(公告)号 CN119604310A 公开(公告)日 2025-03-11
申请人 奥立达生命科学公司; 申请人类型 企业
发明人 萨曼莎·罗斯; 米切尔·阿巴思诺特·约翰逊; 妮科尔·阿里达·曼贾科特; 尼古拉斯·亚历山大·德斯帕德·伯克; 哈拉尔德·唐纳德·赫尔穆特·斯托弗; 第一发明人 萨曼莎·罗斯
权利人 奥立达生命科学公司 权利人类型 企业
当前权利人 奥立达生命科学公司 当前权利人类型 企业
省份 当前专利权人所在省份: 城市 当前专利权人所在城市:
具体地址 当前专利权人所在详细地址:加拿大安大略省 邮编 当前专利权人邮编:
主IPC国际分类 A61K47/32 所有IPC国际分类 A61K47/32A61K9/14A61K9/50A61K39/00A61K47/69C07C219/08C07D295/088C08F220/26C08F220/34C12N15/87C08J3/20
专利引用数量 0 专利被引用数量 0
专利权利要求数量 32 专利文献类型 A
专利代理机构 北京康信知识产权代理有限责任公司 专利代理人 殷爽;
摘要 一种通过多 丙烯酸 酯 单体 与一种或多种亲 水 性单体的聚合形成交联而获得的聚阳离子载体粒子。聚阳离子载体粒子具有净正电荷。多丙烯酸酯单体和亲水性单体如本文所定义。
权利要求

1.一种通过丙烯酸单体与一种或多种亲性单体的聚合以形成交联而获得的聚阳离子载体粒子,其中所述聚阳离子载体粒子具有净正电荷,并且其中所述丙烯酸酯单体选自式I或式V
并且其中R和R”各自独立地为氢、C1‑C14直链或支链烷基、C3‑C8环烷基或5至10元芳基或杂芳基环,任选地被能够与一种或多种亲水性单体交联的可聚合基团、优选丙烯酸酯基团封端,
R’为C2‑C14直链或支链烷基、C3‑C8环烷基或5至10元芳基或杂芳基环,R’被至少一种能够与一种或多种亲水性单体交联的可聚合基团、优选丙烯酸酯基团封端,
所述烷基、环烷基、芳基和杂芳基能够被一个或多个、硫或氮原子任选地取代且任选地中断,并且
R2为C2或C3,并且其中C3是直链的或环状的。
2.根据权利要求1所述的聚阳离子载体粒子,其中可聚合基团选自丙烯酸酯基团、甲基丙烯酸酯基团、(甲基)丙烯酰胺基团或苯乙烯基团。
3.根据权利要求1或2所述的聚阳离子载体粒子,其中式I的丙烯酸酯单体是式II的多丙烯酸酯单体
其中R1为氢或C1‑C14直链、支链或环状烷基,被一个或多个氧、硫或氮原子任选地取代且任选地中断并且任选地被丙烯酸酯基团封端,
R2为C2或C3,并且其中C3是直链的或环状的,
R3为C2‑C14直链或支链烷基,其被一个或多个氧、硫或氮原子任选地取代且任选地中断。
4.根据权利要求3所述的聚阳离子载体粒子,其中所述多丙烯酸酯单体为式III其中R1和R2为权利要求2中所定义的,且R4为‑CH2‑CH2‑O‑或‑CH2‑CH2‑CH2‑O‑,R4的末端CH2基团与末端丙烯酸酯基团的氧化物连接,并且n为选自1、2、3或4的整数。
5.根据权利要求3所述的聚阳离子载体粒子,其中所述多丙烯酸酯单体为式IV其中R1和R2为权利要求2中所定义的,R1’具有与R1相同的定义,R2’为C2‑C3且其中C3为直链或环状的,并且m为选自0、1、2、3或4的整数。
6.权利要求1至5中任一项所述的聚阳离子载体粒子,其中式V的丙烯酸酯单体是式VI的多丙烯酸酯单体
其中R1和R5独立地为氢或C1‑C14直链、支链或环状烷基,被一个或多个氧、硫或氮原子任选地取代且任选地中断,并且任选地被丙烯酸酯基团封端,
R2为C2或C3,且其中C3是直链的或环状的,
R3为C2‑C14直链或支链烷基,被一个或多个氧、硫或氮原子任选地取代且任选地中断。
7.根据权利要求6所述的聚阳离子载体粒子,其中所述多丙烯酸酯单体为式VII其中R1和R5为权利要求6中所定义的,且R4为‑CH2‑CH2‑O‑或‑CH2‑CH2‑CH2‑O‑,R4的末端CH2基团与末端丙烯酸酯基团的氧化物连接,并且n为选自1、2、3或4的整数。
8.根据权利要求5所述的聚阳离子载体粒子,其中一个或多个氮原子被质子化。
9.根据权利要求8所述的聚阳离子载体粒子,其中所述多丙烯酸酯单体具有式VIII其中R1和R5为权利要求6中所定义的,R2为C2或C3,且其中C3为直链或环状的,m为选自0、
1、2、3或4的整数,且R1’、R2’和R5’独立地共享R1、R2和R5的定义。
10.根据权利要求1所述的聚阳离子载体粒子,其中所述丙烯酸酯单体选自:
11.根据权利要求1至3中任一项所述的聚阳离子载体粒子,其中多丙烯酸酯单体是甲基二乙醇胺二丙烯酸酯(DXL)。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的聚阳离子载体粒子,其中所述亲水性单体为式IX
+
其中R6为‑O‑(CH2)p‑Y、‑NJK或‑NJ2K,p是选自2、3或4的整数,Y被定义为OH、COOH、NJ2、+
NJ3或ONJ2,并且每个J被独立地定义为H、甲基或乙基,并且K为任选地支化的且任选地取代的乙基、丙基或丁基,并且R7为氢或甲基。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的聚阳离子载体粒子,其中所述亲水性单体为式X
其中R8为C2‑C4直链烷基,并且X选自羟基、羧基、叔胺、季铵或酰胺,并且胺任选地被甲基或乙基取代。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的聚阳离子载体粒子,其中所述一种或多种亲水性单体是2‑羟基乙基丙烯酸酯(HEA)和/或N,N‑(二甲基基)乙基丙烯酸酯(DMAEA)。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的聚阳离子载体粒子,其中所述聚阳离子载体粒子具有200nm至5μm的尺寸。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的聚阳离子载体粒子,其中所述丙烯酸酯单体与所述一种或多种亲水性单体的摩尔百分比为15/85至50/50。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的聚阳离子载体粒子,还包括与所述聚阳离子载体粒子复合的负载材料。
18.一种复合物,包含与负载分子复合的聚阳离子载体粒子,所述聚阳离子载体粒子适于在细胞内释放负载分子,并且在生理条件下能够降解,并且其中所述聚阳离子载体粒子具有电荷转移性质,并且是通过使一种或多种亲水性单体与权利要求1中所定义的式I或式V的丙烯酸酯单体聚合而获得的。
19.一种制备权利要求1至17中任一项所定义的聚阳离子载体粒子的方法,所述方法包括:
提供在权利要求1至11中任一项中所定义的丙烯酸酯单体和在权利要求1‑14中任一项中所定义的一种或多种亲水性单体,
使所述丙烯酸酯单体与所述一种或多种亲水性单体交联。
20.根据权利要求19所述的方法,其中交联步骤包括进行沉淀聚合、微乳液聚合、分散聚合、反相悬浮聚合或反相乳液聚合中的一种。
21.根据权利要求19或20中任一项所述的方法,其中仅提供一种亲水性单体,并且所述丙烯酸酯单体与所述亲水性单体的摩尔百分比为30±15/70±15。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的方法,其中提供两种亲水性单体,并且所述丙烯酸酯单体与所述两种亲水性单体的摩尔百分比为33±10/33±10/33±10。
23.根据权利要求21所述的方法,其中所述一种亲水性单体是HEA,且所述丙烯酸酯单体是DXL。
24.根据权利要求22所述的方法,其中所述两种亲水性单体是HEA和DMAEA,且所述丙烯酸酯单体是DXL。
25.根据权利要求19至24中任一项所述的方法,还包括提供待包封的试剂,并在包含所述试剂的介质中使所述丙烯酸酯单体与所述一种或多种亲水性单体交联。
26.一种生产负载材料与聚阳离子载体粒子的复合物的方法,包括:
通过根据权利要求19至24中任一项所述的方法生产所述聚阳离子载体粒子;以及通过将所述聚阳离子载体粒子暴露于含有负载材料的溶液中,将具有负电荷的所述负载材料复合到具有正电荷的所述聚阳离子载体粒子上,从而获得所述复合物。
27.一种对有需要的受试者递送疫苗的方法,所述方法包括向所述受试者施用权利要求1至17中任一项所述的聚阳离子载体粒子,其中所述聚阳离子载体粒子与疫苗试剂复合或包封疫苗组合物。
28.一种在体内诱导免疫反应的方法,包括向有需要的受试者施用权利要求1至17中任一项所述的聚阳离子载体粒子,所述聚阳离子载体粒子与抗原或编码抗原的核酸复合或包封疫苗组合物。
29.一种用于体内蛋白质表达的核酸递送方法,包括向受试者施用权利要求1至17中任一项所述的聚阳离子载体粒子,其中所述聚阳离子载体粒子与编码蛋白质的核酸复合。
30.一种疫苗组合物,包含与抗原或编码抗原的核酸复合的权利要求1至17中任一项所述的聚阳离子载体粒子和药学上可接受的载体或佐剂。
31.根据权利要求30所述的疫苗组合物,其中所述核酸是mRNA。
32.权利要求18的所述复合物,其中所述负载分子选自核酸、肽和蛋白质。

说明书全文

聚阳离子载体粒子

[0001] 相关申请的引用
[0002] 本申请要求2022年6月8日提交的美国临时申请No.63/350,275的优先权,该美国临时申请的内容通过引用并入本文。

技术领域

[0003] 本公开涉及用于治疗剂、疫苗等的载体粒子领域,更具体地,涉及聚阳离子粒子以及其方法和用途及其制备。

背景技术

[0004] 体内递送蛋白质和以多核酸(诸如mRNA、DNA和siRNA)形式的遗传物质具有从基因敲除和编辑到基于mRNA/DNA和蛋白质的疫苗的广泛的治疗应用潜。将蛋白质和多核苷酸
应用于体内治疗的成功取决于将所需的遗传负载在细胞内递送到靶细胞的能力。这种蛋白
质和大的多核酸的递送需要使用递送载体,以在循环期间为负载提供稳定性,并通常通过
内吞作用促进细胞摄取。
[0005] 许多基于合成材料的方法已被用于生产递送媒介物。最值得注意的是,由辉瑞和莫德纳开发的用于COVID‑19的mRNA的基于脂质纳米粒子的递送获得了广泛的临床成功。聚
阳离子也已被探索为用于核酸复合和蛋白质递送的合成材料。蛋白质在内吞作用之前受到
聚阳离子载体粒子的保护,并通过质子海绵效应从内体中释放出来。合成聚阳离子优于脂
质纳米粒子的益处包括易于生产、稳定性、低成本,以及对聚合物架构和组成的合成控制
(允许诸如循环时间、释放动力学和靶向细胞递送的特征的可调性)。
[0006] 例如,在递送核酸材料中使用聚阳离子的一个重大挑战是聚阳离子的相关一般细胞毒性。在细胞摄取后,聚阳离子与包封材料(例如遗传有效载荷)之间的复合物的解离导
致包封的材料以及潜在的细胞毒性聚阳离子的释放。因此,期望改善聚阳离子载体粒子,从
而一旦粒子在细胞内解离以释放包封的材料会降低聚阳离子的细胞毒性。
发明内容
[0007] 在一个方面,提供了一种通过使丙烯酸单体与一种或多种亲性单体的聚合以形成交联而获得的聚阳离子载体粒子,其中所述聚阳离子载体粒子具有净正电荷,并且其
中所述丙烯酸酯单体选自式I或式V。
[0008]
[0009] R和R”各自独立地为氢、C1‑C14直链或支链烷基、C3‑C8环烷基或5至10元芳基或杂芳基环,其任选地被能够与一种或多种亲水性单体交联的可聚合基团,优选地丙烯酸酯基团
封端。R’为C2‑C14直链或支链烷基、C3‑C8环烷基或5至10元芳基或杂芳基环,且R’被至少一种
能够与一种或多种亲水性单体交联的可聚合基团,优选地丙烯酸酯基团封端。烷基、环烷
基、芳基和杂芳基可以被一个或多个、硫或氮原子任选地取代且任选地中断。并且,R2为C2
或C3,且C3是直链的或环状的。
[0010] 在一些实施方式中,可聚合基团选自丙烯酸酯基团、甲基丙烯酸酯基团、(甲基)丙烯酰胺基团或苯乙烯基团。
[0011] 在一些实施方式中,式I的丙烯酸酯单体是式II的多丙烯酸酯单体
[0012]
[0013] R1为氢或C1‑C14直链、支链或环状烷基,其被一个或多个氧、硫或氮原子任选地取代且任选地中断,并任选地被用丙烯酸酯基团封端,R2为C2或C3,且C3是直链或环状的,R3为
C2‑C14直链或支链烷基,其被一种或多种氧、硫或者氮原子任选地取代且任选地中断。
[0014] 在一些实施方式中,多丙烯酸酯单体具有式III。
[0015]
[0016] R1和R2如先前所定义,R4为‑CH2‑CH2‑O‑或‑CH2‑CH2‑CH2‑O‑,且R4的末端CH2基团与末端丙烯酸酯基团的氧化物连接,n为选自1、2、3或4的整数。
[0017] 在一些实施方式中,多丙烯酸酯单体具有式IV。
[0018]
[0019] R1和R2如先前所定义,R1’具有与R1相同的定义,R2’为C2‑C3(C3为直链或环状),m为选自0、1、2、3或4的整数。在一些实施方式中,式IV的氮原子中的一个或多个被质子化。
[0020] 在一些实施方式中,式V的丙烯酸酯单体是式VI的多丙烯酸酯单体。
[0021]
[0022] R1和R5独立地为氢或C1‑C14直链、支链或环状烷基,其被一个或多个氧、硫或氮原子任选地取代且任选地中断,并任选地被用丙烯酸酯基团封端,R2为C2或C3(C3为直链或环
状),R3为C2‑C14直链或支链烷基,其被一个或多个氧、硫或氮原子任选地取代且任选地中
断。
[0023] 在一些实施方式中,多丙烯酸酯单体具有式VII。
[0024]
[0025] R1和R5如先前所定义,R4为‑CH2‑CH2‑O‑或‑CH2‑CH2‑CH2‑O‑,且R4的末端CH2基团与末端丙烯酸酯基团的氧化物连接,n为选自1、2、3或4的整数。
[0026] 在一些实施方式中,多丙烯酸酯单体具有式VIII。
[0027]
[0028] R1和R5如先前所定义,R2为C2或C3(C3为直链或环状),m为选自0、1、2、3或4的整数,且R1’、R2’和R5’分别独立地共享R1、R2和R5的定义。
[0029] 在一些实施方式中,丙烯酸酯单体选自:
[0030]
[0031] 在一些实施方式中,多丙烯酸酯单体是甲基二乙醇胺二丙烯酸酯(DXL)。
[0032] 在一些实施方式中,亲水性单体具有式IX。
[0033]
[0034] R6为‑O‑(CH2)p‑Y、‑NJK或‑NJ2K+,p是选自2、3或4的整数,Y被定义为OH、COOH、NJ2、+NJ3 或ONJ2,每个J被独立地定义为H、甲基或乙基,K为任选地分支且任选地取代的乙基、丙
基或丁基,R7为氢或甲基。
[0035] 在一些实施方式中,亲水性单体具有式X。
[0036]
[0037] R8为C2‑C4直链烷基,X选自羟基、羧基、叔胺、季铵或酰胺,且胺任选地被甲基或乙基取代。
[0038] 在一些实施方式中,一种或多种亲水性单体是2‑羟基乙基丙烯酸酯(HEA)和/或N,N‑(二甲基基)乙基丙烯酸酯(DMAEA)。
[0039] 在一些实施方式中,聚阳离子载体粒子具有200nm至5μm的尺寸。
[0040] 在一些实施方式中,丙烯酸酯单体与一种或多种亲水性单体的摩尔百分比为15/85至50/50。
[0041] 在一些实施方式中,聚阳离子载体粒子还包含与聚阳离子载体粒子复合的负载材料。
[0042] 在一个方面,提供了一种复合物,其包含与负载分子复合的聚阳离子载体粒子,所述聚阳离子载体粒子适于在细胞内释放负载分子,并且在生理条件下可降解,并且其中所
述聚阳离子载体粒子具有电荷转移性质,并且是通过使一种或多种亲水性单体与本文定义
的式I或式V的丙烯酸酯单体聚合而获得的。在一个实施方式中,负载分子选自核酸、肽和蛋
白质。
[0043] 在一个方面,提供了一种制备如本文所定义的聚阳离子载体粒子的方法,该方法包括:提供如本文所定义的丙烯酸酯单体和一种或多种如本文所定义的亲水性单体,并使
丙烯酸酯单体与一种或多种亲水性单体交联。
[0044] 在一些实施方式中,交联步骤包括进行沉淀聚合、微乳液聚合、分散聚合、反相悬浮聚合或反相乳液聚合中的一种。
[0045] 在一些实施方式中,仅提供一种亲水性单体,且丙烯酸酯单体与亲水性单体的摩尔百分比为30±15/70±15。在一个示例中,所述一种亲水性单体是HEA,丙烯酸酯单体是
DXL。
[0046] 在一些实施方式中,提供两种亲水性单体,丙烯酸酯单体与两种亲水性单体的摩尔百分比为33±10/33±10/33±10。例如,两种亲水性单体是HEA和DMAEA,丙烯酸酯单体是
DXL。
[0047] 在一些实施方式中,所述方法还包括提供待包封的试剂,并在包含该试剂的介质中使丙烯酸酯单体与一种或多种亲水性单体交联。
[0048] 在另一个方面,提供了一种生产负载材料与聚阳离子载体粒子的复合物的方法,该方法包括:通过如本文定义的方法生产聚阳离子载体粒子;和通过将聚阳离子载体粒子
暴露于含有负载材料的溶液中而将带有负电荷的负载材料复合到带有正电荷的聚阳离子
载体粒子上,从而获得复合物。
[0049] 在一个方面,提供了一种向有需要的受试者递送疫苗的方法,该方法包括向受试者施用如本文所定义的聚阳离子载体粒子,其中聚阳离子载体粒子与疫苗试剂复合或包封
疫苗组合物。
[0050] 在一个方面,提供了一种在体内诱导免疫反应的方法,包括向有需要的受试者施用如本文所定义的聚阳离子载体粒子,该聚阳离子载体粒子与抗原或编码抗原的核酸复合
或包封疫苗组合物。
[0051] 在一个方面,提供了一种用于体内蛋白质表达的核酸递送方法,该方法包括向受试者施用如本文所定义的聚阳离子载体粒子,其中所述聚阳离子载体粒子与编码蛋白质的
核酸复合。
[0052] 在一个方面,提供了一种疫苗组合物,其包含如本文所定义的聚阳离子载体粒子,该聚阳离子载体粒子与抗原或编码抗原的核酸以及药学上可接受的载体或佐剂复合。在一
个实施方式中,核酸是mRNA。
[0053] 在阅读本公开后,对于本领域技术人员将显而易见地是与本发明改进有关的许多另外特征及其组合。
附图说明
[0054] 图1是在600MHz下记录的在CDCl3中的N‑甲基二乙醇胺二丙烯酸酯[(甲基氮烷二1
基)双(乙烷‑2,1‑二基)二丙烯酸酯](DXL)的H核磁共振(NMR)光谱
[0055] 图2示出了在pH 7.30和室温(22℃)下在100磷酸盐缓冲的D2O中DXL的随时间的1H NMR光谱。
[0056] 图3是示出DXL随时间的酯水解的图,更具体地,是在pH 7.30、室温(22℃)下在100mM磷酸盐缓冲的D2O中的DXL单体的酯水解。百分比(%)水解数据表示DXL的酯基中的一
个的水解。
[0057] 图4是示出在pH 7.30、室温(22℃)下在100mM磷酸盐缓冲的D2O中的DXL单体的酯水解的伪一级图的图。数据表示DXL的酯基中的一个的水解。
[0058] 图5是在50X物镜和5μm比例尺下的亮场显微镜学图像,示出了光聚合20‑24小时后,在75/25M甲基乙基(MEK)/庚烷溶剂混合物中2‑羟基乙基丙烯酸酯(HEA)/DXL的70/30
摩尔进料比的聚合混合物。
[0059] 图6是在50X物镜和5μm比例尺下的亮场显微镜学图像,示出了在70℃下热聚合5‑8小时,随后在1,4‑二氧六环中纯化和超声处理后,在75/25MEK/庚烷溶剂混合物中的HEA/
DXL的70/30摩尔进料比的聚合混合物。
[0060] 图7是在50X物镜和10μm的比例尺下的亮场显微镜学图像,示出了在1,4‑二氧六环中纯化和超声处理后,在85/15MEK/庚烷溶剂混合物热聚合中制备的DXL/N,N‑(二甲基氨
基)乙基丙烯酸酯(DMAEA)/HEA粒子的1/1/1摩尔进料比的悬浮液。
[0061] 图8是在50X物镜和5μm的比例尺下的亮场显微镜学图像,示出了在光聚合后,在85/15MEK/庚烷溶剂混合物中的1/1/1DXL/DMAEA/HEA粒子的聚合混合物。
[0062] 图9是在50X物镜和10μm的比例尺下的亮场显微镜学图像,示出了在光聚合20‑24小时,用1,4‑二氧六环洗涤,并在pH 7.4下在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中超声处理后,在75/
25MEK/庚烷溶剂混合物中的HEA/DXL的70/30摩尔进料比的聚合混合物。
[0063] 图10A是在以1g总单体负载在75/25MEK/庚烷溶剂混合物中的70mol%HEA和30mol%DXL的情况下获得的粒子的共聚焦显微镜学图像。1mol%的偶氮二异丁腈(AIBN)作
为用于光分解的自由基引发剂,用磷酸盐缓冲盐水洗涤两次,用20X物镜在共聚焦上成像
(比例尺指示10μm),并示出了合并的通道:亮场、荧光素异硫氰酸酯(FITC)和四甲基罗丹明
异硫氰酸酯(TRITC)。
[0064] 图10B是70:30HEA/DXL粒子的共聚焦显微镜学图像(用20X物镜成像(比例尺指示10μm)并示出了亮场通道)。
[0065] 图10C是70:30HEA/DXL粒子的共聚焦显微镜学图像(用20X物镜成像(比例尺指示10μm)并示出了FITC通道)。
[0066] 图10D是70:30HEA/DXL粒子的共聚焦显微镜学图像(用20X物镜成像(比例尺指示10μm)并示出了TRITC通道)。
[0067] 图11A是与卵清蛋白Texas RedTM缀合物(OVA‑RED)以1:1重量比组合的70:30HEA/DXL粒子(用PBS洗涤两次)的共聚焦显微镜学图像(用20X物镜在共聚焦上成像(其中比例尺
指示25μm),示出了合并的亮场FITC和TRITC通道)。
[0068] 图11B是与OVA‑RED以1:1重量比组合的70:30HEA/DXL粒子(用PBS洗涤两次)的共聚焦显微镜学图像(用20X物镜在共聚焦上成像(其中比例尺指示25μm),示出了亮场通道)。
[0069] 图11C是与OVA‑RED以1:1重量比组合的70:30HEA/DXL粒子(用PBS洗涤两次)的共聚焦显微镜学图像(用20X物镜在共聚焦上成像(其中比例尺指示25μm),示出了FITC通道)。
[0070] 图11D是与OVA‑RED以1:1重量比组合的70:30HEA/DXL粒子(用PBS洗涤两次)的共聚焦显微镜学图像(用20X物镜在共聚焦上成像(其中比例尺指示25μm),示出了TRITC通
道)。
[0071] 图12A是与OVA‑RED以1:1重量比组合的70:30HEA/DXL粒子(用PBS洗涤两次)的共聚焦显微镜学图像(用20X物镜在共聚焦上成像(其中比例尺指示25μm)
[0072] 图12B是不含OVA‑RED的70:30HEA/DXL粒子(用PBS洗涤两次)的共聚焦显微镜学图像(用20X物镜在共聚焦上成像(其中比例尺指示25μm(B))。
[0073] 图13A是在与0.1重量%HD‑OVA‑FITC粒子悬浮液一起在37℃下在具有5% CO2的加湿气氛中温育4小时后,在玻璃底96孔板(Cellvis)中的RAW 264.7细胞的亮场显微镜学
图像,所述HD‑OVA‑FITC粒子悬浮液在补充有1%青霉素‑链霉素的无血清Dulbecco改良
Eagle培养基(DMEM)中制备。用PBS洗涤细胞两次,通过在无菌水中的4%v/v多聚甲固定,
储存在PBS中,并用20X物镜通过亮场显微镜成像(其中比例尺指示50μm)。
[0074] 图13B是在无血清DMEM中与10%v/v二甲基亚砜(DMSO)一起在37℃下在具有5% CO2的加湿气氛中温育4小时后,在玻璃底96孔板(Cellvis)中的RAW 264.7细胞的亮场显微
镜学图像。用PBS洗涤细胞两次,通过在无菌水中的4%v/v多聚甲醛固定,储存在PBS中,并
用20X物镜通过亮场显微镜成像(其中比例尺指示50μm)。
[0075] 图13C是在无血清DMEM中在37℃下在具有5% CO2的加湿气氛中温育4小时后,在玻璃底96孔板(Cellvis)中的RAW 264.7细胞的亮场显微镜学图像。用PBS洗涤细胞两次,通
过在无菌水中的4%v/v多聚甲醛固定,储存在PBS中,并用20X物镜通过亮场显微镜成像(其
中比例尺指示50μm)。
[0076] 图14A是在用补充有1%青霉素‑链霉素的无血清DMEM在37℃下在具有5% CO2的加湿气氛中温育4小时后,在玻璃底96孔板(Cellvis)中的RAW 264.7细胞的共聚焦显微镜
学图像。用PBS洗涤细胞两次,通过在无菌水中的4%v/v多聚甲醛固定,储存在PBS中,并用
60X油浸物镜在共聚焦上成像(其中比例尺指示10μm,示出了合并的亮场、FITC和TRITC通
道)。
[0077] 图14B是在用补充有1%青霉素‑链霉素的无血清DMEM在37℃下在具有5% CO2的加湿气氛中温育4小时后,在玻璃底96孔板(Cellvis)中的RAW 264.7细胞的共聚焦显微镜
学图像。用PBS洗涤细胞两次,通过在无菌水中的4%v/v多聚甲醛固定,储存在PBS中,并用
60X油浸物镜在共聚焦上成像(其中比例尺指示10μm,示出了亮场通道)。
[0078] 图14C是在用补充有1%青霉素‑链霉素的无血清DMEM在37℃下在具有5% CO2的加湿气氛中温育4小时后,在玻璃底96孔板(Cellvis)中的RAW 264.7细胞的共聚焦显微镜
学图像。用PBS洗涤细胞两次,通过在无菌水中的4%v/v多聚甲醛固定,储存在PBS中,并用
60X油浸物镜在共聚焦上成像(其中比例尺指示10μm,示出了FITC通道)
[0079] 图14D是在用补充有1%青霉素‑链霉素的无血清DMEM在37℃下在具有5% CO2的加湿气氛中温育4小时后,在玻璃底96孔板(Cellvis)中的RAW 264.7细胞的共聚焦显微镜
学图像。用PBS洗涤细胞两次,通过在无菌水中的4%v/v多聚甲醛固定,储存在PBS中,并用
60X油浸物镜在共聚焦上成像(其中比例尺指示10μm,示出了TRITC通道)。
[0080] 图15A是在与0.1重量%HD粒子悬浮液一起在37℃下在具有5%CO2的加湿气氛中温育4小时后,在玻璃底96孔板(Cellvis)中的RAW 264.7细胞的共聚焦显微镜学图像,所述
HD粒子悬浮液在补充有1%青霉素‑链霉素的无血清DMEM中制备。用PBS洗涤细胞两次,通过
在无菌水中的4%v/v多聚甲醛固定,储存在PBS中,用60X油浸物镜和Nyquist XY采样在共
聚焦上成像,比例尺指示10μm,并示出了合并的亮场、FITC和TRITC通道。
[0081] 图15B是在与0.1重量%HD粒子悬浮液一起在37℃下在具有5%CO2的加湿气氛中温育4小时后,在玻璃底96孔板(Cellvis)中的RAW 264.7细胞的共聚焦显微镜学图像,所述
HD粒子悬浮液在补充有1%青霉素‑链霉素的无血清DMEM中制备。用PBS洗涤细胞两次,通过
在无菌水中的4%v/v多聚甲醛固定,储存在PBS中,用60X油浸物镜和Nyquist XY采样在共
聚焦上成像,比例尺指示10μm,并示出了亮场通道。
[0082] 图15C是在与0.1重量%HD粒子悬浮液一起在37℃下在具有5%CO2的加湿气氛中温育4小时后,在玻璃底96孔板(Cellvis)中的RAW 264.7细胞的共聚焦显微镜学图像,所述
HD粒子悬浮液在补充有1%青霉素‑链霉素的无血清DMEM中制备。用PBS洗涤细胞两次,通过
在无菌水中的4%v/v多聚甲醛固定,储存在PBS中,用60X油浸物镜和Nyquist XY采样在共
聚焦上成像,比例尺指示10μm,并示出了FITC通道。
[0083] 图15D是在与0.1重量%HD粒子悬浮液一起在37℃下在具有5%CO2的加湿气氛中温育4小时后,在玻璃底96孔板(Cellvis)中的RAW 264.7细胞的共聚焦显微镜学图像,所述
HD粒子悬浮液在补充有1%青霉素‑链霉素的无血清DMEM中制备。用PBS洗涤细胞两次,通过
在无菌水中的4%v/v多聚甲醛固定,储存在PBS中,用60X油浸物镜和Nyquist XY采样在共
聚焦上成像,比例尺指示10μm,并示出了TRITC通道。
[0084] 图16A是在与0.1重量%HD‑OVA‑FITC粒子悬浮液一起在37℃下在具有5% CO2的加湿气氛中温育4小时后,在玻璃底96孔板(Cellvis)中的RAW 264.7细胞的共聚焦显微镜
学图像,所述HD‑OVA‑FITC粒子悬浮液在补充有1%青霉素‑链霉素的无血清DMEM中制备。用
PBS洗涤细胞两次,通过在无菌水中的4%v/v多聚甲醛固定,储存在PBS中,并用60X油浸物
镜和Nyquist XY采样在共聚焦上成像。比例尺指示10μm。示出了合并的亮场、FITC和4’,6‑
二脒基‑2‑苯基吲哚(DAPI)通道。
[0085] 图16B是在与0.1重量%HD‑OVA‑FITC粒子悬浮液一起在37℃下在具有5% CO2的加湿气氛中温育4小时后,在玻璃底96孔板(Cellvis)中的RAW 264.7细胞的共聚焦显微镜
学图像,所述HD‑OVA‑FITC粒子悬浮液在补充有1%青霉素‑链霉素的无血清DMEM中制备。用
PBS洗涤细胞两次,通过在无菌水中的4%v/v多聚甲醛固定,储存在PBS中,并用60X油浸物
镜和Nyquist XY采样在共聚焦上成像。比例尺指示10μm。示出了合并的亮场通道。
[0086] 图16C是在与0.1重量%HD‑OVA‑FITC粒子悬浮液一起在37℃下在具有5% CO2的加湿气氛中温育4小时后,在玻璃底96孔板(Cellvis)中的RAW 264.7细胞的共聚焦显微镜
学图像,所述HD‑OVA‑FITC粒子悬浮液在补充有1%青霉素‑链霉素的无血清DMEM中制备。用
PBS洗涤细胞两次,通过在无菌水中的4%v/v多聚甲醛固定,储存在PBS中,并用60X油浸物
镜和Nyquist XY采样在共聚焦上成像。比例尺指示10μm。示出了FITC通道。
[0087] 图16D是在与0.1重量%HD‑OVA‑FITC粒子悬浮液一起在37℃下在具有5% CO2的加湿气氛中温育4小时后,在玻璃底96孔板(Cellvis)中的RAW 264.7细胞的共聚焦显微镜
学图像,所述HD‑OVA‑FITC粒子悬浮液在补充有1%青霉素‑链霉素的无血清DMEM中制备。用
PBS洗涤细胞两次,通过在无菌水中的4%v/v多聚甲醛固定,储存在PBS中,并用60X油浸物
镜和Nyquist XY采样在共聚焦上成像。比例尺指示10μm。示出了DAPI通道。
[0088] 图17是在与0.1重量%HD‑OVA‑FITC粒子悬浮液一起在37℃下在具有5% CO2的加湿气氛中温育4小时后,在玻璃底96孔板(Cellvis)中的RAW 264.7细胞的共聚焦显微镜学
图像,所述HD‑OVA‑FITC粒子悬浮液在补充有1%青霉素‑链霉素的无血清DMEM中制备。用
PBS洗涤细胞两次,通过在无菌水中的4%v/v多聚甲醛固定,储存在PBS中,并用60X油浸物
镜和Nyquist XY采样在共聚焦上成像。比例尺指示10μm。示出了合并的FITC和DAPI通道。
[0089] 图18是示出在RAW 264.7细胞系的情况下被报告为平均值±标准差的MTS细胞毒性测定的存活率结果的柱状图。“对照”结果获自于在补充有1%青霉素‑链霉素的无血清
DMEM中的RAW 264.7细胞。分别从在无血清DMEM中制备的0.1重量%HD‑OVA‑FITC粒子悬浮
液中、在无血清DMEM中制备的0.1重量%HD粒子悬浮液中和在无血清DMEM(均补充有1%青
霉素‑链霉素)中的10%v/v DMSO中的RAW 264.7细胞获得“HD‑OVA‑ITC 0.1重量%”、“HD 
0.1重量%”和“DMSO 10%v/v”结果。

具体实施方式

[0090] 本公开涉及由“电荷转移”的聚阳离子制成的载体粒子。这些电荷转移型聚阳离子是含有初始高阳离子电荷密度的材料,其允许与和载体粒子相关的材料(例如疫苗、蛋白质
和/或核酸)复合。然后,可以对载体粒子进行细胞摄取,其中通常通过水解将发生电荷转移
机制,从而降低总体阳离子电荷密度,以改善复合材料(即聚阳离子载体粒子的负载或有效
载荷)的解离和释放。
[0091] 传统上,用于细胞递送的电荷转移型聚阳离子已专注于在支链或直链聚合物架构中使用可溶性聚合物。可溶性聚阳离子的一个局限性是,与核酸形成多聚体是一个难以控
制粒子形态的过程,这会强烈影响粒子的摄取。
[0092] 通过聚合物粒子的体内药物递送需要在生理条件下最终降解为细胞相容的副产物。对于交联的材料,这需要可降解的交联剂。通常,含有二硫化物、缩醛和缩酮的交联剂已
被用作可生物降解的官能团,其在降解时使交联的聚合物粒子转化为可溶性聚合物。虽然
这些官能团能够生物降解,但也存在与它们相关的限制性问题。缩醛和缩酮是能够进行酸
催化水解的官能团,且在体内应用之前需要在水溶液中的性pH值以确保材料的稳定性。
当具有缩醛和酮官能团的载体粒子被内吞时,内体和溶酶体的酸性pH可以在粒子到达细胞
质或细胞核之前触发粒子的内容物的释放。因此,缩酮和缩醛对于细胞递送可能是较不期
望的官能团。此外,缩醛和缩酮交联剂通常是相对疏水性的,因此它们容易通过疏水相互作
用产生水溶性和蛋白质结合的问题。二硫化物是传统上用于载体粒子中的官能团的另一个
示例。当二硫化物被切割或降解时,它们会产生游离的硫醇基,该硫醇基具有反应性,可能
会涉及不希望的副反应(例如与蛋白质、DNA等)。因此,二硫化物作为载体粒子中的官能团
也可能不太期望。
[0093] 本公开提供了一种聚阳离子载体粒子,其克服了以上指出的缺点,同时提供了改善的生物相容性、降低的细胞毒性和聚阳离子载体粒子的生物降解性以及所产生降解的副
产物的优点。本公开的聚阳离子载体粒子可以通过水解降解,以在聚合物上形成丙烯酸单
元,该丙烯酸单元无毒且通常用于生物相容性材料中。所产生的降解产物是水解的小分子,
其具有生物相容性并可以通过肾脏清除随时间清除出体外。在一些实施方式中,水解的小
分子是生理惰性的,且优选地不含丙烯酸基团。水解的小分子具有的化学结构通常类似于
已知的食品添加剂,例如二甲基乙醇。为了实现这些改善,本公开的聚阳离子载体粒子由丙
烯酸酯单体和一种或多种亲水性共聚单体形成。形成聚阳离子载体粒子的本公开的交联剂
将用于基于聚阳离子的药物递送的电荷转移型材料的改善性能与交联剂的生物降解性相
结合。在一个实施方式中,聚阳离子载体粒子可以通过自稳定沉淀聚合来合成,所述聚合利
用聚合物溶解性和交联剂负载的平衡来产生窄分散的电荷转移型聚阳离子载体粒子。
[0094] 如本文所使用的术语“丙烯酸酯”是指具有一个或多个丙烯酸酯基团的化合物。在一些实施方式中,丙烯酸酯单体是具有两个或更多个丙烯酸酯基团的“多丙烯酸酯”单体。
例如,所述化合物可以是二丙烯酸酯(两个丙烯酸酯基团)、三丙烯酸酯(三个丙烯酸酯基
团)或四丙烯酸酯(四个丙烯酸酯基团)。
[0095] 如本文所使用的术语“聚阳离子”是指具有净正电荷的聚合物,其由如本文所述的丙烯酸酯单体和一种或多种亲水性共聚单体形成。
[0096] 如本文所使用的术语“可降解”意指在生理条件下发生降解,其中时间范围为约2小时至2周,优选地8小时至48小时。降解可以包括丙烯酸酯和丙烯酸基团的水解以及聚阳
离子聚合物分解成小分子。
[0097] 如本文所使用的术语“任选地取代的”可以被定义为具有选自卤素(例如Cl、Br、F和I)、氧化物、胺、酰胺、羧基、烷氧基、羟基、醇、酯、醚、硝基、腈、烷基(例如C1‑C6)、芳基(例如苯基)、丙烯酰胺和其它已知的生物相容性的取代基的一个或多个取代。在一些实施方式
中,取代基可以排除磷酸盐、硫酸盐和抵消阳离子电荷的其它基团。
[0098] 在一些实施方式中,本公开的丙烯酸酯单体具有式I
[0099]
[0100] R为氢、C1‑C14直链或支链烷基、C3‑C8环烷基、或5至10元芳基或杂芳基环。R’为C2‑C14直链或支链烷基、C3‑C9环烷基、或5至10元芳基或杂芳基环,其被至少一种能够与一种或
多种亲水性单体交联的可聚合基团,优选地丙烯酸酯基团封端。烷基、环烷基、芳基和杂芳
基可以被一个或多个氧、硫或氮原子任选地取代且任选地中断。可聚合基团可选自丙烯酸
酯基团、甲基丙烯酸酯基团、(甲基)丙烯酰胺基团或苯乙烯基团。在一些实施方式中,R和R’
可以连接并形成与式I中所示的R和R’结合的含有氮的杂环烷基。例如,可以形成被任选地
取代的C3‑C8杂环烷基。
[0101] 在一些实施方式中,R被定义为氢、C1‑C13、C1‑C12、C1‑C11、C1‑C10、C1‑C9、C1‑C8、C1‑C7、C1‑C6、C1‑C5、C1‑C4、C1‑C3、C1‑C2或甲基。R可以是直链或支链的,其被一个或多个氧、硫或氮原子任选地取代且任选地中断,且任选地被丙烯酸酯基团封端。在一些实施方式中,R’为C2‑C14、C2‑C13、C2‑C12、C2‑C11、C2‑C10、C2‑C9、C2‑C8、C2‑C7、C2‑C6、C2‑C5、C2‑C4、C2‑C3或为C2,并且被一个或多个氧、硫或氮原子任选地取代且任选地中断,并且被至少一个可聚合基团封端。
[0102] 本公开的丙烯酸酯单体是交联剂,这意味着它具有至少两个可聚合基团,包括在本文所示式中与R2连接的丙烯酸酯基团。具有单一可聚合基团的单体将不允许形成聚合物
粒子,且将不允许形成这种粒子所需的交联,而是产生直链聚合物。在下面所示的优选的实
施方式中,丙烯酸酯单体是具有多个丙烯酸酯基团的多丙烯酸酯单体,从而允许改善的交
联,因为具有更多可以反应的基团提高了交联效率。
[0103] R2为C2或C3,即‑CH2‑CH2‑、‑CH2‑CH2‑CH2‑或环丙基,优选地为‑CH2‑CH2‑或‑CH2‑CH2‑CH2‑。在一些实施方式中,R2未被取代。如式I中所示,本公开的丙烯酸酯单体具有与胺相邻的丙烯酸酯基团,其中两个基团之间的间隔子为R2。丙烯酸酯单体的这一特征允许丙烯酸
酯单体通过由胺引发的丙烯酸酯基团的反应聚合成聚阳离子载体粒子。
[0104] 胺对激活酯进行水解发挥了直接的诱导和亲核作用。它还有助于吸引水和氢氧根离子,其在水解期间与酯反应,并可能通过氢键合进一步激活酯羰基。
[0105] 在一些实施方式中,丙烯酸酯单体是式II的多丙烯酸酯单体
[0106]
[0107] R1为氢或C1‑C14直链、支链或环状烷基,其被一个或多个氧、硫或氮原子任选地取代且任选地中断,并且任选地被丙烯酸酯基团封端。R2为C2或C3,其中C3是直链的或环状的,
优选地是直链的。R3为C2‑C14直链或支链烷基,其被一个或多个氧、硫或氮原子任选地取代
且任选地中断。
[0108] 在一些实施方式中,R1被定义为氢、C1‑C13、C1‑C12、C1‑C11、C1‑C10、C1‑C9、C1‑C8、C1‑C7、C1‑C6、C1‑C5、C1‑C4、C1‑C3、C1‑C2或甲基。R1可以是直链或支链的,其被一个或多个氧、硫或氮原子任选地取代且任选地中断,且任选被丙烯酸酯基团封端。在一些实施方式中,R3为C2‑C14、C2‑C13、C2‑C12、C2‑C11、C2‑C10、C2‑C9、C2‑C8、C2‑C7、C2‑C6、C2‑C5、C2‑C4、C2‑C3或为C2,并且被一个或多个氧、硫或氮原子任选地取代且任选地中断。
[0109] 在一些实施方式中,多丙烯酸酯单体具有式III
[0110]
[0111] R1和R2如先前所定义。R4是‑CH2‑CH2‑O‑或‑CH2‑CH2‑CH2‑O‑,且R4的末端CH2基团与末端丙烯酸酯基团的氧化物连接。并且,n是选自1、2、3或4的整数。
[0112] 在一些实施方式中,多丙烯酸酯单体具有式IV
[0113]
[0114] R1和R2如先前所定义。R1’独立地遵循本文为R1提供的相同定义。R2’为C2‑C3,且m是选自0、1、2、3或4的整数。R2’可以是‑CH2‑CH2‑、‑CH2‑CH2‑CH2‑或环丙基,优选地为‑CH2‑CH2或‑CH2‑CH2‑CH2‑。在一些实施方式中,R2’未被取代。
[0115] 在一些实施方式中,丙烯酸酯单体具有式V:
[0116]
[0117] R、R’和R2如先前所定义。R”独立地遵循与R相同的定义。在一些实施方式中,R、R’和R”中的两个或更多个可以连接并形成与式V中所示的与R、R’和R”结合的含有氮的杂环烷
基。例如,可以形成任选地被取代的C3‑C8杂环烷基。
[0118] 在一些实施方式中,式V的丙烯酸酯单体可以是多丙烯酸酯单体。在一些实施方式中,多丙烯酸酯单体具有式VI。
[0119]
[0120] R1、R2和R3如先前所定义。R5独立地遵循以上提供的R1的定义。
[0121] 在一些实施方式中,多丙烯酸酯单体具有式VII
[0122]
[0123] 其中R1、R4、R5和n如先前所定义。
[0124] 在一些实施方式中,式IV的多丙烯酸酯单体可以使氮原子中的一个或两个质子化并且连接到基团R5和R5’(两者独立地遵循先前提供的R1的定义)。例如,式IV的多丙烯酸酯
单体可以如下面在式VIII中所示的使两个氮质子化。
[0125]
[0126] R1、R1’、R2、R2’、R5、R5’和m如先前所定义。
[0127] 在优选实施方式中,丙烯酸酯单体选自:
[0128]
[0129] 在一个实施方式中,丙烯酸酯单体是N‑甲基二乙醇胺二丙烯酸酯,称为(DXL),具有式:
[0130]
[0131] 丙烯酸酯单体可以是对所产生的聚阳离子的净正电荷以及电荷转移性质有贡献的阳离子电荷转移型单体。丙烯酸酯单体与一种或多种亲水性单体交联或聚合,以获得聚
阳离子载体粒子。丙烯酸酯单体与一种或多种亲水性单体交联,以降低所产生的聚阳离子
的交联密度。有许多技术用于进行本单体的聚合,包括沉淀聚合、微乳液聚合、分散聚合、反
相悬浮聚合和反相乳液聚合(即油包水)。
[0132] 在一些实施方式中,亲水性单体是中性极性单体。在一些实施方式中,亲水性单体具有小于500g/mol、小于400g/mol或小于300g/mol的分子量。较小的分子是有利的,因为亲
水性单体更加溶于水相。在一个示例中,亲水性单体可以是单丙烯酸酯单体、单甲基丙烯酸
酯单体、丙烯酰胺单体(例如单丙烯酰胺单体)或甲基丙烯酰胺单体(例如单甲基丙烯酰胺
单体)。在一些实施方式中,亲水性单体可以具有净正阳离子电荷,因此对聚阳离子载体粒
子的总电荷有贡献。通过使用不同的亲水性单体和不同浓度的亲水性单体,可以调节聚阳
离子载体粒子的总净电荷,这进而又对聚阳离子载体粒子的释放动力学和结合性能产生作
用。
[0133] 在一些实施方式中,亲水性单体具有式IX
[0134]
[0135] R6是‑O‑(CH2)p‑Y、‑NJK或‑NJ2K+。p是选自2、3或4的整数。Y被定义为OH、COOH、NJ2、+NJ3或ONJ2,每个J被独立地定义为H、甲基或乙基,且K是乙基、丙基或丁基(被任选支化且任
选地取代)。R7为氢或甲基。
[0136] 在一些实施方式中,亲水性单体是式X的单丙烯酸酯单体
[0137]
[0138] R8为C2‑C4直链烷基,X选自羟基、羧基、叔胺、季铵或酰胺。胺可以被甲基或乙基取代。
[0139] 在一些实施方式中,丙烯酸酯单体与一种或多种亲水性单体以15/85至50/50、20/80至40/60、或25/75至35/65的摩尔百分比交联。在一些实施方式中,仅使用一种亲水性单
体,且丙烯酸酯单体与亲水性单体摩尔百分比约为30/70。在一个实施方式中,使用两种亲
水性单体,且丙烯酸酯单体与亲水性单体之比为约33/33/33。如本文所使用的术语“约”可
被定义为±15、±10、±9、±8、±7、±6、±5、±4、±3、±2或±1,“±”适用于在比率中定义
的每个值或比率的总值。
[0140] 在一些实施方式中,电荷转移型聚阳离子载体粒子的合成是用二丙烯酸酯交联剂DXL进行的。所述合成可以是沉淀聚合,以产生可降解的聚阳离子载体粒子。DXL是二丙烯酸
酯交联剂的示例,由于其可水解、不稳定的酯基,可用于形成可降解的聚合物粒子。将不稳
定酯与相邻氨基结合的类似丙烯酸酯交联剂(例如根据式I‑VIII)也可用于制备可降解粒
子和聚合物材料。如上式I‑VIII中所示,DXL衍生物的示例包括含有叔氨基或仲氨基的不同
间隔物长度,以及三丙烯酸酯、四丙烯酸酯类似物。DXL的负载百分比可用于形成具有不同
尺寸和不同降解速率的粒子。DXL与DXL类似物的共聚也可用于调节粒子的总体降解速率。
[0141] 受控尺寸的聚合物粒子的形成可以允许形成受控尺寸的多聚复合物粒子(阳离子粒子加有效载荷)。用于产生聚合物粒子的非均相聚合体系包括乳液聚合、分散聚合、悬浮
聚合和沉淀聚合。通常,这些非均相聚合需要使用表面活性剂或空间稳定剂来形成粒子。这
些表面稳定剂会在粒子表面基团上留下不期望的化学形态,这可能会干扰潜在的递送应
用。
[0142] 沉淀聚合是用于在实验室规模获得聚阳离子载体粒子的示例性方法,但也可考虑其它用于工业规模的方法等。沉淀聚合是一种高收率方法,其可以生产适用于生物医学应
用的单分散的、可膨胀的、无稳定剂的粒子。沉淀聚合非常适合用于制造含有反应性单体,
特别是水敏性单体的粒子,以及非常适合用于生产不含稳定剂或表面活性剂的窄分散的微
米尺寸的粒子。在一个实施方式中,收率被定义为起始单体和任选的引发剂与所形成的聚
合物中存在的单体的重量或摩尔比。在另一个实施方式中,收率被定义为起始单体和任选
的引发剂与粒子中存在的单体的重量或摩尔比。在各种实施方式中,沉淀聚合的收率可以
为至少1%、至少2%、至少3%、至少5%,优选地至少10%或至少20%。可以通过在粒子形成
条件下将丙烯酸酯单体与一种或多种亲水性单体进行沉淀聚合,然后任选地进行水解和/
或官能化来获得聚阳离子载体粒子。丙烯酸酯单体和/或亲水性单体的侧接丙烯酸酯基团
可以用小分子硫醇或氨基化合物进行官能化。
[0143] 沉淀聚合始于单体(丙烯酸酯单体和一种或多种亲水性单体)和引发剂的均相溶液。典型的总单体负载量为溶液以及对所形成的聚合物具有合适的溶解力性质的溶剂的约
1至约20重量%、或约2至约10重量%。在总单体负载量低于1重量%的情况下,粒子的形成
变得低效且受限。在一个实施方式中,可以将一种或多种额外的单体(即不是如本文所定义
的丙烯酸酯单体或亲水性单体)添加到单体负载中,以生产适于特定应用的聚合物。
[0144] 沉淀聚合的溶剂应该是足够差的溶剂,以使聚合物聚集并形成粒子,但仍然是足够好的溶剂,使粒子表面上的聚合物链膨胀,这防止聚合期间的粒子‑粒子聚集。在一个实
施方式中,所使用的溶剂的希尔德布兰德溶解度参数比形成的聚合物的希尔德布兰德溶解
度参数高或低约4至约5MPa1/2(即,极性更高或更低)。此外,在一些实施方式中,溶剂的粘
度是选择溶剂时考虑的另一个因素。低粘度溶剂是优选的。在一个实施方式中,溶剂在20℃
下具有小于约0.5cP的粘度。用于沉淀聚合的溶剂应具有高于聚合温度(对于热引发的聚
合,通常为60‑70℃)的沸点,并且不应与单体或引发剂发生实质性反应。在丙烯酸酯单体的
情况下,应避免亲核溶剂,如水、醇或胺。粒子也可以从光引发的沉淀聚合中获得,这允许使
用较低沸点的溶剂。适用于本公开的沉淀聚合的溶剂的示例包括但不限于庚烷、甲苯、二甲
苯、甲基乙基酮(MEK)、四氢呋喃(THF)、乙腈、乙酸乙酯、苯、环己烷、氯仿或其混合物。在光
引发的聚合的情况下,可以使用诸如丙酮、乙醚、二氯甲烷和戊烷的溶剂。
[0145] 用于获得聚阳离子载体粒子的沉淀聚合的替代方法包括反相乳液聚合、微乳液聚合、反相悬浮聚合和分散聚合。悬浮聚合物粒子和反相悬浮聚合物粒子具有均质的粒子性
质,因为它们是在基本上是微本体聚合中形成的。考虑到在这些过程中存在的液滴共享和
聚结的统计平衡,使用液体粒子形成相(例如单体混合物)在本体连续相中的机械分散进行
的悬浮聚合和反相悬浮聚合通常会产生具有宽尺寸分布的粒子。机械分散在不混溶的油状
介质中的亲水性单体的水溶液的液滴的反相悬浮聚合可用于大规模形成球形微粒和微凝
胶,但尺寸分布较宽。同样,将水性凝聚相分散在连续的水相中,随后使分散的液滴交联成
水凝胶珠,可以看作是水性‑水性悬浮聚合导致球形交联水凝胶粒子的示例,但粒子尺寸分
布较大。乳液型聚合在连续介质中使用粒子引发,且可以导致大规模生产窄分散的纳米粒
子。在悬浮型聚合和乳液型聚合两者中,通常使用水作为溶剂,这可能不适合反应性、水解
不稳定的单体。分散聚合始于单体、引发剂和胶体稳定剂在不利于形成聚合物的溶剂中的
溶液。该过程利用了生长中的聚合物链溶解度降低的优势,并且如果使用大量的空间稳定
剂来防止形成的粒子的聚集,则可用于形成单分散微粒。
[0146] 获得的聚阳离子载体粒子可以具有200nm至5μm的尺寸。该尺寸范围特别适用于聚阳离子载体粒子在细胞(例如哺乳动物细胞)中的内化。聚阳离子载体粒子的正电荷也在促
进细胞摄取方面发挥作用。粒子的尺寸的优选范围为0.5μm至5μm、1μm至5μm、或1μm到3μm。
尺寸可以被定义为当粒子为球状时的直径,或当形状不规则时可以被定义为在穿过粒子的
中心的直线上截取的两个相对点之间的最大距离。本公开的聚阳离子载体粒子通常具有球
形形状,其中表面光滑或粗糙。在一个实施方式中,形状是球体或不规则球体。不规则球体
可以被定义为表面上具有小凸起,从而使表面粗糙。
[0147] 当聚阳离子载体粒子被细胞内化时,它暴露在特定的水性或pH条件下,所述水性或pH条件导致聚阳离子载体粒子例如通过聚阳离子载体粒子的反应性酯的化学反应而降
解。丙烯酸酯单体的反应性酯在pH 7下容易发生通过水解的降解(但也可能在其它pH下发
生)。通常,在较高的pH(例如高于7)下将发生更快的降解,而在较低的pH(例如低于7)下将
发生较慢的降解。通过使上述不同的丙烯酸酯和亲水性单体共聚,可以改变聚阳离子载体
粒子的组成。亲水性单体可用于改变粒子的物理和化学性质;亲水性、疏水性、电荷、降解速
率。
[0148] 当聚阳离子载体粒子降解时,将聚合物链在粒子中保持在一起的交联被破坏,聚合物链被释放到水溶液中。如先前所述,聚合物链由一部分现已降解的丙烯酸酯单体和小
分子组成。通过粒子降解产生的聚合物链可以通过肾脏清除被出力并清除出受试者的身体
外。通过水解的降解可以在生理条件(即37℃,pH 7)下发生,不需要额外的强烈外部刺激。
通过自由基不会发生降解。因此,降解被认为是生物相容的。当DXL是丙烯酸酯单体时,获得
的聚合物副产物将是丙烯酸共聚物,这是一种常用于生物材料应用(即牙科植入物、水凝
胶)中的材料。
[0149] 与聚阳离子载体粒子复合的材料可以是疫苗、遗传物质诸如多核苷酸(mRNA、DNA、siRNA)或治疗剂。聚阳离子载体粒子可用于在可能发生降解的水性环境中,诸如在细胞内
递送负载材料。聚阳离子载体粒子可用于结合蛋白质,诸如卵清蛋白,和其它蛋白质诸如生
长因子。带负电荷的负载材料可以容易地与带正电荷的粒子缔合,并且是优选的(例如核
酸)。粒子的尺寸、粒子的电荷和粒子的组成(单体选择)可以变化,从而被优化至特定的递
送途径(例如静脉内或口服),并用于在特定环境(例如pH范围)中递送和解离粒子。
[0150] 在一些实施方式中,聚阳离子载体粒子与疫苗组合物缔合或包封疫苗组合物,因此可以用作抗原的递送平台。因此,聚阳离子载体粒子可以:
[0151] ·充当抗原的载体,所述抗原例如RNA(包括m‑RNA)、DNA、蛋白质、病毒壳片段、整个灭活病毒壳、或活性无害病毒(诸如已经修饰以表达所需抗原蛋白的腺病毒);
[0152] ·具有阳离子基团,其在储存和施用期间可以将抗原静电结合到受体的免疫系统;
[0153] ·具有佐剂性质,以确保由宿主免疫系统识别和处理,包括所述佐剂性质基于阳离子或聚阳离子基团,或基于某些水化合物基团的情况;
[0154] ·具有其中阳离子或聚阳离子基团可以通过自发或酶介导的水解被切割的组成,从而在有利于在受体中引发强烈的免疫反应是时间范围内释放结合的抗原有效载荷;
[0155] ·具有可以经历缓慢的自发或酶介导的水解的交联剂,从而确保微粒通过包括肾脏清除的过程最终从受体中清除;
[0156] ·具有包括阳离子基团和聚阳离子基团以及非化学计量的聚两性电解质的组成,其可以结合抗原以在按高达40℃定义的室温下储存,且在储存和运输期间不需要冷链物
流;和
[0157] ·通过沉淀聚合期间的共沉淀,或通过作为后功能化的一部分从盐中还原沉淀,或通过将预先形成的银纳米粒子吸附到所述聚合物纳米粒子上,可以额外负载有银纳
米粒子以增强细胞免疫反应。
[0158] 因此,在一些实施方式中,提供了一种疫苗组合物或治疗组合物,其包含本公开的聚阳离子载体粒子。可以在没有另外的载体的情况下将本公开的聚阳离子载体粒子施用于
有需要的受试者。例如,可以将聚阳离子载体粒子悬浮在用于静脉内注射溶液中。其它注射
途径(特别是对于疫苗应用)包括肌肉内、鼻内和经皮(微阵列针)施用。在其它实施方式中,
可以将聚阳离子载体粒子配制作为口服组合物(例如口服胶囊)的一部分。
[0159] 在一些实施方式中,将聚阳离子载体粒子与引发免疫反应的负载或有效载荷复合,并施用于受试者。聚阳离子载体粒子的负载可以是核酸,诸如DNA和RNA。因此,在其它实
施方式中,提供了一种通过施用具有核酸有效载荷的本公开的聚阳离子载体粒子将核酸递
送至细胞的方法。因此,聚阳离子载体粒子可用于基因编辑应用,诸如基因敲除和在成簇规
律性间隔短回文重复序列(CRISPR)的情况下的基因编辑等。在一些实施方式中,提供了一
种对有需要的受试者进行基因治疗的方法,该方法包括向受试者施用本公开的聚阳离子载
体粒子和核酸有效载荷(例如以质粒形式)。
[0160] 本发明的聚阳离子载体粒子也可用于抗菌材料,如抗菌表面和涂层中,且也可作为絮凝剂用于废水管理中。
[0161] 实施例
[0162] 材料
[0163] N‑甲基二乙醇胺(≥99%)、三乙胺(≥99%)、丙烯酰氯(≥97%)、2‑羟基乙基丙烯酸酯(HEA,96%)、N,N‑(二甲基氨基)乙基丙烯酸酯(DMAEA,98%)、甲基乙基酮(MEK,≥
99.0%)、庚烷(99%)、1,4‑二氧六环(≥99%)、丙酮(≥99.5%)、无菌过滤水、氧化氘(D2O,
99.9% D)和氘代氯仿(CDCl3,99.9% D)购自Sigma Aldrich。偶氮二异丁腈(AIBN,
99.8%)购自DuPont。Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)(高葡萄糖,丙酮酸钠)、胎血清
(FBS)(热灭活的,加拿大来源)、NucBlue活细胞染色ReadyProbes试剂(Hoechst33342)、青
TM
霉素链霉素(10,000U/mL)、卵清蛋白荧光素缀合物(OVA‑FITC)、卵清蛋白texas red 缀合
物(OVA‑RED)、1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)和多聚甲醛(16%(w/v),在无甲醇水溶液中的)购
自Thermo Fisher Scientific。CellTiter 96 AQueous非放射性细胞增殖测定购自
Promega。具有高性能#1.5盖玻璃的96孔玻璃底板购自Cellvis。盐酸(HCl)水溶液(35‑37重
量%)、氢氧化钠(试剂级)和磷酸氢二钠(≥98%)购自Caledon Laboratory Chemicals。氯
化钠(≥99%)和碳酸氢钠(≥99.7%)购自ACP Chemicals。正磷酸二氢钠(保证级)购自BDH 
Chemicals。乙醇(95体积%)购自Commercial Alcohols。
[0164] 甲基二乙醇胺二丙烯酸酯(DXL)的合成
[0165] 在配备有磁力搅拌棒的圆底烧瓶中,将N‑甲基二乙醇胺(6g,50.4mmol)和三乙胺(TEA)(12.714g,125.9mmol)溶解在400mL的二氯甲烷(DCM)中,并用外部‑水浴保持在0
℃。在5‑10分钟内将丙烯酰氯(11.393g,125.9mmol)滴加到搅拌的反应混合物中,反应混合
物在加入后变为不透明和黄色。添加完成后,将反应搅拌过夜,升温至室温。用5重量%碳酸
氢钠的等体积级分洗涤反应混合物4次,然后用盐水(饱和氯化钠溶液)洗涤。用无水硫酸钠
1
干燥有机层,过滤,通过旋转蒸发浓缩,得到以90‑95%收率的橙色油状物。进行了H核磁共
振(NMR),光谱示于图1中,(CDCl3,600MHz)d 6.37(2H,dd),6.10(2H,dd),5.80(2H,dd),
4.23(4H,t),2.74(4H,t),2.35(3H,s)。
[0166] DXL的水解
[0167] 在100mM磷酸盐缓冲的D2O中制备以0.75重量%的DXL的悬浮液,在将单体溶解到缓冲液中后将pH调节至pH 7.30。将溶液转移到5mm NMR管中,在将样品保持在室温(约22
1
℃)下的同时,以不同的时间间隔用来自Bruker的500MHz光谱仪记录H NMR光谱。通过比较
在不同时间记录的光谱的DXL的N‑甲基(‑CH3)信号(δ2.64ppm)、2‑((2‑羟基乙基)(甲基)氨
基)乙基丙烯酸酯(δ2.93ppm)和N‑甲基二乙醇胺(δ2.97ppm)的积分,计算醇副产物与二丙
烯酸酯的比率,来测量DXL的水解(图2)。下面的方案1示出了DXL形成相应醇副产物和丙烯
酸的小分子水解反应方案。
[0168] 方案1.DXL的酯水解形成2‑((2‑羟基乙基)(甲基)氨基)乙基丙烯酸酯、N‑甲基二乙醇胺和丙烯酸作为副产物
[0169]
[0170]
[0171] 通过沉淀聚合法合成DXL交联粒子
[0172] HEA‑DXL(HD)粒子:将2‑羟基乙基丙烯酸酯(HEA)和甲基二乙醇胺二丙烯酸酯(DXL)混合,得到含有25‑30mol%DXL的混合物。将混合物连同1mol%的作为用于热分解
光分解的自由基引发剂的AIBN以5%单体负载量溶解在甲基乙基酮(MEK)和具有70‑85% 
MEK相对体积比的庚烷的溶剂混合物中。以1g总单体负载量靶向在75/25MEK/庚烷溶剂混合
物中的70mol%HEA和30mol%DXL的样品聚合混合物提供如下:将HEA(0.5438g,
4.684mmol)、DXL(0.4562g,2.007mmol)、AIBN(0.0110g,0.0669mmol)、MEK(11.4713g,
14.25mL)、庚烷(3.2490g,4.75mL)在20mL玻璃闪烁瓶中混合,放入设定为70℃的HB‑1000杂
交箱(UVP)中,其中以7rpm的速度旋转混合,持续5‑8小时的总加热时间。或者,将反应容器
放置在一组设置为3.25rpm的辊(VIVO电动12热狗和5辊式烤架炊具;型号hotdg‑v005)
上,并在环境温度(22‑25℃)下在距离小瓶1.8cm处用两个F15T8/BL荧光管光源(15W)照射
20‑24小时。
[0173] 聚合后,将反应混合物转移到50mL离心管中,并用等体积的1,4‑二氧六环进行稀释。然后将悬浮液在130rcf下离心15分钟,随后去除上清液并将粒子沉淀物重新悬浮在1,
4‑二氧六环中。将该洗涤程序重复共3次,以去除可溶性聚合物、残留单体和引发剂。在通过
热聚合制备的样品的情况下,将粒子超声处理20‑40分钟,从而将粒子从较大的聚集体分
离。将干燥粒子分离为橙色固体,其中分离收率为5‑10%。
[0174] HEA‑DMAEA‑DXL(HDD)粒子:将N,N‑(二甲基氨基)乙基丙烯酸酯(DMAEA)、DXL和HEA以1:1:1D:D:H的相对单体进料摩尔比连同1mol%的作为用于热分解或光分解的自由基引
发剂的AIBN进行混合,然后以5%单体负载量将其溶解在甲基乙基酮(MEK)和具有70‑85% 
MEK相对体积比的庚烷的溶剂混合物中。以1g总单体负载量靶向在75/25MEK/庚烷溶剂混合
物中的1:1:1的摩尔比D:D:H的样品聚合混合物提供如下:使DMAEA(0.2943g,2.055mmol)、
DXL(0.4671g,2.055mmol)、HEA(0.2386g,2.055mmol)、AIBN(0.0101g,0.0609mmol)、MEK
(11.4713g,14.25mL)、庚烷(3.2490g,4.75mL)聚合并如上所述分离HD粒子。获得干燥的HDD
粒子作,为橙色固体,其中分离收率为1‑5%。
[0175] 光学显微镜学方案
[0176] 使用尼康Eclipse LV100ND立式显微镜、尼康Ti Eclipse倒置显微镜和尼康A1共聚焦Ti Eclipse显微镜通过亮场显微镜学对HEA‑DXL(HD)粒子进行成像。使用尼康NIS‑
elements Advanced Research软件版本5.11.01对图像进行分析。使用三点圆法手动确定
尺寸测量值(n=70)。
[0177] 粒子降解方案
[0178] 分别在pH 7.4的PBS和0.1M NaOH(pH约11)中以0.1重量%制备DXL交联粒子,以监测生理条件下和加速条件下的粒子降解。将悬浮液保持在室温下,并在不同时间点通过亮
场显微镜学成像。
[0179] 用OVA(卵清蛋白)(OVA‑FITC(荧光素异氰酸酯),OVA‑RED)对粒子进行负载
[0180] 通过将HD粒子在约0.2重量%的70%乙醇中重新悬浮10分钟来对它们进行灭菌。灭菌后,在经过认证的A2 2级生物安全柜中使用无菌技术制备和处理粒子溶液。然后将在
乙醇中的粒子悬浮液在130rcf下离心15分钟,随后去除上清液,然后重新悬浮在无菌水中。
将洗涤程序重复共2次,以去除残留的乙醇,并在PBS中形成最终浓度为0.2重量%的无菌粒
子悬浮液。单独地,在PBS中制备0.2重量%的OVA‑FITC溶液,并使用0.22mm注射器过滤器
行无菌过滤。为了使HD粒子负载有OVA‑FITC,将400μL的在PBS中的0.2重量%HD粒子转移到
含有400μL的在PBS中的0.2重量%OVA‑FITC的微型离心管中。通过移液10次随后涡旋混合1
分钟来混合悬浮液。然后将悬浮液在3200rcf下离心1分钟,去除上清液,并将沉淀物重新悬
浮在800μL PBS中。洗涤程序总共重复2次,将沉淀物再悬浮在800μL的PBS中,以形成目标浓
度为0.1重量%的负载有OVA‑FITC的HD粒子(HD‑OVA‑FITC)。然后通过亮场和荧光共聚焦显
微镜学对HD‑OVA‑FITC粒子进行成像,以使OVA‑FITC与HD粒子的结合可视化。使HD粒子以与
先前针对OVA‑FITC概述的相同的方式负载OVA‑RED。
[0181] 细胞摄取方案
[0182] 在经T‑75组织培养处理的烧瓶中在补充有10%v/v热灭活胎牛血清和1%v/v青霉素‑链霉素(100单位/mL)的DMEM中培养RAW 264.7巨噬细胞(ATCC),在37℃下在具有5% 
CO2的加湿气氛中保持。对于细胞摄取测定,将RAW 264.7细胞以8,000个细胞/孔(具有体积
为100μL的补充的培养基)的密度接种在玻璃底96孔板(Cellvis)中。将细胞培养3天以达到
约80%的汇合。从孔中取出培养基,用约250μL PBS将细胞洗涤一次。向洗涤后的细胞中添
加100μL在补充有1%青霉素‑链霉素的无血清DMEM中制备的0.1重量%HD‑OVA‑FITC粒子悬
浮液。作为对照,将细胞暴露于a)100μL无血清DMEM,b)100μL的在无血清DMIM中的10%v/v 
DMSO溶液,以及c)100μL的在无血清DME中的0.1重量%OVA‑FITC溶液(添加到细胞中)。在37
℃下在具有5% CO2的加湿气氛中将细胞温育4小时。温育后,从细胞中取出上清液,用约
250mL的PBS洗涤两次,随后在无菌水中添加100μL的4%v/v多聚甲醛。15分钟后,去除多聚
甲醛溶液,用约250μL的PBS将细胞洗涤两次,然后向固定的细胞中添加100μL的PBS。然后通
过亮场和共聚焦荧光显微镜学对细胞进行成像。
[0183] MTS测定方案(即[3‑(4,5‑二甲基噻唑‑2‑基)‑5‑(3‑羧基甲氧基苯酚)‑2‑(4‑磺基苯基)‑2H‑四唑鎓,盐])
[0184] 在经T‑75组织培养处理的烧瓶中在补充有10%v/v热灭活胎牛血清和1%v/v青霉素‑链霉素(100单位/mL)的DMEM中培养RAW 264.7巨噬细胞(ATCC),在37℃下在具有5% 
CO2的加湿气氛中保持。对于细胞摄取测定,将RAW 264.7细胞以8,000个细胞/孔(具有体积
为100μL的补充的培养基)的密度接种在经三组织培养(TC)处理的板中。将细胞培养3天以
达到约80%的汇合。从孔中取出培养基,用约250μL PBS将细胞洗涤一次。向洗涤后的细胞
中添加100μL在补充有1%青霉素‑链霉素的无血清DMEM中制备的0.1重量%HD‑OVA‑FITC粒
子悬浮液。作为对照,向细胞中添加100μL的补充有1%青霉素‑链霉素的无血清DMEM、100μL
的在补充有1%青霉素‑链霉素无血清DMIM中的10%v/v DMSO、100μL的在补充有1%青霉
素‑链霉素的无血清DMSM中的0.1重量%OVA‑FITC和100μL的在补充有1.0%青霉素‑链霉素
的无血清DMEM中的0.1重量%HD粒子悬浮液。将细胞在37℃下在具有5% CO2的加湿气氛中
温育4小时。将20μL的MTS溶液(Promega)添加到孔中并进行混合。将板在1mm的水平距离下
TM
振荡10秒,并使用Biotek  800TS吸光度读取器在490nm处读取。
[0185] 统计分析
[0186] 使用Bonferroni事后分析的单因素方差分析(ANOVA)对数据进行统计分析。显著性水平设定为p<0.05。
[0187] DXL的水解
[0188] 单独对DXL进行水解,以对DXL交联粒子的水解和降解进行建模。DXL的降解可以在每个DXL单元的两个反应性酯位点发生,应该注意的是,酯基团中的仅一个的水解就足以使
交联降解。此外,同一单元的第二个酯基的水解将释放N‑甲基二乙醇胺作为小分子副产物,
而丙烯酸单元将保留在聚合物上。
[0189] 通过1H NMR光谱法监测被保持在室温(22℃)下的在pH 7.3的磷酸盐缓冲D2O中的DXL的水解。结果表明,在室温(22℃)下1天后,约31%的DXL被水解(图3)。一小部分单丙烯
酸酯产物已进一步水解,得到N‑甲基二乙醇胺(MDEA),使得产物由27.2%的单丙烯酸酯和
3.4%的MDEA组成。DXL的酯基中的一个的水解显示出直链伪一级动力学,其中速率常数(k)
‑1
为0.0151h 且半衰期为约1.91天(图4)。
[0190] 结果表明,在pH 7时,DXL的水解速度比聚[N,N‑二甲基氨基乙基丙烯酸酯](PDMAEA)快约1.8倍,其具有约3.5天的半衰期。预计在粒子内的聚合的DXL的水解以类似的
速率发生,其中粒子内共聚单体和极性的存在对速率有潜在影响。并入DXL结构或共聚单体
中的相邻官能团也可用于调节相应粒子的水解和降解速率。
[0191] DXL交联粒子的沉淀聚合
[0192] 将DXL用作二丙烯酸酯交联剂,以在水性介质中形成可降解的阳离子粒子。DXL由β氨基酯键组成,其已被示出在温和的生理条件下会发生快速的酯水解。N,N‑(二甲基氨基乙
基)丙烯酸酯(DMAEA)是已在可降解聚合物材料领域研究的具有这种反应性酯的单体的示
例。假设DXL交联粒子由于它的带有叔铵基团的阳离子电荷而可以用作用于治疗有效载荷
(诸如DNA/RNA和蛋白质)的递送媒介物。于是,DXL负载型粒子可以通过净阳离子电荷促进
细胞摄取,然后通过不稳定的酯键的水解在细胞内降解,从而释放复合的有效载荷。降解减
少了聚合物链上的阳离子电荷,并且可溶性聚合物可以通过肾过滤从体内清除。
[0193] 选择沉淀聚合以制备DXL交联粒子,因为与诸如乳液聚合的其它方法相比,它不需要使用表面活性剂或空间稳定剂。使DXL与作为中性极性共聚单体的HEA在由作为极性良溶
剂的MEK和作为非极性不良溶剂的庚烷组成的边缘溶剂体系中聚合。当HEA‑DXL聚合物链最
初在边缘溶剂中形成时,聚合物链的聚集形成粒子核,其捕获随后形成的聚合物链以使聚
合物粒子生长。选择70/30的HEA/DXL摩尔进料比是由于DXL在被发现对于粒子形成是最佳
的75/25MEK/庚烷溶剂体系中的有限的溶解度。这种制剂是通过光引发和热引发的自由基
聚合制备的。对于光引发聚合,粒子的尺寸为2.28±0.35μm(n=70),对于热引发的聚合,粒
子的尺寸为3.60±1.45μm(n=70)(分别见图5和图6)。应当注意,对通过热聚合制备的样品
进行声波处理,以将粒子从较大的聚集体分离。
[0194] 与通过热聚合形成的那些粒子相比,通过光聚合形成的粒子直径更小,且直径分散更窄。通过光聚合形成的粒子在空间上也更稳定。
[0195] 由于DXL在适合粒子形成的MEK/庚烷溶剂混合物组合物中显示出有限的溶解度,使DMAEA与DXL和HEA共聚以增加粒子的叔胺含量和阳离子电荷。在85/15MEK/庚烷溶剂混合
物的情况下以1/1/1摩尔进料比对这种HEA/DMAEA/DXL三元共聚物粒子体系(在本文中被称
为HDD)进行了尝试,并通过热聚合和光聚合进行了聚合。通过热聚合和光聚合获得的HDD粒
子分别示于图7和图8中。
[0196] 通过热聚合制备的HDD粒子产生了直径为1.85±0.47μm的混合物粒子和粒子聚集体(n=70)。通过光聚合制备的相同组成的HDD粒子产生了无法通过亮场显微镜学分析的亚
微米粒子。
[0197] 与HD粒子类似,与光聚合相比,当通过热聚合制备时具有相同组成的HDD粒子的尺寸较小。这种差异再次归因于不同的聚合速率和聚合程度以及聚合温度对溶解力的影响。
[0198] 由于所获得的粒子悬浮液的稳定性和样品的相对窄的尺寸分散性,选择通过光聚合制备的HD粒子进行进一步的概念验证实验。纯化后,将HD粒子重新悬浮在pH 7.4的PBS
中,这产生直径为2.21±0.44μm的粒子和粒子聚集体的混合物(n=70)(图9)。
[0199] 用OVA(OVA‑FITC)对HD粒子进行负载
[0200] 由于在水性介质中的DXL的叔铵基团的净阳离子电荷,HD粒子可以与蛋白质以及诸如DNA/RNA的阴离子材料结合。由于HD粒子与DXL的不稳定酯键结合在一起,粒子可以降
解并释放所结合的有效载荷。为了证明粒子结合蛋白质以用于潜在的药物递送应用的能
力,将HD粒子暴露于经FITC标记的卵清蛋白(OVA‑FITC)或经德克萨斯红标记的卵清蛋白
(OVA‑CED)。
[0201] 未经负载的HD粒子的共聚焦荧光显微镜学显示,在FITC通道中从具有最大强度的粒子检测到自发荧光。粒子的荧光可能是由于DXL,因为含叔胺的聚合物已被示出表现出荧
光特性。在相同的采集设置下,与在FITC通道中相比,在TRITC通道中的HD粒子的荧光更弱
(图10A‑10D)。
[0202] 因此,为了使来自HD自发荧光的干扰最小化,将OVA‑RED用于结合研究。通过亮场和共聚焦荧光显微镜学对负载有1:1重量比的OVA‑RED的HD粒子(HD‑OVA‑RED)进行成像,结
果示于图11A‑11D中。当在相同的设置下对不具有OVA‑RED的HD粒子进行成像时,在TRITC通
道中的信号要弱得多(图12A‑12B),这表明HD粒子确实能够与诸如OVA的蛋白质结合。注意,
在HD粒子与OVA‑RED结合后,观察到未与HD粒子结合的不溶性OVA‑RED的一些聚集体(图
12A)。这可能是由于得克萨斯红部分在水性介质中具有降低的溶解度。
[0203] 细胞摄取
[0204] 将负载有OVA‑FITC的HD粒子作为用于疫苗递送的体外模型暴露于RAW 264.7巨噬细胞中。假设HD‑OVA粒子将会被免疫细胞摄入,然后通过DXL水解进行细胞内降解以释放所
负载的抗原。基于非电荷转移型聚阳离子的其它阳离子递送媒介物已在结合抗原方面显示
出希望,但在释放抗原方面往往会引起挑战。由于这种聚合物的毒性,非电荷转移型聚阳离
子在递送后也存在损伤细胞和细胞组分的潜在险。
[0205] 将HD‑OVA‑FITC粒子与RAW 264.7细胞一起温育4小时,随后通过用PBS洗涤两次,去除溶液中多余的粒子。然后通过亮场显微镜学对细胞进行成像(图13A‑C)。图13A示出了,
用HD‑OVA‑FITC粒子处理的细胞的形态与在DMEM中温育的未处理细胞相似(图13C)。图13A
还示出了,HD‑OVA‑FITC粒子的一部分看上去已经聚集形成更大的簇。作为阴性对照,将细
胞与在DMEM中的10%v/v DMSO一起温育,并显示出圆形细胞形态和凋亡迹象(图13B)。
[0206] 由于来自HD粒子和细胞的自发荧光可能有助于FITC通道中的信号,因此收集了单独细胞的图像(图14A‑14D)和用未经负载的HD粒子处理的细胞的图像(图15A‑15D)。在这两
种情况下,除了图15中单个细胞表面上的一些粒子聚集体外,从细胞都没有观察到明显的
荧光。
[0207] 接下来,通过共聚焦荧光显微镜学对细胞进行成像,以检查HD‑OVA‑FITC粒子的内化。在图16A‑16D中示出了用HD‑OVA‑FITC处理然后用NucBlue核染色的细胞的图像。从细胞
中观察到FITC通道中的荧光(无论是作为细胞中的弥漫区域还是点状区域),这表明OVA‑
FITC已被内化。通过合并的FITC和DAPI通道的共聚焦显微镜学观察到HD‑OVA‑FITC粒子在
细胞核周围的共定位(图17)。这表明OVA‑FITC已成功进入巨噬细胞。这些结果表明,巨噬细
胞将会优先摄入阳离子粒子,因为它们与带负电荷的细胞膜相互作用。
[0208] 通过使用MTS增殖测定评价HD‑OVA‑FITC粒子对RAW 264.7细胞的细胞毒性。作为对照,将细胞与无血清DMEM、在无血清DMIM中制备的0.1重量%HD粒子悬浮液和在无血清
DMEM中的10%v/v DMSO(均补充有1%青霉素‑链霉素)一起温育。温育4小时后,RAW 264.7
细胞的平均存活率分别为106±31%、100±22%、117±23%、64±12%(图18)。
[0209] 与含有粒子的任一样品(0.1重量%HD‑OVA‑FITC,0.1重量%HD)相比,RAW 264.7细胞在10%v/v DMSO中的降低的存活率具有统计学意义(p<0.05),而与含有粒子的任一样
品相比,RAW 264.7细胞在无血清DMEM中的存活率差异没有统计学意义(p>0.05)。结果表
明,负载有OVA和未负载有OVA的HD粒子在0.1重量%时没有明显的细胞毒性,因为经理的细
胞的存活率与无血清培养基中的对照细胞相当。
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