一种茭白废弃叶多糖组分及其制备方法和用途 |
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| 申请号 | CN202410158334.5 | 申请日 | 2024-02-04 | 公开(公告)号 | CN118005817A | 公开(公告)日 | 2024-05-10 |
| 申请人 | 常熟理工学院; | 发明人 | 郑丽雪; 王阳; 张欣怡; 宋来弟; 王晶; 陈钱峰; 刘文烜; 沈影超; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及茭白综合利用技术领域，具体涉及一种茭白废弃叶多糖的制备方法、组分和用途。本发明所提供的 纤维 素酶协同 微波 提取法能高效地制备出茭白废弃叶多糖；从该方法制备的茭白废弃叶多糖中可以分离得到具有高效抗 氧 化、抗凝血活性的多糖组分；在2.5mg/mL浓度时，其DPPH自由基清除率为43.7±0.56％，羟基自由基清除率为52.1±2.83％，在5.0mg/mL浓度时，TT值达到了16.1±0.36s，PT值为17.1±1.05s；该多糖组分可用于制备口服液、片剂和胶囊剂等相关产品。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种茭白废弃叶多糖组分的制备方法，将茭白废弃叶粉末用蒸馏水浸泡，之后加入一定量纤维素酶酶解，灭酶后置于微波萃取仪中提取一定时间；经离心、浓缩上清液、乙醇沉淀、冷冻干燥、脱蛋白得茭白废弃叶粗多糖组分。 |
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| 说明书全文 | 一种茭白废弃叶多糖组分及其制备方法和用途技术领域[0001] 本发明涉及茭白综合利用技术领域，具体涉及一种茭白废弃叶多糖的制备方法、组分和用途。 背景技术[0002] 茭白，是一种在中国和东南亚地区广泛种植的多年生禾本科水生植物。中国是最早将茭白作为蔬菜栽培的国家之一。中国的茭白资源非常丰富，是仅次于莲藕的第二大水生蔬菜，主要种植于长江中下游各省份。茭白属于一种药食同源植物，含有丰富的营养成分和独特的药用价值，有“水中人参”的美誉。茭白植株高大，其苞叶(非可食部分)的质量占到茭白植株总质量的50％‑70％，据统计，仅中国江苏省一年的茭白废弃叶产量就在35～49万吨(鲜质量)。在每年的茭白收获季，大量的茭白废弃叶被遗弃在河道、村道乃至公路，成为病虫害滋生的场所，有些晒干后被集中焚烧，造成了严重的环境污染。 [0003] 因此，茭白废弃叶资源的综合开发利用是茭白产业当前亟需解决的问题和难题。研究人员曾尝试将茭白废弃叶作为青储饲料饲喂牛羊等反刍动物，然而，只经过牲畜过腹还田，其能量利用率较低，而事实上，农废物同样富含具有开发价值的功能成分。 [0004] 纤维素是植物细胞壁的主要结构成分，通常与半纤维素、果胶和木质素结合在一起，纤维素分子之间存在氢键，在常温下非常稳定。茭白废弃叶中粗纤维含量高达50％左右，这些纤维将苞叶中的活性成分与营养物质包围在细胞壁内，致使茭白废弃叶多糖的制备存在提取难度大、提取时间长、得率低等缺点。近年来涌现出的现代化提取技术，如热水提取、酶辅助提取、超声辅助提取、微波辅助提取等在破壁促释等方面显现出极大的优势。然而关于茭白废弃叶多糖的提取至今未见报道。 [0005] 心血管疾病(Cardiovascular diseases,CVD)是全球范围内致死率最高的疾病之一，也是我国的主要健康问题之一。在我国，CVD患者约为2.9亿人，死亡率高于恶性肿瘤，占据了疾病死亡构成的40％以上。血栓形成在CVD的发展中起着重要作用，凝血与抗凝血系统的失衡会导致血液凝固性增加，从而增加了血栓形成的风险。因此，维持血液凝血与抗凝血的平衡非常重要。肝素(Heparin)及其衍生物是临床应用最为广泛的抗凝血药物，尽管其在CVD防治方面发挥了重要作用，但肝素使用过程中会出现出血、血小板较少症、骨质酥松、过敏反应和高钾血症等副作用，而且，肝素属于动物源多糖，这也增加了动物病原体感染的风险。近年来，植物多糖的抗凝血作用逐渐引起人们关注，发现枸杞、绿茶、南瓜等多糖均具有抗凝血功能，植物源多糖来源广泛，且能避免动物源多糖所致的病原体感染，是构成新型抗凝血功能因子的重要来源，在研究植物多糖抗凝血的过程中，人们逐渐又发现，具有抗氧化活性的多糖往往表现出较强的抗凝血作用。因此，有必要进一步探索茭白废弃叶多糖的抗氧化和抗凝血活性，这将有利于揭示茭白废弃叶多糖的抗氧化和抗凝血机制，为抗氧化、抗凝血新产品的开发及应用提供依据。 [0006] 综上，微波联合酶法提取茭白废弃叶多糖及其抗氧化和抗凝血活性均未见报道，本发明提供了一种纤维素酶协同微波提取茭白废弃叶多糖组分的方法及其在抗氧化、抗凝血方面的应用。 发明内容[0007] 本发明的目的在于提供一种茭白废弃叶多糖组分及其制备方法和用途，相比传统提取法，本发明所提供的纤维素酶协同微波提取法能高效地制备出茭白废弃叶多糖；从该方法制备的茭白废弃叶多糖中可以分离得到具有高效抗氧化、抗凝血活性的多糖组分。 [0008] 根据本发明的第一个方面，本发明提供了一种茭白废弃叶多糖组分的制备方法，将茭白废弃叶粉末用蒸馏水浸泡，之后加入一定量纤维素酶酶解，灭酶后置于微波萃取仪中提取一定时间；经离心、浓缩上清液、乙醇沉淀、冷冻干燥、脱蛋白得茭白废弃叶粗多糖组分。 [0009] 优选的，所述茭白废弃叶多糖组分的制备方法具体包括如下步骤： [0010] 将新鲜的茭白废弃叶洗净后于60℃下烘至恒重，粉碎后过40目筛制得茭白废弃叶粉末备用；将茭白废弃叶粉末以一定料液比在温水中浸泡8h，然后将pH值调至5.0±0.2，加入一定量的纤维素酶，于50℃摇床中孵育2h，结束后将酶解液置于沸水浴中灭酶15min；冷却后调节pH值至7.0±0.2，将酶解液置于微波萃取仪中，一定功率下处理一段时间，结束后离心取上清液，将上清液浓缩，加入3倍体积的无水乙醇于4℃条件下醇沉12h，离心得沉淀物，然后加水将其溶解，再与Sevag试剂(正丁醇：三氯甲烷＝1:4(v/v))以4:1比例混合并充分振荡15min后离心，离心后吸出上层溶液，重复Sevag脱蛋白至不再有蛋白产生，上层溶液经冷冻干燥得茭白废弃叶粗多糖。 [0011] 优选的，蒸馏水浸泡过程中茭白废弃叶粉末与水的料液比为1:20g/mL0～1:60g/mL，进一步优选1:40g/mL； [0012] 优选的，所述纤维素酶的添加量为茭白废弃叶粉末重量的0.3％～0.7％，进一步优选0.5％； [0013] 优选的，所述酶解温度为45℃～65℃，进一步优选55℃； [0014] 优选的，所述酶解时间为40min～80min，进一步优选60min； [0015] 优选的，所述微波时间为1min～15min，进一步优选7min； [0016] 优选的，所述微波功率为200W～600W，进一步优选425W； [0017] 优选的，所述微波温度为60℃～100℃，进一步优选80℃。 [0018] 优选的，所述茭白废弃叶粉末与水的料液比为1:40g/mL，纤维素酶添加量为茭白废弃叶粉末重量的0.5％、酶解温度55℃、酶解时间60min、微波时间7min、微波功率425W、微波温度80℃。该条件下，茭白废弃叶多糖得率为0.82％，显著高于热水提取法(0.38±0.08％)、酶提取法(0.46±0.05％)、热水/微波提取法(0.42±0.06％)。 [0019] 本发明所述的茭白废弃叶多糖组分的制备方法中，还包括对制备出的茭白废弃叶粗多糖进行分离纯化得茭白废弃叶纯化多糖，所述分离纯化步骤为将茭白废弃叶粗多糖依次经过二乙氨基乙基(DEAE)纤维素‑52色谱柱纯化和Sephadex G‑100葡聚糖凝胶柱纯化； [0020] 具体方法为：称取100mg茭白废弃粗叶多糖溶于20mL去离子水中，上样至二乙氨基乙基(DEAE)纤维素‑52色谱柱(2.6cm×60cm)中；用去离子水进行洗脱，流速1mL/min、每管5mL，绘制洗脱曲线；收集去离子水洗脱下的多糖组分，浓缩后透析3次，冷冻干燥；称取50mg冷冻干燥后的茭白废弃叶多糖溶于10mL去离子水中，上样至Sephadex G‑100葡聚糖凝胶柱中进行进一步分离纯化，用去离子水作为洗脱液，流速0.25mL/min，每管收集4mL，绘制洗脱曲线；收集去离子水洗脱下的多糖组分，浓缩后透析3次，冷冻干燥得所述的茭白废弃叶纯化多糖组分。 [0021] 根据本发明的第二个方面，本发明提供了一种茭白废弃叶多糖组分，所述的茭白废弃叶多糖组分中总糖含量为79.13±2.5％、糖醛酸含量为5.16±0.24％、硫酸基含量为3.98±0.12；所述的茭白废弃叶多糖组分由甘露糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖组成，摩尔比为12.25：4.75：2.25：1.00：2.50： 7.00：24.25：2.00：17.25，所述的茭白废弃叶多糖组分属于均一多糖，多糖的分子量为8.06 3 ×10kDa。 [0022] 根据本发明的第三个方面，本发明提供了所述茭白废弃叶多糖组分在抗氧化、抗凝血功能产品中的用途；可用于制备口服液、胶囊、片剂等制剂。 [0023] 本发明具有如下有益效果： [0024] 1)本发明提供的纤维素酶协同微波提取法在破壁释放方面具有显著优势，在茭白废弃叶粗多糖提取得率上具有协同效果，尤其适用于富含纤维素成分的苞叶类植物，有望应用于茭白废弃叶等农废物多糖的高效提取。 [0025] 2)本发明通过优化茭白废弃叶粗多糖的纯化方法，提供的茭白废弃叶多糖组分在2.5mg/mL时，其DPPH自由基清除率为43.7±0.56％，羟基自由基清除率为52.1±2.83％；当浓度为5.00mg/mL时，TT值达到了16.1±0.36s，PT值为17.1±1.05s。可用于制备抗氧化、抗凝血的相关产品。 附图说明 [0026] 图1料液比对茭白废弃叶多糖得率的影响； [0027] 图2酶添加量对茭白废弃叶多糖得率的影响； [0028] 图3酶解温度对茭白废弃叶多糖得率的影响； [0029] 图4酶解时间对茭白废弃叶多糖得率的影响； [0030] 图5微波时间对茭白废弃叶多糖得率的影响； [0031] 图6微波功率对茭白废弃叶多糖得率的影响； [0032] 图7微波温度对茭白废弃叶多糖得率的影响； [0033] 图8茭白废弃叶多糖DEAE洗脱曲线； [0034] 图9茭白废弃叶多糖葡聚糖凝胶洗脱曲线； [0035] 图10茭白废弃叶多糖组分对DPPH自由基清除能力； [0036] 图11茭白废弃叶多糖组分对羟基自由基清除能力； [0037] 图12茭白废弃叶多糖组分的抗凝血活性； [0038] 图13茭白废弃叶多糖组分的紫外可见扫描光谱； [0039] 图14茭白废弃叶多糖组分的红外扫描光谱； [0040] 图15茭白废弃叶多糖组分的单糖组成； [0041] 图16茭白废弃叶多糖组分的原子量分布。 具体实施方式[0042] 茭白废弃叶于2023年6月在江苏省常熟市东南开发区周边的河道旁收集；纤维素酶(1万U/g)购于上海麦克林生化科技有限公司；单糖标准品、T系列葡聚糖标准品等购于国药集团化学试剂有限公司；微波萃取仪由北京祥鹄科技发展有限公司提供，型号为XH‑300B；所有实验均为三平行，数据表达为均值±SD，数据的统计分析采用t‑检验或ANOVA分析，P<0.05认为存在统计学差异。 [0043] 实施例1茭白废弃叶粗多糖的制备 [0044] 将新鲜的茭白废弃叶洗净后于60℃下烘至恒重，粉碎后过40目筛制得茭白废弃叶粉末备用；将茭白废弃叶粉末以一定料液比在温水中浸泡8h，然后用磷酸盐缓冲液将pH值调至5.0±0.2，加入一定量的纤维素酶，于50℃摇床中孵育2h，结束后将酶解液置于沸水浴中灭酶15min；冷却后用磷酸盐缓冲液调节pH值至7.0±0.2，将酶解液置于微波萃取仪中，一定功率下处理一段时间，结束后离心取上清液，将上清液浓缩得浓缩液，加入浓缩液3倍体积的无水乙醇于4℃条件下醇沉12h，离心得沉淀物，然后加水将其溶解，再与Sevag试剂(正丁醇：三氯甲烷＝1:4(v/v))以4:1比例混合并充分振荡15min后离心，离心后吸出上层溶液，重复Sevag脱蛋白至不再有蛋白产生，上层溶液经冷冻干燥得茭白废弃叶粗多糖。 [0045] 1.1单因素试验 [0046] 工艺参数：按照实施例1中方法，改变单个因素进行试验，其中各个参数设置为料液比1:40g/mL，酶添加量0.7％，酶解温度50℃，酶解时间60min，微波时间10min，微波功率500W，微波温度70℃。 [0047] 1.1.1料液比对茭白废弃叶多糖得率的影响 [0048] 在考察料液比对粗多糖得率的影响时，通过改变料液比，其他因素固定不变。粗多糖得率(％)＝m/M×100，其中：m为冷冻干燥后的茭白废弃叶粗多糖质量(g)；M为茭白废弃叶粉末质量(g)(下同)，结果如图1所示。 [0049] 由图1可知，当料液比为1:40时，苞叶多糖得率最高，为0.37％。当溶剂量较小时，搅拌混匀效果变差，不利于植物材料与提取溶剂以及酶的充分接触，也不利于目标化合物的扩散、溶出，而当溶剂体积过大时会导致溶剂吸收微波能量后的升温幅度减少，进而导致了得率的降低。由此确定最佳料液比为1:40g/mL。 [0050] 1.1.2酶添加量对茭白废弃叶多糖得率的影响 [0051] 在考察酶添加量对粗多糖得率的影响时，通过改变酶添加量，其他因素固定不变(料液比选择1.1.1中结果，下面操作类似，即每个单因素都是在完成上个单因素的基础上研究)。结果如图2所示。 [0052] 由图2可知，随着酶添加量的增大，茭白废弃叶多糖得率先上升后下降，当酶添加量为0.5％时，得率最大，为0.44％。原因可能是在其他因素不变的情况下，纤维素酶添加量的不断增加，破坏了纤维素结构，促进了多糖的溶出，当溶液中的酶量达到饱和后，继续增大其添加量会阻塞多糖的溶出通道，且酶量的增加还会引起酶之间的竞争乃至抑制。因此，纤维素酶最佳添加量为0.5％。 [0053] 1.1.3酶解温度对茭白废弃叶多糖得率的影响 [0054] 在考察酶解温度对粗多糖得率的影响时，通过改变酶解温度，其他因素固定不变。结果如图3所示。 [0055] 由图3可知，随着酶解温度的升高，多糖得率呈现先上升后下降的趋势，55℃时，多糖得率最高，这是因为55℃时酶的催化作用发挥到极致，温度过高或过低都会导致酶活性的降低，酶促反应的减弱，多糖得率也随之降低。所以，最佳的酶解温度是55℃。 [0056] 1.1.4酶解时间对茭白废弃叶多糖得率的影响 [0057] 在考察酶解时间对粗多糖得率的影响时，通过改变酶解时间，其他因素固定不变。结果如图4所示。 [0058] 由图4可知，当酶解时间为60min时，多糖得率最高。原因是，酶解时间过短时，酶与底物的反应不够充分，从而导致得率较低，而随着酶解时间的延长，多糖得率不再增加，当酶足量时，酶解时间的延长会导致多糖的降解，得率反而下降。因此，最佳的酶解时间是60min。 [0059] 1.1.5微波时间对茭白废弃叶多糖得率的影响 [0060] 在考察微波时间对粗多糖得率的影响时，通过改变微波时间，其他因素固定不变。结果如图5所示。 [0061] 由图5可知，当微波处理时间为7min时，茭白废弃叶多糖得率最高，为0.59％，超过7min时，得率显著下降。这可能是由于样品中的多糖在微波辅助提取7min后，大多数已经溶出，继续延长处理时间会加剧微波对多糖的降解以及蛋白质等杂质的产生。由此，最佳的微波处理时间为7min。 [0062] 1.1.6微波功率对茭白废弃叶多糖得率的影响 [0063] 在考察微波功率对粗多糖得率的影响时，通过改变微波功率，其他因素固定不变。结果如图6所示。 [0064] 由图6可知，微波功率在200‑600W之间，随着微波功率的增加，茭白废弃叶多糖的得率呈现先上升后下降的趋势，当微波功率为400W时，得率最高，为0.73％。微波有助于提升物料内部温度使多糖加速溶出，从而使得茭白废弃叶多糖得率明显增加，但微波功率过大会阻碍介质渗入，且过多的热能也能使多糖结构发生破坏，从而导致多糖得率下降。所以，最佳的微波功率为400W。 [0065] 1.1.7微波温度对茭白废弃叶多糖得率的影响 [0066] 在考察微波温度对粗多糖得率的影响时，通过改变微波温度，其他因素固定不变。结果如图7所示。 [0067] 由图7可知，多糖的得率随微波温度的增大先缓慢增加而后又逐渐降低，当温度为80℃时，得率达到最优。温度的升高会引起分子运动加剧，细胞的扩散随着分子运动的加剧而扩大，使得溶剂中多糖类物质增多。当温度＞80℃时，多糖的结构被破坏，杂质也相应增多。因此，最佳的微波温度为80℃。 [0068] 1.2Plackett‑Burman试验 [0069] 在单因素试验基础上，采用Design‑Expert V8.0.6.1软件中的Plackett‑Burman对酶添加量A(％)、料液比B(g/mL)、酶解时间C(min)、微波时间D(min)、微波功率E(w)、酶解温度F(℃)、微波温度G(℃)7个因素进行试验设计，每个因素取高(1)低(‑1)两个水平(表1)，另设4个虚拟项，设计12组PB试验、设计方案及结果见表2，方差分析结果见表3。 [0070] 表1Plackett‑Burman设计因素水平 [0071] [0072] 表2Plackett‑Burman试验设计结果 [0073] [0074] 表3Plackett‑Burman试验设计方差分析 [0075] [0076] 注：R2＝0.9869，Adj R2＝0.9639，Pred R2＝0.9013；显著性：*代表差异显著，P<0.05；**代表差异极显著，P<0.01；n.s.代表差异不显著，P>0.05。 [0077] 由上表3可知，酶添加量、微波时间、微波功率三个因素对茭白废弃叶多糖得率有极显著的影响。因此，在后续的响应面分析中将只考虑这三个因素对响应值的影响。 [0078] 1.3响应面试验 [0079] 在1.2试验基础上，采用Design‑Expert V8.0.6.1软件中的Box‑Behnken方法设计试验。以酶添加量(％)、微波时间(min)、微波功率(W)为自变量，以多糖得率(Y)为响应值，设计三因素三水平响应面优化试验。响应面试验各因子水平见表4，响应面分析实验方案及结果如表5所示。 [0080] 表4Box‑Behnken设计因素水平 [0081] [0082] 表5响应面分析实验方案及结果 [0083] [0084] [0085] 经多元回归拟合，得出Y的预测值对X1、X2、X3编码值的二次回归模型方程： [0086] Y＝0.80+0.037×X1‑0.016×X2+0.088×X3‑0.070×X1 X2‑0.065×X1 X3+0.041×2 2 2 X2 X3‑0.21×X1‑0.25×X2‑0.17×X3 [0087] 回归模型方差分析结果如表6所示。 [0088] 表6回归模型方差分析结果 [0089] [0090] 注：R2＝0.9881，Adj R2＝0.9728，Pred R2＝0.9052；显著性：*代表差异显著，P<0.05；**代表差异极显著，P<0.01；n.s.代表差异不显著，P>0.05。 [0091] 由表6可知此模型的P<0.0001，说明选用的模型极显著；失拟项P>0.05不显著，说2 明模型的拟合程度良好，未知因素对试验结果干扰很小；方程决定系数R＝0.9881，说明响 2 应值的变化有98.81％来源于所选变量；Radj＝0.9728，意味着该模型能解释97.28％试验数据的变异性。从模型的失拟项方差分析可以看出，失拟项不显著(P>0.05)，表明该模型是稳定的，能较好预测实际茭白废弃叶多糖得率的变化。 [0092] 通过Design‑Expert软件分析，得到纤维素酶协同微波制备茭白废弃叶粗多糖的条件为：纤维素酶用量0.505％、微波处理时间6.938min、微波功率425.39W，在此条件下模型预测的茭白废弃叶粗多糖得率为0.808％。根据软件预测结果，结合实际工艺设置的可行性，取纤维素酶用量0.5％、微波处理时间7.0min、微波功率425W为提取条件进行工艺验证，试验验证茭白废弃叶多糖的实际得率为0.82±0.08％，与理论预测相比相对误差为1.49％(<5.0％)，表明基于该响应面模型优化茭白废弃叶多糖的提取工艺方法是有效可行的。 [0093] 对比例 [0094] 在实施例1得出的最优工艺的基础上(即茭白废弃叶粉末与水的料液比为1:40g/mL，纤维素酶添加量为茭白废弃叶粉末重量的0.5％、酶解温度55℃、酶解时间60min、微波时间7min、微波功率425W、微波温度80℃)，为了证明本发明所提供的纤维素酶协同微波提取茭白废弃叶多糖的方法优于热水提取、不加酶、不加微波处理的方法，本发明实施了如下对比试验： [0095] 方案A：热水提取法(HWE) [0096] 将茭白废弃叶粉末以1:40g/mL料液比在水中浸泡8h，然后在80℃下提取2.5h；冷却后离心去上清液，将上清液浓缩，加入3倍体积的无水乙醇于4℃条件下醇沉12h，离心得沉淀物，然后加水将其溶解，再与Sevag试剂(正丁醇：三氯甲烷＝1:4(v/v))以4:1比例混合并充分振荡15min后离心，离心后吸出上层溶液，重复Sevag脱蛋白至不再有蛋白产生，上层溶液经冷冻干燥得茭白废弃叶粗多糖；计算采用HWE法制备茭白废弃叶粗多糖的得率。 [0097] 结果表明：在不加酶、不加微波处理的情况下，茭白废弃叶粗多糖的得率仅为0.38±0.08％。 [0098] 方案B：纤维素酶提取法(CCE) [0099] 将茭白废弃叶粉末以1:40g/mL料液比在水中浸泡8h，然后将pH值调至5.0左右，加入0.5％纤维素酶(以茭白粉末重量计)，于50℃摇床中孵育2h，结束后将酶解液置于沸水浴中灭酶15min；冷却后调节pH值至7.0，离心取上清液，将上清液浓缩，加入3倍体积的无水乙醇于4℃条件下醇沉12h，离心得沉淀物，然后加水将其溶解，再与Sevag试剂(正丁醇：三氯甲烷＝1:4(v/v))以4:1比例混合并充分振荡15min后离心，离心后吸出上层溶液，重复Sevag脱蛋白至不再有蛋白产生，上层溶液经冷冻干燥得茭白废弃叶粗多糖；计算采用CCE法制备茭白废弃叶粗多糖的得率。 [0100] 结果表明：在只加酶、不加微波处理的情况下，茭白废弃叶粗多糖的得率仅为0.46±0.05％。 [0101] 方案C：热水/微波提取法(HME) [0102] 将茭白废弃叶粉末以1:40g/mL料液比在水中浸泡8h，然后在80℃下提取2.5h，冷却后将提取液置于微波萃取仪中，在微波功率425W的条件下，处理7.0min，结束后离心取上清液，将上清液浓缩，加入3倍体积的无水乙醇于4℃条件下醇沉12h，离心得沉淀物，然后加水将其溶解，再与Sevag试剂(正丁醇：三氯甲烷＝1:4(v/v))以4:1比例混合并充分振荡15min后离心，离心后吸出上层溶液，重复Sevag脱蛋白至不再有蛋白产生，上层溶液经冷冻干燥得茭白废弃叶粗多糖；计算采用HME法制备茭白废弃叶粗多糖的得率。 [0103] 结果表明：在不加酶，热水结合微波处理的情况下，茭白废弃叶粗多糖的得率仅为0.42±0.06％。 [0104] 所以本发明采用纤维素酶协同微波提取茭白废弃叶粗多糖的得率高于热水提取法、纤维素酶提取法、热水/微波提取法，这说明：纤维素酶的加入协同微波处理能有效促进茭白废弃叶多糖的释放。 [0105] 实施例2茭白废弃叶粗多糖的分离纯化及抗氧化、抗凝血活性测定 [0106] 称取100mg茭白废弃叶粗多糖(实施例1最优工艺参数制备)溶于20mL去离子水中，上样至二乙氨基乙基(DEAE)纤维素‑52色谱柱(2.6cm×60cm)中；依次用去离子水、0.1mol/L～0.4mol/LNaCl溶液进行梯度洗脱，流速1mL/min、每管5mL，绘制洗脱曲线(图8)；收集去离子水洗脱下的多糖组分，浓缩后透析3次，冷冻干燥；称取50mg冷冻干燥后的茭白废弃叶多糖溶于10mL去离子水中，上样至Sephadex G‑100葡聚糖凝胶柱中进行进一步分离纯化，用去离子水作为洗脱液，流速0.25mL/min，每管收集4mL，绘制洗脱曲线(图9)；收集去离子水洗脱下的多糖组分，浓缩后透析3次，冷冻干燥得所述的茭白废弃叶纯化多糖组分。 [0107] 以DPPH自由基清除能力和羟基自由基清除能力为评价指标；将茭白废弃叶纯化多‑1 ‑1糖组分配制为0.5mg.mL ～2.5mg.mL ；以Vc为阳性对照；实验方法与步骤参考试剂盒说明书。 [0108] 以凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)为抗凝血活性评价指标；将茭白废弃叶纯‑1 ‑1化多糖组分配制为0.31mg.mL ～5.00mg.mL ；以生理盐水为空白对照；实验方法与步骤参考试剂盒说明书。 [0109] 由图10、11可知，茭白废弃叶多糖组分的DPPH自由基和羟基自由基清除能力均随着多糖浓度(0.5～2.5mg/mL)的增大而增强，当浓度为2.5mg/mL时，其DPPH自由基清除率为43.7％，羟基自由基清除率为52.1％。 [0110] 由图12可知，当茭白废弃叶多糖组分浓度为5.00mg/mL时，TT值达到了16.1±0.36s，显著高于生理盐水(10.8±0.85s)；同浓度下的茭白废弃叶多糖组分也能显著延长PT值，PT值为17.1±1.05s，显著高于生理盐水(12.1±0.6s)。 [0111] 对比例 [0112] 在实施例2的基础上，为了证明本发明所提供的茭白废弃叶多糖组分优于NaCl溶液洗脱下的多糖组分的抗氧化及抗凝血作用，本发明实施了如下对比试验： [0113] 方案E：0.1mol/L NaCl洗脱得到的多糖组分的抗氧化、抗凝血活性测定[0114] 称取100mg茭白废弃叶粗多糖(实施例1最优工艺参数制备)溶于20mL去离子水中，上样至二乙氨基乙基(DEAE)纤维素‑52色谱柱(2.6cm×60cm)中；用0.1mol/L NaCl溶液进行洗脱，流速1mL/min、每管5mL，绘制洗脱曲线；收集洗脱下的多糖组分，浓缩后透析3次，冷冻干燥；称取50mg冷冻干燥后的茭白废弃叶多糖溶于10mL去离子水中，上样至Sephadex G‑100葡聚糖凝胶柱中进行进一步分离纯化，用去离子水作为洗脱液，流速0.25mL/min，每管收集4mL，绘制洗脱曲线；收集洗脱下的多糖组分，浓缩后透析3次，冷冻干燥得0.1mol/L NaCl溶液洗脱得到的茭白废弃叶纯化多糖组分。 [0115] 当其浓度为2.5mg/mL时，其DPPH自由基清除率和羟基自由基清除率都达到最高，分别为(8.59±1.23)％、(39.29±3.12)％；当其浓度为5.00mg/mL时，TT值和PT值均达到最高，分别为11.2±0.15s，12.9±0.85s。抗氧化和抗凝血活性均低于实施例2制备出的同浓度下的茭白废弃叶纯化多糖组分。 [0116] 方案F：0.2mol/L NaCl洗脱得到的多糖组分的抗氧化、抗凝血活性测定[0117] 称取100mg茭白废弃叶粗多糖(实施例1最优工艺参数制备)溶于20mL去离子水中，上样至二乙氨基乙基(DEAE)纤维素‑52色谱柱(2.6cm×60cm)中；用0.2mol/L NaCl溶液进行洗脱，流速1mL/min、每管5mL，绘制洗脱曲线；收集洗脱下的多糖组分，浓缩后透析3次，冷冻干燥；称取50mg冷冻干燥后的茭白废弃叶多糖溶于10mL去离子水中，上样至Sephadex G‑100葡聚糖凝胶柱中进行进一步分离纯化，用去离子水作为洗脱液，流速0.25mL/min，每管收集4mL，绘制洗脱曲线；收集洗脱下的多糖组分，浓缩后透析3次，冷冻干燥得0.2mol/L NaCl溶液洗脱得到的茭白废弃叶多糖组分。当其浓度为2.5mg/mL时，其DPPH自由基清除率和羟基自由基清除率都达到最高，分别为(8.59±1.23)％、(39.29±3.12)％；当其浓度为 5.00mg/mL时，TT值和PT值均达到最高，分别为12.1±0.25s，12.6±1.05s。抗氧化和抗凝血活性均低于实施例2制备出的同浓度下的茭白废弃叶纯化多糖组分。 [0118] 方案G：0.4mol/L NaCl洗脱得到的多糖组分的抗氧化、抗凝血活性测定[0119] 称取100mg茭白废弃叶粗多糖(实施例1最优工艺参数制备)溶于20mL去离子水中，上样至二乙氨基乙基(DEAE)纤维素‑52色谱柱(2.6cm×60cm)中；用0.4mol/L NaCl溶液进行洗脱，流速1mL/min、每管5mL，绘制洗脱曲线；收集洗脱下的多糖组分，浓缩后透析3次，冷冻干燥；称取50mg冷冻干燥后的茭白废弃叶多糖溶于10mL去离子水中，上样至Sephadex G‑100葡聚糖凝胶柱中进行进一步分离纯化，用去离子水作为洗脱液，流速0.25mL/min，每管收集4mL，绘制洗脱曲线；收集洗脱下的多糖组分，浓缩后透析3次，冷冻干燥得0.4mol/L NaCl溶液洗脱得到的茭白废弃叶多糖组分。当其浓度为2.5mg/mL时，其DPPH自由基清除率和羟基自由基清除率都达到最高，分别为(26.66±1.57)％、(11.45±0.51)％；当其浓度为 5.00mg/mL时，TT值和PT值均达到最高，分别为11.7±0.34s，11.9±1.23s。抗氧化和抗凝血活性均低于同浓度下的茭白废弃叶多糖组分。 [0120] 所以，以抗氧化活性(DPPH自由基、羟基自由基清除能力)和抗凝血活性(TT、PT)为评价指标，得到茭白废弃叶粗多糖的最优分离纯化条件为：茭白废弃叶粗多糖溶液上样至二乙氨基乙基(DEAE)纤维素‑52色谱柱(2.6cm×60cm)中；用去离子水进行洗脱，流速1mL/min、每管5mL；收集洗脱下的多糖组分，浓缩后透析3次，冷冻干燥；再将此多糖溶液上样至Sephadex G‑100葡聚糖凝胶柱中进行进一步分离纯化，用去离子水作为洗脱液，流速0.25mL/min，每管收集4mL；收集洗脱下的多糖组分，浓缩后透析3次，冷冻干燥得所述的茭白废弃叶纯化多糖组分。 [0121] 实施例3茭白废弃叶纯化多糖组分(最优分离纯化条件获得)的成分分析与结构表征 [0122] 苯酚‑硫酸法测定茭白废弃叶多糖组分中总糖含量为79.13±2.5％；间羟基联苯法测定糖醛酸含量为5.16±0.24％；氯化钡明胶比浊法测定硫酸基含量为3.98±0.12。 [0123] 紫外‑可见光谱测定：将茭白废弃叶多糖组分配制1mg/mL的溶液，用蒸馏水作空白调零。用紫外‑可见分光光度计对多糖组分溶液进行扫描，设置波长参数为200～400nm，扫描间隔为0.5nm。 [0124] 红外光谱测定：取1mg干燥的茭白废弃叶多糖组分与100mg干燥的溴化钾混合、压‑1 ‑1片后，放入FTIR‑650红外光谱仪中进行测定，在4000cm ～400cm 波长范围内进行光谱扫描(International Journal of Biological Macromolecules，2019，123:280‑290)。 [0125] 单糖组成测定：精密称取2mg茭白废弃叶多糖组分，放入水热反应器中，加入2mL 2mol/L的三氟乙酸(TFA)，密封，110℃～120℃水解6h；除去残留的TFA依次加入200μL 0.5mol/L的1‑苯基‑3‑甲基‑5‑吡唑啉酮(PMP)的甲醇溶液和200μL 0.3mol/L的NaOH溶液混合，70℃反应1.5h；冷却后，加入0.3mol/L的HCl溶液中止反应；三氯甲烷萃取三次，收集水层，即为PMP衍生化的单糖；进样前用0.45μm Millipore微孔滤膜过滤样品，进样品体积为 20μL。仪器及色谱条件：Therm Ultimate3000高效液相色谱仪，配备Thermo U3000二极管阵列检测器；色谱柱为Supersil ODS2柱(5μm，4.6mm×250mm)；流动相：PBS(pH＝6.8)：乙腈＝ 82:18(v/v)；流速；0.8mL/min；柱温：30℃；检测器波长245nm；运行时间：50min(International Journal of Biological Macromolecules，2019，155:1105‑1113)。 [0126] 分子量测定：将茭白废弃叶多糖组分配制2mg/mL的溶液；进样前用0.45μmMillipore微孔滤膜过滤样品，进样品体积为20μL；仪器为Elite P230II高效液相色谱仪，配备示差折光检测器，色谱柱为TSK‑GELG4000PWXL(7.8mm×300mm)糖类液相色谱柱；以不同分子量的葡聚糖作为标准糖，制备系列不同分子量的标准糖溶液，根据保留时间和分子量值建立多糖分子量测定的三阶校正曲线；色谱条件为流动相：超纯水；流速：1.0mL/min；柱温：50℃；检测器温度：30℃；运行时间：30min(International Journal of Biological Macromolecules，2019，123:280‑290)。 [0127] 由图13可知，茭白废弃叶多糖组分在260nm和280nm处均无特征吸收峰。表明：多糖组分中均无蛋白质和核酸这些杂质，多糖纯度较高。另外，茭白废弃叶多糖组分的紫外可见光谱呈逐渐下降的趋势，这和多糖的一般特性相符。 [0128] 由图14可知，在3460cm‑1～3430cm‑1的波数范围内，茭白废弃叶多糖组分的红外谱图中出现了较宽的吸收峰，这个峰是由羟基的O‑H伸缩振动引起的，这表明多糖结构中存在分子内或分子间氢键，根据这个可以判定茭白废弃叶多糖组分为糖类化合物。在1665～‑11635cm 的波数范围内，谱图中出现了比较强的吸收峰，这是由水化物羟基振动引起的，是糖类水化物的特征吸收峰，表明茭白废弃叶多糖组分中存在结晶水。另外，红外光谱在‑1 + 1616cm 的波数下都没有‑NH2和‑NH3的特征吸收峰，表明茭白废弃叶多糖组分中不存在蛋白多糖，这也和紫外‑可见光谱扫描分析的结果是一致的。 [0129] 由图15可知，茭白废弃叶多糖组分由甘露糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖以12.3：4.75：2.25：1.00：2.50：7.00：24.3：2.00：17.3的摩尔比构成。 [0130] 由图16可知，茭白废弃叶多糖组分属于均一多糖，多糖的分子量为8.06×103kDa。 [0131] 实施例4茭白废弃叶纯化多糖组分口服液的制备 [0132] 取1.0g茭白废弃叶多糖组分加入100mL纯化水中，室温搅拌至溶解，分别加入0.1g山梨糖醇和0.1g苯甲酸钠，搅拌均匀，罐装瞬时灭菌，装瓶(10mL/瓶)，封口，即得茭白废弃叶多糖组分口服液。 [0133] 实施例5茭白废弃叶纯化多糖组分片剂的制备 [0134] 取1.0g茭白废弃叶多糖组分与150mg羧甲基纤维素钠和1.0mg磷酸氢钙混合、研细后，过100目筛；搅拌时加入5％聚维酮K30的95％乙醇溶液制软材，湿法制粒；60℃干燥、过筛、整粒后，加入1％的硬脂酸镁和2％的微粉硅胶，混合均匀，压片即得茭白废弃叶多糖组分片剂。 [0135] 实施例6茭白废弃叶纯化多糖组分胶囊剂的制备 [0136] 取1.0g过40目筛的茭白废弃叶多糖组分，按1:1比例喷入95％乙醇，混合均匀，加10％淀粉制软材，过20目筛制粒，置于60℃烘箱中干燥，再过20目筛整粒，在相对湿度低于 65％的环境下装填于3号空胶囊中，即得茭白废弃叶多糖组分胶囊剂。 [0137] 上述实施例为本发明优选地实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。 |
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