一种蜂王浆肽及其与纤维素载体的复合物、制备方法、用于治疗肝损伤疾病的用途 |
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| 申请号 | CN202311252567.3 | 申请日 | 2023-09-26 | 公开(公告)号 | CN117343134A | 公开(公告)日 | 2024-01-05 |
| 申请人 | 大连深蓝肽科技研发有限公司; | 发明人 | 王祖哲; 高威; 张延胜; 刘婉; 王飞; | ||||
| 摘要 | 一种 蜂王浆 肽及其与 纤维 素载体的复合物、制备方法、用于 治疗 肝损伤 疾病 的用途，属于 生物 技术领域，要点是蜂王浆肽，其 氨 基酸序列包括Ala‑Ser‑Lys‑Leu‑Ala‑Ile‑Asp，制备方法包括过膜液通过凝胶色谱柱进行分离纯化，采用色谱柱进一步纯化得蜂王浆肽，具有高抗 氧 化活性、减少 肝细胞 脂肪堆积的作用。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种蜂王浆肽，其特征在于，其氨基酸序列包括Ala‑Ser‑Lys‑Leu‑Ala‑Ile‑Asp。 |
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| 说明书全文 | 一种蜂王浆肽及其与纤维素载体的复合物、制备方法、用于治疗肝损伤疾病的用途 技术领域[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种蜂王浆肽及其制备方法、纤维素载体复合物及其制备方法和应用，特别是用于运载蜂王浆肽和虾青素的肝靶向微粒(载体)及其复合物的制备方法及其在肝损伤改善方面作用。 背景技术[0002] 肝脏作为人体最大的代谢器官，由肝实质细胞和非实质细胞构成，承担着消化、代谢、解毒、分泌及免疫等多种生理功能。特别是胃肠道吸收的物质，几乎全部经肝脏处理后进入血液循环。随着生活方式的改变，熬夜、酗酒等一系列不良的生活习惯使得机体肝功能不断下降，肝脏损伤所引起的功能退化已经成为影响人类身体健康和生活质量的重要因素。肝损伤是指以肝细胞功能障碍和代谢紊乱为特征的一系列危险病理状态，是各类肝脏疾病发生发展的初级阶段，如药物性肝损伤、胆汁淤积、酒精性肝损伤、肝炎以及脂肪肝等，进而可能引起肝硬化、肝癌等重症。肝损伤发生的机制并不十分明确，但越来越多的证据表明，氧化应激和炎症在肝损伤的发生中起着关键的病因学作用，包括肝细胞功能障碍、凋亡和纤维化等。肝脏中多种自由基、活性氧(ROS)和活性氮(RNS)的积累，包括超氧化物、过氧化氢、脂质过氧化物、一氧化氮和过氧亚硝酸盐超过肝脏氧化代谢能力，破坏肝脏氧化还原平衡，增加抗氧化物质消耗，抑制超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低抗氧化酶水平，尤其是谷胱甘肽(GSH)水平。从而引起肝脏一系列病理损伤，引起细胞膜脂质过氧化、蛋白质和DNA氧化，导致肝细胞损伤、炎症、缺血、纤维化、坏死和凋亡。 [0003] 蜂王浆(RJ)是一种成分复杂的天然产物,它的化学组成随蜜蜂的品种、蜜源种类、生产季节、哺育蜂的年龄及数量等因素的不同存在着差异。多项研究表明RJ对于脂多糖诱导的体外肝细胞损伤、四氯化碳诱导的慢性/急性肝损伤、油酸诱导的非酒精性脂肪性肝细胞等具有如提高SOD、GSH‑Px及CAT等重要抗氧化酶活性、调节TNF‑α等促炎症因子的表达、降低甘油三酯含量及提高HLD含量等作用，表现出广泛的肝损伤治疗效果。而从蜂王浆通过酶解提取的蜂王浆肽(RJP)也表现出抗氧化、ACE抑制、抗菌及炎症因子调控等多种活性，但由于肽的稳定性、胃肠道生理障碍以及理化性质的限制,导致蜂王浆肽难以被完好地靶向递送至肝部并发挥功效。另一方面，虾青素(3,3’‑二羟基‑4,4’‑二酮基‑β,β’‑胡萝卜素)，分布在海洋藻类、菌类和甲壳类动物中，其中雨生红球藻是最理想的天然虾青素来源。多项研究证实虾青素作为一种天然强抗氧化剂，能够调节肝细胞氧化应激反应，在缓解肝脏胰岛素抵抗及非酒精性脂肪肝等方面具有重要作用。但同样虾青素存在水溶性低、稳定性差等问题，严重影响其在肝损伤治疗中的应用。 [0004] 因此，为了提高蜂王浆肽及虾青素的生物利用度，能够在口服后达到良好的保肝护肝，缓解肝损伤的作用，构建合适的能够抵抗消化道环境影响、增强黏液与上皮屏障透过效果并稳定靶向肝细胞的载运体系是非常有效的技术手段，也是近年的研究热点之一。 发明内容[0005] 本发明针对上述目的，在第一方面上，为了解决肽段具有高抗氧化活性、减少肝细胞脂肪堆积作用的问题，本申请的一些实施例提供蜂王浆肽，其氨基酸序列包括Ala‑Ser‑Lys‑Leu‑Ala‑Ile‑Asp。 [0006] 在第二方面上，在本申请的一些实施例提供上述第一方面的蜂王浆肽的制备方法，包括 [0007] S11.将蜂王浆加入其3～5倍质量体积的水制成匀浆液置于酶解罐中。 [0008] S12.向酶解罐中加入蜂王浆质量的1～3％的复合蛋白酶，酶解后升温灭酶，得到蜂王浆酶解液，其中，复合蛋白酶包括碱性蛋白酶、胰蛋白酶以及风味蛋白酶，碱性蛋白酶:胰蛋白酶:风味蛋白酶＝(3～5):(1～2):(2～4)。 [0009] S13.将蜂王浆酶解液离心，得清液。 [0010] S14.将清液进行膜分离，截留分子量为3000Da。 [0011] S15.过膜液通过凝胶色谱柱进行分离纯化，洗脱溶剂为去离子水，洗脱流速为0.5～0.8mL/min，在220nm下检测吸光度，收集保留时间8～9min的洗脱峰。 [0012] S16.采用色谱柱进一步纯化，流动相A为含体积百分数0.05～0.1％三氟乙酸水，流动相B为乙腈，梯度洗脱条件为：0～10min，10％B，10～20min，10～15％B，20～25min，15～25％B，25～35min，25～30％B，流速为0.8～1.0mL/min，收集保留时间为32～33min的洗脱峰，得蜂王浆肽。 [0013] 根据本申请一些实施例的蜂王浆肽的制备方法，步骤S12中，酶解温度为50～55℃，酶反应pH为9.0～10.0，酶解时间为3～4h。 [0014] 根据本申请一些实施例的蜂王浆肽的制备方法，步骤S12中，酶解后升温至90℃灭酶10分钟，得到蜂王浆酶解液。 [0015] 根据本申请一些实施例的蜂王浆肽的制备方法，步骤S13中，蜂王浆酶解液在8000转/分钟离心10分钟。 [0016] 根据本申请一些实施例的蜂王浆肽的制备方法，步骤S15中，采用20mm×100mm的SephadexG10凝胶色谱柱进行分离纯化。 [0017] 根据本申请一些实施例的蜂王浆肽的制备方法，步骤S16中，采用C18色谱柱进一步纯化。 [0018] 根据本申请一些实施例的蜂王浆肽的制备方法，步骤S16中，蜂王浆肽浓缩、冷冻干燥，得蜂王浆肽粉。 [0019] 在第三方面上，为了解决对蜂王浆肽肝靶向运载的问题，在本申请的一些实施例提供半乳糖基化细菌纤维素载体运载蜂王浆肽的复合物及其制备方法，是一种制备蜂王浆肽‑半乳糖基化细菌纤维素载体复合物的方法，复合物由制备方法制得，制备方法包括[0020] S31.将蜂王浆肽与半乳糖基化细菌纤维素载体溶于水，搅拌，冷冻干燥，得蜂王浆肽‑半乳糖基化细菌纤维素载体复合物。 [0021] 其中，所述半乳糖基化细菌纤维素载体，基于如下方式制备： [0022] S21.将细菌纤维素溶于含四丁基醋酸铵的二甲基亚砜(DMSO)溶液中，搅拌，得细菌纤维素溶液。 [0023] S22.将乳糖酸溶于含有1‑乙基‑3‑(3‑(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺(EDC)及1‑乙基‑3‑(3‑(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺(NHS)的二甲基亚砜(DMSO)溶液中，搅拌，得乳糖酸溶液。 [0024] S23.将细菌纤维素溶液加入乳糖酸溶液中，加热搅拌，去除杂质，得半乳糖基化细菌纤维素载体。 [0025] 根据本申请的一些实施例的制备蜂王浆肽‑半乳糖基化细菌纤维素载体复合物的方法，步骤S21中，将细菌纤维素溶于含四丁基醋酸铵的二甲基亚砜溶液中，搅拌至无胶状物凝聚，得质量体积比为1～5％的均一的细菌纤维素溶液。 [0026] 步骤S22中，将乳糖酸溶于含有1‑乙基‑3‑(3‑(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺(EDC)及1‑乙基‑3‑(3‑(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺(NHS)的二甲基亚砜(DMSO)溶液中，搅拌进行羧基活化，活化时间为1～3h，更优选地为2h，得质量体积比为1～10％的乳糖酸溶液。 [0027] 其中，乳糖酸：1‑乙基‑3‑(3‑(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺(EDC)：1‑乙基‑3‑(3‑(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺(NHS)＝1～5：1：1，优选地为1:1:1。 [0028] 步骤S23中，将细菌纤维素溶液加入乳糖酸溶液中，加热搅拌，去除杂质，冷冻干燥，得半乳糖基化细菌纤维素载体粉，其中，加热搅拌温度为40～50℃，加热搅拌时间为10～24h。 [0029] 根据本申请的一些实施例的制备蜂王浆肽‑半乳糖基化细菌纤维素载体复合物的方法，步骤S23中，去除杂质包括在透析管中蒸馏水透析去除未反应的乳糖酸、细菌纤维素及含有含四丁基醋酸铵的二甲基亚砜(DMSO)溶液。 [0030] 根据本申请的一些实施例的制备蜂王浆肽‑半乳糖基化细菌纤维素载体复合物的方法，步骤S23中，透析时间为24～72h，更优选地为72h。 [0031] 根据本申请的一些实施例的制备蜂王浆肽‑半乳糖基化细菌纤维素载体复合物的方法，步骤S31中，将蜂王浆肽与半乳糖基化细菌纤维素载体粉溶于10倍体积的超纯水，80～90℃搅拌反应4～6h，冷冻干燥，得蜂王浆肽‑半乳糖基化细菌纤维素载体复合物粉。 [0032] 根据本申请的一些实施例的制备蜂王浆肽‑半乳糖基化细菌纤维素载体复合物的方法，步骤S31中，蜂王浆肽与半乳糖基化细菌纤维载体粉的质量比为1～10:1，更优选地为5：1。 [0033] 在第四方面上，为了解决对蜂王浆肽和虾青素的肝靶向运载的问题，在本申请的一些实施例提供上述第三方面的半乳糖基化细菌纤维素载体运载蜂王浆肽和虾青素的复合物及其制备方法，是一种制备蜂王浆肽‑虾青素‑半乳糖基化细菌纤维素载体复合物的方法，复合物由制备方法制得，制备方法包括 [0034] S41.将虾青素溶于乙醇溶液，将蜂王浆肽‑半乳糖基化细菌纤维素载体复合物溶于水。 [0036] 根据本申请一些实施例的制备蜂王浆肽‑虾青素‑半乳糖基化细菌纤维素载体复合物的方法，步骤S41中，将虾青素含量10％的虾青素油溶于乙醇溶液，搅拌均匀。 [0037] 根据本申请一些实施例的制备蜂王浆肽‑虾青素‑半乳糖基化细菌纤维素载体复合物的方法，步骤S41中，虾青素油与乙醇溶液的质量体积比为1～10％，更优选地为5％。 [0038] 根据本申请一些实施例的制备蜂王浆肽‑虾青素‑半乳糖基化细菌纤维素载体复合物的方法，步骤S41中，虾青素油与蜂王浆肽‑半乳糖基化细菌纤维素载体复合物的质量比为1:1～10，更优选地为1:1。 [0039] 根据本申请一些实施例的制备蜂王浆肽‑虾青素‑半乳糖基化细菌纤维素载体复合物的方法，步骤S41中，将蜂王浆肽‑半乳糖基化细菌纤维素载体复合物溶于10倍体积的超纯水。 [0040] 根据本申请一些实施例的制备蜂王浆肽‑虾青素‑半乳糖基化细菌纤维素载体复合物的方法，步骤S42中，将溶有虾青素油的乙醇溶液，缓慢滴入蜂王浆肽‑半乳糖基化细菌纤维素载体复合物的溶液中，滴入过程中加热搅拌进行反应，蒸发去除乙醇，冷冻干燥，得蜂王浆肽‑虾青素‑半乳糖基化细菌纤维素载体复合物粉末。 [0041] 根据本申请一些实施例的制备蜂王浆肽‑虾青素‑半乳糖基化细菌纤维素载体复合物的方法，步骤S42中，搅拌速度为500～1500r/min，反应温度为40～60℃，反应时间为2～4h。 [0042] 有益效果： [0043] 本发明通过凝胶排阻色谱法及反相高效液相色谱的分离纯化从蜂王浆中获得一个具有高抗氧化活性及减少肝细胞脂肪堆积作用的活性肽，氨基酸序列为：Ala‑Ser‑Lys‑Leu‑Ala‑Ile‑Asp，经在线数据库BIOPEP及EROP‑Moscow检索，该序列是一个新的小分子活性肽。 [0044] 本发明采用半乳糖修饰细菌纤维素作为蜂王浆肽、虾青素的肝靶向递送载体，一方面蜂王浆肽与接枝在细菌纤维素上的半乳糖通过美拉德反应连接，另一方面蜂王浆肽与虾青素通过乳化作用进行包裹，并且蜂王浆肽与虾青素同时被细菌纤维素独特的三维网状结构包被，能够延长蜂王浆肽与虾青素的释放时间，具有极高的生物相容性、生物可降解性，大量羟基团的存在也很好地对抗极端pH值环境的变化对于芯材的结构影响。 [0045] 同时与多有报道的半乳糖修饰壳聚糖载运体系相比，细菌纤维素的三维网状结构，具有极大的孔隙度，对芯材的包被效果更有利于保护蜂王浆肽不受胃肠道内各类蛋白酶的水解消化作用，以及提高虾青素在肠胃道的稳定性。由此，蜂王浆肽‑虾青素‑半乳糖基化细菌纤维素微粒具有更好的柔韧性以及高附着力，不仅能够应对胃肠道肌肉的蠕动以及腔内胃液流速引起的剪切应力，以减少对蜂王浆肽以及虾青素的机械降解，还可以增强在牢固粘附层的粘附作用，有效地延长在胃肠道中的停留时间来增强吸收，这种柔韧性也降低了芯材进入体循环后被网状内皮系统中的巨噬细胞吞噬的概率，从而提高递送至靶细胞的效率。 [0046] 综上所述，本发明提供的方法制备的蜂王浆肽‑虾青素‑半乳糖基化细菌纤维素在胃肠消化道中保护蜂王浆肽与虾青素的分子结构，并增强其吸收，延缓释放，最终精准靶向递送至肝细胞。蜂王浆肽与虾青素二者协同作用，调节肝细胞的氧化应激系统，减少ROS的产生，缓解脂质的过氧化变性，改善肝脏炎症反应，并减少肝细胞中脂滴的蓄积，对比单独使用具有更好的肝损伤治疗效果。该方法简单易于操作，适用于工业化制备场景，在肝损伤的预防与治疗中具有广阔的应用前景。 [0048] 图1肝脏脂质堆积变化。 [0049] 图2细菌纤维素的三维网状结构。 具体实施方式[0050] 以下结合附图与实施例对本发明作进一步说明，需要说明的是，实施例并不构成对本发明要求保护范围的限制。 [0051] 在实施例中，本发明提供一种载体复合物及其制备方法，能够在胃肠道内降低蜂王浆肽、虾青素受pH值，以及胃蛋白酶、胰蛋白酶等消化水解酶的失活作用的影响，同时增强在黏膜的粘附以延长在胃肠道中的时间来提高吸收，并且在吸收后直接靶向递送至受损的肝细胞，缓解氧化应激、细胞炎症与脂肪堆积等肝细胞损伤蜂王浆肽。 [0052] 载体复合物蜂王浆肽经过下列工艺步骤： [0053] 步骤1.蜂王浆肽制备：将蜂王浆处理后，加入3～5倍质量体积的水制成匀浆液，加入蜂王浆质量1～3％的复合蛋白酶，在50～55℃下酶解3～4小时，酶反应pH值控制在9.0～10.0，所述复合蛋白酶的质量配比为：碱性蛋白酶:胰蛋白酶:风味蛋白酶＝(3～5):(1～ 2):(2～4)；酶解结束后升温至90℃灭酶10分钟，得到蜂王浆酶解液，将蜂王浆酶解液以 8000转/分钟离心10分钟，去除颗粒状物质，清液采用截留分子量为3000Da的膜进行分离，过膜液先采用SephadexG 10(20mm×100mm)凝胶色谱柱进行分离纯化，洗脱溶剂为去离子水，洗脱流速为0.5‑0.8mL/min，在220nm下检测其吸光度，收集保留时间8‑9min的洗脱峰； 用C18色谱柱，流动相A为含体积百分数0.05～0.1％三氟乙酸水，流动相B为乙腈，梯度洗脱条件为：0～10min，10％B，10～20min，10～15％B，20～25min，15～25％B，25～35min，25～ 30％B，流速为0.8‑1.0mL/min，收集保留时间为32‑33min的洗脱峰，浓缩后冷冻干燥得蜂王浆肽(RJP)； [0054] 进一步的，步骤1所述蜂王浆肽的氨基酸序列为：Ala‑Ser‑Lys‑Leu‑Ala‑Ile‑Asp。 [0055] 步骤2.半乳糖基化细菌纤维素载体的制备：取细菌纤维素溶于含四丁基醋酸铵的二甲基亚砜(DMSO)溶液中搅拌至无胶状物凝聚后，制备成均一的细菌纤维素溶液；取乳糖酸溶于含有1‑乙基‑3‑(3‑(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺EDC及1‑乙基‑3‑(3‑(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺NHS(1:1)的二甲基亚砜(DMSO)溶液中搅拌进行羧基活化；将细菌纤维素溶液加入乳糖酸溶液加热搅拌，然后在透析管中蒸馏水透析去除未反应的乳糖酸、细菌纤维素及含有四丁基醋酸铵的DMSO溶剂等杂质，冷冻干燥制得半乳糖基化细菌纤维素粉末(GBC)。 [0056] 进一步的，步骤2中的细菌纤维素溶液质量体积比为1～5％。 [0057] 进一步的，步骤2中的乳糖酸溶液的质量体积比为1～10％。 [0058] 进一步的，步骤2中的乳糖酸、EDC与NHS的质量比为1～5：1：1，优选的为1:1:1。 [0059] 进一步的，步骤2中的活化时间为1～3小时，优选的为2小时。 [0060] 进一步的，步骤2中的加热搅拌温度为40～50℃，搅拌时间为10～24小时。 [0061] 进一步的，步骤2中的透析时间为24～72小时，优选的为72小时。 [0062] 步骤3.蜂王浆肽‑半乳糖基化细菌纤维素复合物载体的制备：取步骤1制备的蜂王浆肽粉与半乳糖基化细菌纤维素粉复溶于10倍体积的超纯水，80～90℃搅拌反应4～6小时，冷冻干燥获得蜂王浆肽‑半乳糖基化细菌纤维素复合物载体粉末(RJP‑GBC)。 [0063] 进一步的，步骤3中蜂王浆肽粉与半乳糖基化细菌纤维粉的质量比为1～10:1，优选的为5：1。 [0064] 由上述步骤，本发明得到了蜂王浆肽‑半乳糖基化细菌纤维素载体复合物，通过半乳糖基化细菌纤维素载体，能够实现对蜂王浆肽的肝靶向运载。作为进一步的方案，其中的蜂王浆肽是本发明的上述能够具有高抗氧化活性及减少肝细胞脂肪堆积作用的蜂王浆肽，当然，可以理解的是，其还可以是现有技术中的其他需要肝靶向运载的蜂王浆肽。除使用本发明的上述蜂王浆肽与载体复合，还可以进一步复合虾青素，虾青素作为一种天然强抗氧化剂，在抑制肝纤维化、防治肝脏肿瘤发生、缓解肝脏胰岛素抵抗及非酒精性脂肪肝等方面具有重要作用。因此，本发明还进一步包括下述步骤4。 [0065] 步骤4.蜂王浆肽‑虾青素‑半乳糖基化细菌纤维素复合物载体的制备：取虾青素含量10％的虾青素油溶于乙醇溶液搅拌均匀，取蜂王浆肽‑半乳糖基化细菌纤维素粉末复溶于10倍体积的超纯水，随后将虾青素油乙醇溶液缓慢滴入搅拌中的蜂王浆肽‑半乳糖基化细菌纤维素溶液并加热进行反应，蒸发去除乙醇后冷冻干燥获得蜂王浆肽‑虾青素‑半乳糖基化细菌纤维素微粒(RJP‑AST‑GBC)粉末； [0066] 进一步的，步骤4中的虾青素油与乙醇溶液的质量体积比为1～10％，优选的为5％。 [0067] 进一步的，步骤4中的虾青素油与蜂王浆肽‑半乳糖基化细菌纤维素的质量比为1:1～10，优选的为1:1。 [0068] 进一步的，步骤4中搅拌速度为500～1500r/min，反应温度为40～60℃，反应时间为2～4小时。 [0069] 现有半乳糖介导的肝实质细胞细胞膜上的去唾液酸糖蛋白受体靶向递送多集中于对药物直接进行半乳糖修饰，或是构建半乳糖修饰的脂质体、聚合物胶束载体，来实现良好的靶向递送性能。然而患有高脂血症和肥胖等疾病的人可能无法接受基于脂质的运载体系，而乳液运载体系存在操作过程中涉及的高压均质、超声等可能会影响到虾青素的结构，进而影响包埋率、稳定性、生物利用度等性能。 [0070] 本发明采用半乳糖修饰细菌纤维素作为蜂王浆肽、虾青素的肝靶向递送载体，一方面蜂王浆肽与接枝在细菌纤维素上的半乳糖通过美拉德反应连接，另一方面蜂王浆肽与虾青素通过乳化作用进行包裹，并且蜂王浆肽与虾青素同时被细菌纤维素独特的三维网状结构包被，能够延长蜂王浆肽与虾青素的释放时间，具有极高的生物相容性、生物可降解性，大量羟基团的存在也很好地对抗极端pH值环境的变化对于芯材的结构影响。 [0071] 同时与多有报道的半乳糖修饰壳聚糖载运体系相比，细菌纤维素的三维网状结构，具有极大的孔隙度，对芯材的包被效果更有利于保护蜂王浆肽不受胃肠道内各类蛋白酶的水解消化作用，以及提高虾青素在肠胃道的稳定性。由此，蜂王浆肽‑虾青素‑半乳糖基化细菌纤维素微粒具有更好的柔韧性以及高附着力，不仅能够应对胃肠道肌肉的蠕动以及腔内胃液流速引起的剪切应力，以减少对蜂王浆肽以及虾青素的机械降解，还可以增强在牢固粘附层的粘附作用，有效地延长在胃肠道中的停留时间来增强吸收，这种柔韧性也降低了芯材进入体循环后被网状内皮系统中的巨噬细胞吞噬的概率，从而提高递送至靶细胞的效率。 [0072] 综上所述，本发明提供的方法制备的蜂王浆肽‑虾青素‑半乳糖基化细菌纤维素在胃肠消化道中保护蜂王浆肽与虾青素的分子结构，并增强其吸收，延缓释放，最终精准靶向递送至肝细胞。蜂王浆肽与虾青素二者协同作用，调节肝细胞的氧化应激系统，减少ROS的产生，缓解脂质的过氧化变性，改善肝脏炎症反应，并减少肝细胞中脂滴的蓄积，对比单独使用具有更好的肝损伤治疗效果。该方法简单易于操作，适用于工业化制备场景，在肝损伤的预防与治疗中具有广阔的应用前景。 [0073] 实施例1: [0074] 步骤1.将蜂王浆1000g粗粉碎处理后，加入20倍质量体积的水制成匀浆液，加入蜂王浆质量2％的复合蛋白酶，在55℃下酶解4小时，酶反应pH值控制在9.0，所述复合蛋白酶的质量配比为：碱性蛋白酶:胰蛋白酶:风味蛋白酶＝5:2:3；酶解结束后升温至90℃灭酶10分钟，得到蜂王浆酶解液，将蜂王浆酶解液以8000转/分钟离心10分钟，去除颗粒状物质，清液采用截留分子量为3000Da的膜进行分离，过膜液先采用SephadexG 10(20mm×100mm)凝胶色谱柱进行分离纯化，洗脱溶剂为去离子水，洗脱流速为0.5mL/min，在220nm下检测其吸光度，收集保留时间8.33min的洗脱峰；用C18色谱柱，流动相A为含体积百分数0.1％三氟乙酸水，流动相B为乙腈，梯度洗脱条件为：0～10min，10％B，10～20min，10～15％B，20～25min，15～25％B，25～35min，25～30％B，流速为0.8mL/min，收集保留时间为32.18min的洗脱峰，浓缩后冷冻干燥得蜂王浆肽(RJP)9.4g。 [0075] 步骤2.取细菌纤维素20g溶于1000ml含四丁基醋酸铵的DMSO溶液中搅拌至无胶状物凝聚后，制备成均一的细菌纤维素溶液；取乳糖酸10g溶于1000ml含有5gEDC及5gNHS的DMSO溶液中搅拌进行羧基活化2小时；将细菌纤维素溶液加入乳糖酸溶液加热至45℃搅拌18小时，然后透析48小时后冷冻干燥制得半乳糖基化细菌纤维素粉末30g。 [0076] 步骤3.取蜂王浆肽粉8g与半乳糖基化细菌纤维素粉2g复溶于10倍体积的超纯水，100℃搅拌反应3小时，冷冻干燥获得蜂王浆肽‑半乳糖基化细菌纤维素复合物载体粉末 10g。 [0077] 步骤4.取虾青素油10g溶于100ml乙醇溶液搅拌均匀，取蜂王浆肽‑半乳糖基化细菌纤维素粉末10g复溶于10倍体积的超纯水，随后将虾青素油乙醇溶液缓慢滴入搅拌中的蜂王浆肽‑半乳糖基化细菌纤维素溶液并加热至60℃在1000r/min搅拌速度下进行反应3小时，蒸发去除乙醇后冷冻干燥获得RJP‑AST‑GBC微粒粉末20g。 [0078] 实施例2： [0079] 步骤1.将蜂王浆1000g粗粉碎处理后，加入15倍质量体积的水制成匀浆液，加入蜂王浆质量3％的复合蛋白酶，在50℃下酶解3小时，酶反应pH值控制在9.5，所述复合蛋白酶的质量配比为：碱性蛋白酶:胰蛋白酶:风味蛋白酶＝4:1:2；酶解结束后升温至90℃灭酶10分钟，得到蜂王浆酶解液，将蜂王浆酶解液以8000转/分钟离心10分钟，去除颗粒状物质，清液采用截留分子量为3000Da的膜进行分离，过膜液先采用SephadexG 10(20mm×100mm)凝胶色谱柱进行分离纯化，洗脱溶剂为去离子水，洗脱流速为0.8mL/min，在220nm下检测其吸光度，收集保留时间8.1min的洗脱峰；用C18色谱柱，流动相A为含体积百分数0.1％三氟乙酸水，流动相B为乙腈，梯度洗脱条件为：0～10min，10％B，10～20min，10～15％B，20～25min，15～25％B，25～35min，25～30％B，流速为1.0mL/min，收集保留时间为32.54min的洗脱峰，浓缩后冷冻干燥得蜂王浆肽(RJP)8.8g。 [0080] 步骤2.取细菌纤维素30g溶于1000ml含四丁基醋酸铵的DMSO溶液中搅拌至无胶状物凝聚后，制备成均一的细菌纤维素溶液；取乳糖酸10g溶于1000ml含有5gEDC及5gNHS的DMSO溶液中搅拌进行羧基活化2小时；将细菌纤维素溶液加入乳糖酸溶液加热至45℃搅拌24小时，然后透析48小时候冷冻干燥制得半乳糖基化细菌纤维素粉末40g。 [0081] 步骤3.取蜂王浆肽粉8g与半乳糖基化细菌纤维素粉4g复溶于10倍体积的超纯水，90℃搅拌反应6小时，冷冻干燥获得蜂王浆肽‑半乳糖基化细菌纤维素复合物载体粉末12g。 [0082] 步骤4.取虾青素油6g溶于100ml乙醇溶液搅拌均匀，取蜂王浆肽‑半乳糖基化细菌纤维素粉末12g复溶于10倍体积的超纯水，随后将虾青素油乙醇溶液缓慢滴入搅拌中的蜂王浆肽‑半乳糖基化细菌纤维素溶液并加热至50℃在1500r/min搅拌速度下进行反应2小时，蒸发去除乙醇后冷冻干燥获得RJP‑AST‑GBC微粒粉末18g。 [0083] 对比例1： [0084] 按照实施例1步骤1～步骤3实施，获得蜂王浆肽‑半乳糖基化细菌纤维素复合物载体(RJP‑GBC)粉末9.4g。 [0085] 对比例2： [0086] 步骤1.取细菌纤维素15g溶于1000ml含四丁基醋酸铵的DMSO溶液中搅拌至无胶状物凝聚后，制备成均一的细菌纤维素溶液；取乳糖酸5g溶于1000ml含有5gEDC及5gNHS的DMSO溶液中搅拌进行羧基活化2小时；将细菌纤维素溶液加入乳糖酸溶液加热至40℃搅拌24小时，然后透析48小时候冷冻干燥制得半乳糖基化细菌纤维素粉末20g。 [0087] 步骤2.取虾青素油10g溶于100ml乙醇溶液搅拌均匀，取半乳糖基化细菌纤维素粉末10g复溶于10倍体积的超纯水，随后将虾青素油乙醇溶液缓慢滴入搅拌中的半乳糖基化细菌纤维素溶液并加热至50℃在1000r/min搅拌速度下进行反应3小时，蒸发去除乙醇后冷冻干燥获得虾青素‑半乳糖基化细菌纤维素(AST‑GBC)微粒粉末20g。 [0088] 对比例3： [0089] 步骤1：按照实施例1步骤1实施获得蜂王浆肽9g。 [0090] 步骤2：取20g壳聚糖溶于1000mL 0.1mol/L MES buffer中，待其完全溶解后调节pH值至5.7，再同时加入8g乳糖酸、10g NHS、10g EDC，搅拌反应30min，完全溶解后置于4℃放置12h，然后转移至室温放置12h，最后用透析袋透析3d，取出透析液冷冻干燥得到半乳糖基化壳聚糖粉末30g。 [0091] 步骤3.蜂王浆肽粉8g与半乳糖基化壳聚糖粉2g复溶于10倍体积的超纯水，90℃搅拌反应6小时，冷冻干燥获得蜂王浆肽‑半乳糖基化壳聚糖粉末10g。 [0092] 步骤4.取虾青素油10g溶于100ml乙醇溶液搅拌均匀，取蜂王浆肽‑半乳糖基化壳聚糖粉末10g复溶于10倍体积的超纯水，随后将虾青素油乙醇溶液缓慢滴入搅拌中的蜂王浆肽‑半乳糖基化壳聚糖溶液并加热至60℃在500r/min搅拌速度下进行反应2小时，蒸发去除乙醇后冷冻干燥获得蜂王浆肽‑虾青素‑半乳糖基化壳聚糖(RJP‑AST‑GC)粉末20g。 [0093] 实验1：蜂王浆肽(Ala‑Ser‑Lys‑Leu‑Ala‑Ile‑Asp)DPPH自由基清楚能力测定[0094] 称取实施例1中所得蜂王浆肽(RJP)、蜂王浆肽‑虾青素‑半乳糖基化细菌纤维素(RJP‑AST‑GBC)，制备成质量浓度为20μg/mL的样品液。配制0.2mmol/L的DPPH溶液，避光存放。在96孔板中加入50μL的蜂王浆肽水溶液(20μg/mL)和150μL的DPPH溶液，混匀，避光反应30min，在517nm处测定吸光度值A1。水乙醇加入样品溶液做空白，测吸光度A2；无水乙醇加入DPPH作对照，测吸光度A3。阳性对照采用抗坏血酸。DPPH自由基清除率的计算公式为： DPPH自由基清除率％＝[1‑(A1‑A2)/A3]×100。结果表明RJP,RJP‑AST‑GBC,以及抗坏血酸对DPPH自由基清除能力的IC50值分别为8.71、6.10、23.20μg/mL，说明步骤1纯化的蜂王浆肽具有显著的抗氧化活性，同时与虾青素经过载体包埋后抗氧化活性没有受到破坏并有较大提升。 [0095] 实验2：蜂王浆肽(Ala‑Ser‑Lys‑Leu‑Ala‑Ile‑Asp)的脂肪型肝细胞改善效果[0096] 将HepG2细胞培养在含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基中，置于含5％CO2的37℃恒温培养箱中。分别设置对照组:普通培养基培养(含等浓度溶解介质)；模型组:0.25mmol/L棕榈酸培养24h后换普通培养基；蜂王浆肽组:0.25mmol/L棕榈酸培养24h，以16μg/mL蜂王浆肽溶液干预12h。加入油红O染色液染色15min，蒸馏水冲洗数次后异丙醇溶解染料，置于酶标仪下，在570nm波长下测定各组吸光度数值D570。结果显示蜂王浆肽组的D570(0.26±0.05)相比模型组的D570(0.52±0.11)有显著性的降低，趋近于空白组的D570(0.20±0.04)，表明蜂王浆肽溶液干预有效减少了脂肪型肝细胞的脂肪堆积。 [0097] 实验3：体外模拟胃肠液消化 [0098] 取5mL浓盐酸(37％)，5mL吐温80，2g Na Cl，3.2g胃蛋白酶，加水定容至1L，调节pH值至1.2，使用前用0.22μm有机滤膜过滤作为模拟胃液。取磷酸二氢钾6.8g，10g胰蛋白酶，5mL吐温80，加水定容至1L，超声使其溶解完全，用稀氢氧稀释的化钠溶液调节pH值至6.8，使用前用0.22μm有机滤膜过滤作为模拟肠液。分别取实施例1中获得的RJP‑AST‑GBC和对比例中获得的RJP‑GBC,AST‑GBC,RJP‑AST‑GC粉末4mg置于透析袋(MWCO 3500)中，浸入200mL人工胃液(或肠液)，在体系温度为37℃的恒温磁力搅拌器中搅拌，转速为100rpm/min，分别在30min以及1、6、12、24h的时间点取样1mL，同时取样后再补入1mL相同基质的空白人工胃液(或肠液)，取出的样品经离心后取上清液，用0.22μm有机滤膜过滤后，采用高效液相色谱仪检测蜂王浆肽以及虾青素的含量。 [0099] 结果表明随着时间增长各组的芯材在人工胃肠液中的释放率逐渐增加，在释放率趋于稳定的6h与12h，RJP‑AST‑GBC组(人工胃液RJP:5.77％/7.84％；AST:6.92％/9.40％；人工肠液RJP:6.83％/8.55％；AST:7.51％/9.28％)由于蜂王浆肽‑虾青素，蜂王浆肽‑半乳糖‑细菌纤维素，以及虾青素‑细菌纤维素的多重包裹作用，大大提高了稳定性，释放率低于单独载运蜂王浆肽或虾青素的载运体系，同时由于细菌纤维素三维网络结构作用，稳定性明显优于半乳糖基化壳聚糖的运载体系，表明RJP‑AST‑GBC体系在人工胃肠液环境下能够稳定存在，对蜂王浆肽及虾青素起到了保护作用，有利于被人体吸收。 [0100] 实验4：肝靶向性 [0101] 雄性SD大鼠适应性饲养3‑5d，随机分RJP‑AST‑GBC1组(5mg/kg)，AST‑GBC组(3mg/kg)以及RJP‑AST‑GC组(5mg/kg)，每组12只。给药前12h禁食，按剂量分别给大鼠灌胃，给药后0.5，1，4，12，24h(每个时间点12只大鼠，每组各3只)断头处死大鼠，放尽血液后，得肝、肺、肾样品，然后加入2倍量生理盐水，使用组织匀浆器把上述样品制成匀浆。精密‑吸取组织匀浆液200μL于1.5mL离心管中，加入600μL甲醇，涡旋震荡2min，于10000r/min离心5min，精密吸取上清液500μL，氮气吹干，200μL甲醇复溶，涡旋混合1min，取20μL进样，HPLC测定虾青素含量。根据Gupta的方法用靶向效率(Targeting efficiency，Te)，来评价RJP‑AST‑GBC的肝靶向性。结果显示RJP‑AST‑GBC组的肝靶向效率(52.05±6.24)高于AST‑GBC组(41.83±3.37)以及RJP‑AST‑GC组(30.68±5.10)，具有非常高的肝脏靶向性。 [0102] 实验5：NAFLD小鼠脂肪堆积改善效果 [0103] 小鼠适应性喂养一周后，随机挑选10只小鼠喂养普通饲料(空白对照组)，其余小鼠均给予高脂饲料进行自由进食8周。然后将喂养高脂饲料的小鼠随机分为3组(每组12只)进行灌胃，每日一次，连续6周：(1)普通饲料+生理盐水(模型组)；(2)普通饲料RJP‑AST‑GBC组；(3)普通饲料+RJP；(4)普通饲料+AST；(5)普通饲料+RJP‑AST‑GC。第14周结束时小鼠禁食4小时后全部处死。肝脏取出后经常规方法进行冰冻切片，按试剂盒说明进行油红O染色，用异丙醇萃取细胞内脂滴的油红，570nm下测定吸光度数值。由图1所示，模型组与空白组相比，模型组的脂滴油红吸光度较空白组具有极显著性升高，说明NAFLD模型建立成功。RJP‑AST‑GBC干预处理显著降低了NAFLD小鼠肝脏中脂质的堆积，趋近于空白组水平，效果也优于单独投喂蜂王浆肽或虾青素，以及蜂王浆肽‑虾青素‑半乳糖基化壳聚糖载运体系。 [0104] 实验6：酒精性肝损伤小鼠改善效果 [0105] 将60只小鼠随机均分为6组，即空白对照组、模型组、RJP‑AST‑GBC组(5mg/kg)、RJP组(3mg/kg)、AST组(3mg/kg)和RJP‑AST‑GC组(5mg/kg)，每组10只。实验第1～9天：各给药组小鼠灌胃给予相应剂量药物，正常组与模型组灌胃给予等体积的蒸馏水，1次/d，连续9d。第9～12天：即实验第9天起，每天上午正常给予相应剂量药物，1h后除正常组外，其余组小鼠灌胃40％乙醇溶液(10mL/kg)，连续4d。末次给予乙醇溶液后，禁食不禁水4h，颈椎脱臼法处死小鼠，解剖取肝脏组织，称重，加入9倍量生理盐水制备10％肝匀浆液，3500r/min离心 10min，取上清液分装。检测各组小鼠肝脏组织MDA和TNF‑α含量。结果表明模型组小鼠肝脏中MDA含量(0.78±0.21U/mg)明显升高，表明在模型组小鼠体内发生了较为严重的氧化应激反应，并且促炎细胞因子TNF‑α含量(80.64±3.78pg/mg)也大幅上升，引发肝细胞炎症损伤。而RJP‑AST‑GBC干预处理显著降低了肝脏中脂质过氧化程度(MDA含量：0.32±0.08U/mg)，同时起到了良好的调节炎症反应的作用(TNF‑α含量：61.09±2.47pg/mg)，同样效果也优于单独投喂蜂王浆肽或虾青素，以及蜂王浆肽‑虾青素‑半乳糖基化壳聚糖载运体系。 [0106] 通过上述实验结果可以看到本发明提供蜂王浆肽(Ala‑Ser‑Lys‑Leu‑Ala‑Ile‑Asp)具有良好的抗氧化及减少肝细胞脂肪堆积的活性，而蜂王浆肽‑虾青素‑半乳糖基化细菌纤维素运载体系对于多种类型的肝损伤具有很好的改善作用，是一种潜在的优质保肝护肝成分。 [0107] 本发明公开了一种蜂王浆肽虾青素肝靶向微球的制备方法及其肝损伤改善作用。从蜂王浆中通过酶解、超滤等步骤获得蜂王浆肽溶液，将其与半乳糖基化修饰的细菌纤维素连接搭载，最后将蜂王浆肽‑半乳糖基化细菌纤维素载体与虾青素油反应并冷冻干燥制得具有肝靶向性的蜂王浆胶原蛋肽‑虾青素‑半乳糖基化细菌纤维素微粒。所制备的蜂王浆胶原蛋肽虾青素给药体系在胃肠消化道中对芯材活性成分保护作用良好，吸收后具有极高的肝靶向性及递送率，能够缓解肝细胞氧化应激与炎症，进而改善急性或慢性肝损伤，在未来肝病的预防与治疗中有着非常广阔的应用前景。 [0108] 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有衍生，均应认为是本发明的保护范围。 |
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