一种激活酶催化反应的二肽双功能小分子化合物及其应用
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; 授权; |
| 专利有效性 | 有效专利 | 当前状态 | 授权 |
| 申请号 | CN202210846865.4 | 申请日 | 2022-07-06 |
| 公开(公告)号 | CN115073550A | 公开(公告)日 | 2022-09-20 |
| 申请人 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所; | 申请人类型 | 科研院所 |
| 发明人 | 丛志奇; 秦相全; 姜谊平; | 第一发明人 | 丛志奇 |
| 权利人 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 权利人类型 | 科研院所 |
| 当前权利人 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 当前权利人类型 | 科研院所 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：山东省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：山东省青岛市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：山东省青岛市崂山区松岭路189号 | 邮编 | 当前专利权人邮编：266101 |
| 主IPC国际分类 | C07K5/06 | 所有IPC国际分类 | C07K5/06 ; C07K5/062 ; C07K5/078 ; C07K1/107 ; C12P5/00 ; C12P11/00 |
| 专利引用数量 | 3 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 10 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 沈阳科苑专利商标代理有限公司 | 专利代理人 | 李颖; |
| 摘要 | 本 发明 涉及催化反应，具体的说是一种激活酶催化反应的二肽双功能小分子化合物及其应用。二肽双功能小分子化合物以C6为 基础 骨架分别连接催化基团和锚定基团，催化基团为咪唑，锚定基团为依次相连的两个 氨 基酸基团取代，即为Im‑C6‑Xaa‑Yaa。本发明方法的建立既可以大大降低对双功能小分子的用量，同时也提高了对底物的催化活性。 | ||
| 权利要求 | 1.一种激活酶催化反应的二肽双功能小分子化合物，双功能小分子含催化基团和锚定基团，其特征在于：二肽双功能小分子化合物以C6为基础骨架分别连接催化基团和锚定基团，催化基团为咪唑，锚定基团为依次相连的两个氨基酸基团取代，即为Im‑C6‑Xaa‑Yaa。 |
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| 说明书全文 | 一种激活酶催化反应的二肽双功能小分子化合物及其应用技术领域[0001] 本发明涉及催化反应，具体的说是一种激活酶催化反应的二肽双功能小分子化合物及其应用。 背景技术[0002] 细胞色素P450酶(P450s)是参与药物代谢、外源性解毒和类固醇生物合成的血蛋2] 白超家族。[1, P450s被认为是有机合成、药物发现和生物修复的有前景的生物催化剂，因[3‑17] 为它们具有多种催化氧化功能。 然而，在生物催化中应用P450的限制之一是大多数P450需要还原的烟酰胺辅因子NAD(P)H和复杂的电子传递伙伴(氧化还原伙伴)系统来激活分子氧以形成的活化物种。尽管过氧化物分流途径是避免消耗这些昂贵的辅助因子的替代[18,19] 方法，但该途径对于典型的P450效率低下。 事实上，只有少数天然P450属于CYP152家[20‑22] [23‑26] 族 考虑到过氧合酶作为实际生物催化剂的巨大潜力， 已经做出了许多努力来开[27‑31] 发过氧化物驱动的P450系统。 [0003] 通过模仿天然过氧合酶和过氧化物酶的分子结构和催化机制，[32,33]我们最近开发了一种独特的P450‑H2O2系统，该系统采用配备末端咪唑基的外源脂肪酰基氨基酸(称为双功能小分子，DFSM)激活P450BM3的过氧化物分流途径。典型的DFSM，如N‑咪唑基‑己酰基‑L‑苯丙氨酸(Im‑C6‑Phe)，被认为通过酰基氨基酸作为锚定基团与P450BM3结合，其咪唑基[34,41]部分作为促进H2O2活化的酸–碱催化剂。 该系统使用各种P450BM3变体来有效催化针对非天然底物的各种单氧化和氧化反应，例如苯乙烯环氧化、硫代苯甲醚磺化氧化、烷烃和芳香化合物的羟基化、芳香醚的去甲基化以及苯酚和芳香胺的单电子氧化。在这些反应中，发现催化活性和选择性取决于DFSM的存在。因此，我们推断DFSM促进的P450‑H2O2系统的催化能力可以通过微调DFSM的结构来进一步增强。 [0004] 晶体学研究揭示了Im‑C6‑Phe与P450BM3的不寻常结合模式，这与先前报道的天然脂肪酸底物及其类似物的结合模式不同，即除了氢键外，存在明显的疏水相互作用DFSM和[42]蛋白质之间的相互作用。 末端羧基直接与Tyr51形成氢键，同时通过水介导的氢键网络[43‑45] 与Arg47和Gln73相互作用 。值得注意的是，Im‑C6‑Phe的苄基部分埋在由Pro25、Val26、Leu29、Met185和Leu188组成的疏水口袋中，两种作用力相互作用把双功能小分子紧密的固定在酶上。 [0005] 综上所述，蛋白质工程技术为开发过氧化氢依赖的P450酶变异体提供了支持，但对催化活性的提高有限，开发更加高效稳定的双功能小分子有十分重要的价值和前景。 [0006] 1 D.Valikhani,J.M.Bolivar,J.N.Pelletier,ACS Catal.2021,11,9418‑9434.[0007] 2 S.A.Newmister,K.R.Srivastava,R.V.Espinoza,K.C.Haatveit,Y.Khatri,R.M.Martini,M.G‑Borras,L.M.Podust,K.N.Houk,D.H.Sherman,ACS Catal.2020,10,13445‑13454. [0008] 3 J.B.Y.H.Behrendorff,E.M.J.Gillam,Chem.Res.Toxicol.2017,30,453‑468.[0009] 4 Z.Wu,T.Lei,C.Shen,Z.Wang,D.Cao,T.Hou,J.Chem.Inf.Model.2019,59,4587‑4601. [0010] 5 V.Steck,J.N.Kolev,X.Ren,R.Fasan,J.Am.Chem.Soc.2020,142,10343‑10357.[0011] 6 C.K.Arya,S.Yadav,J.Fine,A.Casanal,G.Chopra,G.Ramanathan,K.R.Vinothkumar,R.Subramanian,Angew.Chem.,Int.Ed.2020,132,17109‑17114.[0012] 7 G.Mukherjee,J.K.Satpathy,U.K.Bagha,M.Q.E.Mubarak,C.V.Sastri,S.P.D.Visser,ACS Catal.2021,11,9761‑9797. [0013] 8 Y.Peng,C.Gao,Z.Zhang,S.Wu,J.Zhao,A.Li,ACS Catal.2022,12,2907‑2914.[0014] 9 D.Valikhani,J.M.Bolivar,J.N.Pelletier,ACS Catal.2021,11,9418‑9434.[0015] 10 R.V.Espinoza,K.C.Haatveit,S.W.Grossman,J.Tan,C.A.McGlade,Y.Khatri,S.A.Newmister,J.J.Schmidt,M.G.Borras,J.Montgomery,K.N.Houk,D.H.Sherman,ACS Catal.2021,11,8304‑8316. [0016] 11 J.Münch,P.Püllmann,W.Zhang,M.J.Weissenborn,ACS Catal.2021,11,9168‑9203. [0017] 12 F.Li,H.Renata,J.Am.Chem.Soc.2021,143,18280‑18286. [0018] 13 D.C.Miller,R.G.Lal,L.A.Marchetti,F.H.Arnold,J.Am.Chem.Soc.2022,144,4739‑4745. [0019] 14 D.C.Miller,S.V.Athavale,F.H.Arnold,Nat.Catal.2022,1,18–23.[0020] 15 D.Nam,A.Tinoco,Z.Shen,R.D.Adukure,G.Sreenilayam,S.D.Khare,R.Fasan,J.Am.Chem.Soc.2022,144,2590‑2602. [0021] 16 M.Karasawa,K.Yonemura,J.K.Stanfield,K.Suzuki,O.Shoji,Angew.Chem.,Int.Ed.2022,61,e202111612. [0022] 17 Y.Yang,I.Cho,X.Qi,P.Liu,F.H.Arnold,Nat.Chem.2019,11,987‑993.[0023] 18 Y.Jiang,W.Peng,Z.Li,C.You,Y.Zhao,D.Tang,B.Wan,S.Li,Angew.Chem.,Int.Ed.2021,133,24899‑24906. [0024] 19 A.Knorrscheidt,J.Soler,N.Hünecke,P.Püllmann,M.G.Borras,M.J.Weissenborn,ACS Catal.2021,11,7327‑7338. [0025] 20 M.Pickl,S.Kurakin,F.G.C.Reinhard,P.Schmid,A. C.K.Winkler,W.Kroutil,S.P.D.Visser,K.Faber,ACS Catal.2019,9,565‑577. [0026] 21 H.Li,Y.Liu,ACS Catal.2020,10,2942‑2957. [0027] 22 S.Wang,S.Jiang,H.Chen,W.Bai,X.Wang,ACS Catal.2020,10,14375‑14379.[0028] 23 H.Chen,M.Huang,W.Yan,W.Bai,X.Wang,ACS Catal.2021,11,10625‑10630.[0029] 24 Y.Wang,D.Lan,R.Durrani,F.Hollmann,Curr.Opin.Chem.Biol.2017,37,1‑9.[0030] 25 A.Knorrscheidt,J.Soler,N.Hünecke,P.Püllmann,M.G.Borras,M.J.Weissenborn,ACS Catal.2021,11,7327‑7338. [0031] 26 M.C.Sigmund,G.J.Poelarends,Nat.Catal.2020,3,690‑702. [0032] 27 P.G.D.Santos,S.Lazaro,J.V.Gonzalez,M.D.Hoang,I.S.Moreno,A.Glieder,F.Hollmann,M.Alcalde,ACS Catal.2020,10,13524‑13534. [0033] 28 G.Grogan,JACS Au.2021,1,1312‑1329. [0034] 29 O.Shoji,Y.Watanabe,J.Biol.Inorg.Chem.2014,19,529‑539. [0035] 30 D.Yu,J.Wang,M.T.Reetz,J.Am.Chem.Soc.2019,141,5655‑5658. [0036] 31 T.Coleman,A.M.Kirk,J.H.Z.Lee,D.Z.Doherty,J.B.Bruning,E.H.Krenske,J.J.D.Voss,S.G.Bell,ACS Catal.2022,12,1258‑1267. [0037] 32 F.P.Guengerich,ACS Catal.2018,8,10964‑10976. [0038] 33 C.J.C.Whitehouse,S.G.Bel,L.L.Wong,Chem.Soc.Rev.2012,41,1218‑1260.[0039] 34 N.Ma,Z.Chen,J.Chen,J.Chen,C.Wang,H.Zhou,L.Yao,O.Shoji,Y.Watanabe,Z.Cong,Angew.Chem.,Int.Ed.2018,130,7754‑7759. [0040] 35 J.Xu,C.Wang,Z.Cong,Chem.Eur.J.2019,25,6853‑6863. [0041] 36 S.Di,S.Fan,F.Jiang,Z.Cong,Antioxidants.2022,11,529. [0042] 37 P.Zhao,J.Chen,N.Ma,J.Chen,X.Qin,C.Chen,F.Yao,L.Yao,L.Jin,Z.Cong,Chem.Sci.2021,12,6307‑6314. [0043] 38 J.Chen,F.Kong,N.Ma,P.Zhao,C.Liu,X.Wang,Z.Cong,ACS Catal.2019,9,7350‑7355. [0044] 39 Y.Jiang,C.Wang,N.Ma,J.Chen,C.Liu,F.Wang,J.Xu,Z.Cong,Catal.Sci.Technol.2020,10,1219‑1223. [0045] 40 Z.Chen,J .Chen ,N.Ma,H.Zhou ,Z.Cong,J .Porphyrins Phthalocyanines.2018,22,2‑6. [0046] 41 N.Ma,W.Fang,C.Liu,X.Qin,X.Wang,L.Jin,B.Wang,Z.Cong,ACS Catal.2021,11,8449‑8455. [0047] 42 X.Zhang,Y.Jiang,Q.Chen,S.Dong,Y.Feng,Z.Cong,S.Shaik,B.Wang,ACS Catal.2021,11,8774‑8785. [0048] 43 Z.Cong,O.Shoji,C.Kasai,N.Kawakami,H.Sugimoto,Y.Shiro,Y.Watanabe,ACS Catal.2015,5,150‑156. [0049] 44 K.Yonemura,S.Ariyasu,J.K.Stanfield,K.Suzuki,H.Onoda,C.Kasai,H.Sugimoto,Y.Aiba,Y.Watanabe,O.Shoji,ACS Catal.2020,10,9136‑9144. [0050] 45 M.Karasawa,J.K.Stanfield,S.Yanagisawa,O.Shoji,Y.Watanabe,Angew.Chem.,Int.Ed.2018,57,12264‑12269. 发明内容[0051] 本发明目的在于提供一种激活酶催化反应的二肽双功能小分子化合物及其应用。 [0052] 为实现上述目的，本发明采用技术方案为： [0053] 一种激活酶催化反应的二肽双功能小分子化合物，双功能小分子含催化基团和锚定基团，二肽双功能小分子化合物以C6为基础骨架分别连接催化基团和锚定基团，催化基团为咪唑，锚定基团为依次相连的两个氨基酸基团取代，即为Im‑C6‑Xaa‑Yaa。 [0054] 所述Im‑C6‑Xaa‑Yaa为 [0055] [0056] 其中，R1为：X aa或Yaa，R2为：X aa或Yaa。 [0057] 所述二肽双功能小分子表示为Im‑C6‑Xaa‑Yaa，其中，Xaa为Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Phe，Tyr或Trp；Yaa为Val，Leu，Ile，Pro，Phe，Tyr或Trp。 [0058] 所述二肽双功能小分子表示为Im‑C6‑Xaa‑Phe时， [0059] Xaa: [0060] [0061] 所述二肽双功能小分子表示为Im‑C6‑Phe‑Yaa时， [0062] Yaa: [0063] 所述二肽双功能小分子表示为Im‑C6‑Xaa‑Trp时， [0064] Xaa: [0065] [0066] 所述二肽双功能小分子表示为Im‑C6‑Xaa‑Tyr时， [0067] Xaa: [0068] [0069] 所述作为锚定基团的含羟基氨基酸中的羟基可被下述基团取代；其中，下述基团为硝基、C1‑C6的烷基、C1‑C6的卤代烷基。 [0070] 所述二肽双功能小分子表示为Im‑C6‑Xaa‑Tyr时，所选Xaa中的羟基可进一步取代，具体为 [0071] Xaa: [0072] 所述二肽双功能小分子表示为Im‑C6‑Tyr‑Yaa时，所选Yaa中的羟基可进一步取代，具体为： [0073] Yaa: [0074] 一种激活酶催化反应的二肽双功能小分子化合物的应用，所述双功能小分子化合物在激活P450酶利用H2O2对底物进行催化反应的应用。 [0075] 一种激活P450酶催化反应的方法，利用所述二肽双功能小分子化合物诱导P450酶的氧化结构域(BMP)实现利用H2O2对不同底物进行催化反应。 [0076] 所述P450酶可为现有技术报道的单点突变也可以是多点组合突变，也开始是突变体重组表达的生长态细胞培养液、重组表达的BMP及其突变体的静息细胞或者重组表达的BMP及其突变体的无细胞提取液或重组表达的BMP及其突变体的纯酶；例如，专利号为ZL 2018 1 0126862.7。 [0077] 具体，将0.5μM激活P450酶与4～10mM底物加入至pH8.0的缓冲溶液中，再添加50‑500μM的所述二肽双功能小分子化合物和20～60mM H2O2在25℃反应30min来实现底物的催化氧化。 [0078] 所述缓冲溶液为PB缓冲液。 [0079] 所述底物为 [0080] [0081] 其中，底物为 其P450酶可为F87A、底物为 其P450酶可为F87A、底物为其P450酶可为F87A或T268V。 [0082] 所述反应后加入乙酸乙酯对反应体系进行萃取分析，反应的TON为10～20000。 [0083] 本发明所具有的优点： [0084] 本发明提供的小分子在Im‑C6‑Phe的基础上在苯丙氨酸的后方或前方加入一个氨基酸合成二肽双功能小分子，进而扩展合成一系列的二肽双功能小分子。这些二肽双功能小分子与酶形成一个稳定的结合构象。这大大降低了双功能小分子的用量，并有效的提高了对底物的催化活性。这一结果摆脱了对高浓度外加小分子的依赖，为该策略的实际应用提高了可能。 [0085] 进一步的说，利用本发明双功能小分子化合物在激活P450酶利用H2O2对底物进行催化反应的应用。反应过程中不需要额外添加辅因子NAD(P)H及还原伴侣蛋白(酶)就能实现催化氧化。 [0086] 所述小分子可诱导的不同类型的催化反应，不仅能实现降低双功能小分子的用量，同时提高了对底物的催化活性。 [0088] 图1为提供的Im‑C6‑Phe与P450BM3的晶体结构图。 [0089] 图2为提供的Im‑C6‑Phe与P450BM3的两种晶体结构图。 [0090] 图3为提供的Im‑C6‑Phe‑Phe与P450BM3的晶体结构图。 [0091] 图4为本发明实施例1‑4，6和对比例1提供的催化图。 [0092] 图5为本发明实施例5提供的催化图。 [0093] 图6为本发明实施例7‑11提供的催化图。 [0094] 图7为本发明实施例12‑23提供的催化图。 [0095] 图8为本发明实施例24‑30提供的催化图。 具体实施方式[0096] 下面结合附图和实施例对本发明做进一步的解释说明。 [0097] 各小分子化合物的制备实施例 [0098] 1)Im‑C6‑COOH的合成 [0099] [0100] Tomko R.；Overberger,C.G.J.Polym.Sci.Pol.Chem.,1985,23,265–277.[0101] Hack,S.； B.； G.；Pabel,J.；Wanner,K.T.Eur.J.Med.Chem.2011,46,1483–4984.Groves,J.T.；Neumann,R.J.Am.Chem.Soc.1989,111,2900‑2909. [0102] 通用方法1(以6‑咪唑基己酸为例): [0103] 将咪唑(2g,28.6mmol)加入到含30mL N,N‑二甲基甲酰胺(DFM)的烧瓶中，室温下搅拌1h后，缓慢滴加6‑溴己酸乙酯(7.3g,31.5mmol)至反应液中，反应24h。 [0105] 将上述产物(5g 23.8mmol)加入到含20mL NaOH(1M)和20mL乙醇的烧瓶中回流，反应结束后冷却至室温，用浓盐酸调节pH至酸性，旋干后用乙醇溶解，过滤除去NaCl，旋干乙醇溶剂得白色固体，再用二氯甲烷洗涤2次，目标产物4.05g(Yield＝93.5％)，1H‑NMR鉴定。 [0106] 6‑(1H‑Imidazol‑1‑yl)Hexanoic acid: [0107] Colorless solid(93.5％yield).1H NMR(600MHz,CD3OD):δ＝7.63(s,1H),7.12(s,1H),6.94(s,1H), [0108] [0109] 4.02(t,J＝7.2Hz,2H),2.15(t,J＝7.5Hz,2H),1.83–1.78(m,2H),1.66–1.56(m,2H),1.35–1.28(m,2H).1.55(m,2H). [0110] 2)二肽双功能小分子的固相合成 [0111] 以制备Im‑C6‑L‑Phe‑L‑Phe为例 [0112] 1.取2‑氯代三苯甲基氯树脂500mg(1.082mmol/g，1eq)溶于3mL二氯甲烷，加入反应器中。震荡30min。 [0113] 2.去除溶剂，二氯甲烷洗涤2～3次，DFM洗涤2～3次。 [0114] 3.加入540mg Fmoc‑L‑苯丙氨酸(1.39mmol，3eq)。加入3mL DFM震荡5min后。加入180mg N,N‑二异丙基乙胺(DIEA,1.39mmol，3eq),震荡5～6h。 [0115] 4.去除溶剂，DFM洗涤2～3次，二氯甲烷洗涤2～3次。 [0116] 5.加二氯甲烷3mL，甲醇0.3mL，180mg DIEA(1.39mmol，3eq)。震荡1h.[0117] 6.去除溶剂，二氯甲烷洗涤2～3次，DFM洗涤2～3次。 [0118] 7.加入3mL(哌啶:DFM＝1:3),震荡20～30min。 [0119] 8.去除溶剂，二氯甲烷洗涤2～3次，DFM洗涤2～3次。 [0120] 9.加入540mg Fmoc‑L‑苯丙氨酸(1.39mmol，3eq)，552mg 3‑二乙氧基磷酰基‑1,2,3‑苯唑4(3H)‑酮(DEPBT，1.39mmol，3eq)。加入3mL DFM震荡5min后。加入180mg DIEA(1.39mmol，3eq),震荡5～6h. [0121] 10.去除溶剂，二氯甲烷洗涤2～3次，DFM洗涤2～3次。 [0122] 11.加入3mL(哌啶:DFM＝1:3),震荡20～30min。 [0123] 12.去除溶剂，二氯甲烷洗涤2～3次，DFM洗涤2～3次。 [0124] 13.加入300mg Im‑C5‑COOH(1.39mmol，3eq)，552mg DEPBT(1.39mmol，3eq)。加入3mL DFM震荡5min。加入180mg DIEA(1.39mmol，3eq),震荡24h. [0125] 14.去除溶剂，DFM洗涤2～3次，二氯甲烷洗涤2～3次。 [0126] 15.加二氯甲烷3mL，三氟乙酸300μL.震荡2h. [0127] 16.收取溶剂，二氯甲烷洗涤2～3次，甲醇洗涤2～3次。 [0128] 旋干溶剂，得到产物。1H NMR鉴定。 [0129] Im‑C6‑Phe‑Phe:1H‑NMR(600MHz,DMSO‑d6)δ8.13‑8.11(d,J＝12Hz,1H),7.61‑7.60(d,J＝6Hz,1H),7.58(s,1H),7.23‑7.12(m,11H),6.86(s,1H),4.40‑4.36(m,1H),4.10‑4.07(m,1H),3.85‑3.82(t,J＝18Hz,2H),3.13‑3.10(m,1H),3.05‑3.02(m,1H),2.98‑2.95(m,1H),2.68‑2.63(m,1H),1.98‑1.95(m,2H),1.59‑1.55(m,2H),1.37‑1.31(m,2H),1.02‑ 0.98(m,2H). [0130] Im‑C6‑Phe‑Tyr:1H‑NMR(600MHz,DMSO‑d6)δ8.99(s,1H),8.07‑8.06(d,J＝6Hz,1H),7.88‑7.86(t,J＝12Hz,1H),7.58(s,1H),7.23‑7.12(m,11H),7.66(s,1H),7.59(s, 1H),7.16‑7.14(m,4H),7.10‑7.07(m,1H),6.93‑6.92(d,J＝6Hz,2H),6.57‑6.55(m,2H), 4.48‑4.45(m,1H),4.29‑4.26(m,1H),4.01‑3.99(t,J＝12Hz,2H),2.92‑2.85(m,2H),2.74‑ 2.71(m,1H),2.61‑2.56(m,1H),1.92‑1.90(t,J＝12Hz,2H),1.63‑1.60(m,2H),1.30‑1.27(m,2H),0.97‑0.91(m,2H). [0131] Im‑C6‑Val‑Phe:1H‑NMR(600MHz,DMSO‑d6)δ9.11(s,1H),8.21‑8.19(d,J＝12Hz,1H),7.77(s,1H),7.72‑7.70(d,J＝12Hz,1H),7.69(s,1H),7.26‑7.19(m,5H),4.46‑4.40(m,1H),4.20‑4.12(m,3H),3.06‑3.00(m,1H),2.91‑2.87(m,1H),2.18‑2.12(m,1H),2.10‑ 2.07(m,1H),1.93‑1.90(m,1H),1.81‑1.77(m,2H),1.56‑1.46(m,2H),1.23‑1.17(m,2H), 0.81‑0.77(m,6H). [0132] Im‑C6‑Tyr‑Trp:1H‑NMR(600MHz,DMSO‑d6)δ10.79(s,1H),8.97(s,1H),8.09‑8.08(d,J＝6Hz,1H),7.80‑7.79(t,J＝6Hz,1H),7.63(s,1H),7.58(s,1H),7.45‑7.44(t,J＝6Hz,1H),7.07(s,1H),6.99‑6.96(t,J＝18Hz,1H),6.94‑6.92(d,J＝12Hz,2H),6.91‑6.88(t,J＝18Hz,1H),7.80‑7.79(t,J＝6Hz,1H),6.54‑6.52(d,J＝12Hz,2H),4.44‑4.38(m, 1H),3.99‑3.97(t,J＝12Hz,2H),3.13‑3.09(m,1H),3.01‑2.97(m,1H),2.83‑2.78(m,1H), 2.53‑2.47(m,1H),1.92‑1.90(t,J＝12Hz,2H),1.63‑1.58(m,2H),1.31‑1.26(m,2H),0.98‑ 0.91(m,2H). [0133] Im‑C6‑Trp‑Tyr:1H‑NMR(600MHz,DMSO‑d6)δ10.70(s,1H),8.96(s,1H),8.03‑8.02(d,J＝6Hz,1H),7.81‑7.80(t,J＝6Hz,1H),7.62(s,1H),7.57(s,1H),7.51‑7.50(t,J＝6Hz,1H),7.23‑7.22(t,J＝6Hz,1H),7.01(s,1H),6.97‑6.95(t,J＝12Hz,1H),6.93‑6.91(d,J＝12Hz,2H),6.89‑6.86(t,J＝18Hz,1H),6.57‑6.55(d,J＝12Hz,2H),4.51‑4.48(m, 1H),4.31‑4.27(m,1H),3.98‑3.95(t,J＝18Hz,1H),3.02‑2.98(m,1H),2.88‑2.85(m,1H), 2.80‑2.71(m,1H),1.96‑1.88(m,2H),1.63‑1.58(m,2H),1.32‑1.27(m,2H),1.00‑0.92(m, 2H). [0134] Im‑C6‑Ile‑Tyr:1H‑NMR(600MHz,DMSO‑d6)δ9.02(s,1H),8.03‑8.02(d,J＝6Hz,1H),7.68(s,1H),7.65‑7.63(d,J＝12Hz,1H),7.60(s,1H),6.92‑6.91(d,J＝6Hz,1H), 6.54‑6.53(d,J＝6Hz,1H),4.26‑4.22(m,1H),4.14‑4.09(m,1H),4.07‑4.04(t,J＝18Hz, 2H),2.84‑2.81(m,1H),2.71‑2.65(m,1H),2.08‑1.98(m,1H),1.73‑1.68(m,1H),1.61‑1.57(m,1H),1.45‑1.39(m,2H),1.30‑1.24(m,1H),1.14‑1.09(m,2H),0.97‑0.91(m,1H),0.70‑ 0.66(m,2H). [0135] Im‑C6‑Tyr‑Tyr:1H‑NMR(600MHz,DMSO‑d6)δ9.07(s,1H),8.10‑8.09(d,J＝6Hz,1H),7.89‑7.88(d,J＝6Hz,1H),7.73(s,1H),7.68(s,1H),7.02‑7.00(m,4H),6.65‑6.61(m, 4H),4.48‑4.44(m,1H),4.36‑4.33(m,1H),4.10‑4.07(t,J＝18Hz,2H),2.96‑2.92(m,1H), 2.89‑2.86(m,1H),2.82‑2.78(m,1H),2.57‑2.53(m,1H),2.01‑1.99(t,J＝12Hz,2H),1.73‑ 1.68(m,2H),1.41‑1.36(m,2H),1.07‑1.01(m,2H). [0136] Im‑C6‑Phe(4CH3)‑Tyr:1H‑NMR(600MHz,DMSO‑d6)δ9.08(s,1H),8.13‑8.12(d,J＝6Hz,1H),7.93‑7.92(d,J＝6Hz,1H),7.74(s,1H),7.68(s,1H),7.11‑7.10(d,J＝6Hz,1H), 7.04‑7.00(m,4H),6.65‑6.64(d,J＝6Hz,2H),4.52‑4.49(m,1H),4.37‑4.33(m,1H),4.10‑ 4.08(t,J＝12Hz,2H),2.95‑2.93(m,2H),2.82‑2.79(m,1H),2.65‑2.61(m,1H),2.23(s, 3H),2.01‑1.99(t,J＝12Hz,2H),1.72‑1.69(m,2H),1.39‑1.37(m,2H),1.06‑1.03(m,2H).[0137] Im‑C6‑Phe(4CF3)‑Tyr:1H‑NMR(600MHz,DMSO‑d6)δ9.08(s,1H),8.24‑8.23(d,J＝ 6Hz,1H),8.03‑8.02(d,J＝6Hz,1H),7.73(s,1H),7.68(s,1H),7.61‑7.59(d,J＝6Hz,2H), 7.46‑7.45(d,J＝6Hz,2H),7.02‑7.01(d,J＝6Hz,2H),6.66‑6.65(d,J＝6Hz,2H),4.64‑ 4.60(m,1H),4.39‑4.35(m,1H),4.10‑4.08(t,J＝12Hz,2H),3.09‑3.06(m,1H),2.97‑2.94(m,1H),2.83‑2.79(m,1H),2.79‑2.75(m,1H),2.02‑1.97(m,2H),1.72‑1.67(m,2H),1.38‑ 1.33(m,2H),1.08‑0.98(m,2H). [0138] Im‑C6‑Phe(4NO2)‑Tyr:1H‑NMR(600MHz,DMSO‑d6)δ9.07(s,1H),8.26‑8.25(d,J＝6Hz,1H),8.13‑8.12(d,J＝6Hz,1H),8.07‑8.05(d,J＝12Hz,1H),7.73(s,1H),7.68(s,1H), 7.52‑7.50(d,J＝12Hz,2H),7.02‑7.01(d,J＝6Hz,2H),6.66‑6.64(d,J＝6Hz,2H),4.65‑ 4.63(m,1H),4.37‑4.35(m,1H),4.10‑4.07(t,J＝18Hz,2H),3.13‑3.10(m,1H),2.97‑2.94(m,1H),2.84‑2.79(m,2H),2.01‑1.99(t,J＝12Hz,2H),1.72‑1.67(m,2H),1.39‑1.34(m, 2H),1.06‑1.01(m,2H). [0139] Im‑C6‑Tyr‑Phe(4CH3):1H‑NMR(600MHz,DMSO‑d6)δ9.10(s,1H),8.16(s,1H),7.89(s,1H),7.75(s,1H),7.69(s,1H),7.12‑7.08(d,J＝24Hz,4H),7.02(s,1H),6.63(s,2H),4.47(s,1H),4.41(s,1H),4.10(s,2H),3.02(s,1H),2.89(s,2H),2.57‑2.55(d,J＝12Hz, 1H),2.26(s,3H),2.01(s,2H),1.72(s,2H),1.39(s,2H),1.05(s,2H). [0140] Im‑C6‑Phe(4CF3)‑Tyr:1H‑NMR(600MHz,DMSO‑d6)δ9.08(s,1H),8.29‑8.27(d,J＝12Hz,1H),7.88‑7.87(d,J＝6Hz,1H),7.74(s,1H),7.68(s,1H),7.62‑7.60(d,J＝6Hz,2H), 7.46‑7.44(d,J＝6Hz,2H),7.01‑7.00(d,J＝6Hz,2H),6.63‑6.61(d,J＝6Hz,2H),4.51‑ 4.47(m,1H),4.45‑4.43(m,1H),4.10‑4.08(t,J＝12Hz,2H),3.19‑3.16(m,1H),3.03‑2.99(m,1H),2.85‑2.82(m,1H),2.57‑2.51(m,1H),2.00‑1.97(m,2H),1.73‑1.69(m,2H),1.39‑ 1.36(m,2H),1.06‑1.00(m,2H). [0141] 即，可参见 [0142] L.Hu,S.Xu,J.Zhao,et al.J.Am.Chem.Soc.2016,138,13135‑13138. [0143] M.K.Yonemura,S.Ariyasu,O.Shoji,et al.ACS Catal.2020,10,9136‑9144.[0144] 按照上述记载的制备合成过程，通过其他氨基酸将苯丙氨酸分别取代即可合成得到本发明其它小分子化合物。 [0145] 所述下述实例中P450酶(F87A)为参见专利：ZL 2018 1 0126862.7。 [0146] 采用上述合成的小分子化合物进行激活P450酶(F87A)催化反应，具体为： [0147] 实施例1 [0148] F87A利用 (小分子为Im‑C6‑Phe‑Phe)催化的环氧化反应。 [0149] 反应体系如下：将4mM (10％MeOH助溶)，0.5μM酶F87A，50μM的小分子，20mM H2O2加入到终体积为1mL的pH8.0的PBS (100mM)中，25℃水浴反应30min后，用1mL的EA萃取，然后干燥有机相添加1mM的二苯甲酮进行GC测试。同时以未添加及添加Im‑C6‑Phe(500μM)小分子作为对照，反应结果如下： [0150] 表1 [0151] [0152] 由图4和表1可见 的加入对 的环氧化反应活性高于Im‑C6‑Phe。 [0153] 实施例2 [0154] F87A利用 (小分子为Im‑C6‑Tyr‑Phe)催化的环氧化反应。 [0155] 反应体系如下：将4mM (10％MeOH助溶)，0.5μM酶F87A，50μM的小分子，20mM H2O2加入到终体积为1mL的pH8.0的PBS (100mM)中，25℃水浴反应30min后，用1mL的EA萃取，然后干燥有机相添加1mM的二苯甲酮进行GC测试。同时以未添加及添加Im‑C6‑Phe(500μM)小分子作为对照，反应结果如下： [0156] 表2 [0157] [0158] [0159] 由图4和表2可见 的加入对 的环氧化反应活性高于Im‑C6‑Phe。 [0160] 实施例3 [0161] F87A利用 (小分子为Im‑C6‑Ile‑Trp)催化的环氧化反应。 [0162] 反应体系如下：将4mM (10％MeOH助溶)，0.5μM酶F87A，50μM的小分子，20mM H2O2加入到终体积为1mL的pH8.0的PBS (100mM)中，25℃水浴反应30min后，用1mL的EA萃取，然后干燥有机相添加1mM的二苯甲酮进行GC测试。同时以未添加小分子作为对照，反应结果如下： [0163] 表3 [0164] [0165] 由图4和表3可见 的加入对 的环氧化反应活性显著提高。 [0166] 实施例4 [0167] F87A利用 (小分子为Im‑C6‑Ile‑Tyr)催化的环氧化反应。 [0168] 反应体系如下：将4mM (10％MeOH助溶)，0.5μM酶F87A，50μM的小分子，20mM H2O2加入到终体积为1mL的pH8.0的PBS (100mM)中，25℃水浴反应30min后，用1mL的EA萃取，然后干燥有机相添加1mM的二苯甲酮进行GC测试。同时以未添加小分子作为对照，反应结果如下： [0169] 表4 [0170] [0171] 由图4和表4可见 的加入对 的环氧化反应活性显著提高。 [0172] 实施例5 [0173] F87A利用 (小分子为Im‑C6‑Tyr‑Tyr)催化的环氧化反应。 [0174] 反应体系如下：将4mM (10％MeOH助溶)，0.5μM酶F87A，50μM的小分子，20mM H2O2加入到终体积为1mL的pH8.0的PBS (100mM)中，25℃水浴反应30min后，用1mL的EA萃取，然后干燥有机相添加1mM的二苯甲酮进行GC测试。同时以未添加、添加 (小分子为Im‑C3‑Gly‑ Tyr‑Tyr)、 (小分子为Im‑C3‑Ala‑Tyr‑Tyr)、 (小分子为Im‑C3‑Val‑Tyr‑Tyr)、 (小分子为Im‑C3‑Leu‑Tyr‑Tyr)、 (小分子为Im‑C3‑Ile‑Tyr‑Tyr)、 (小分子为Im‑C6‑Tyr‑Tyr‑Gly)、 (小分子为Im‑C6‑Tyr‑Tyr‑Ala)、 (小分子为Im‑C6‑Tyr‑Tyr‑Vla)、 (小分子为Im‑C6‑Tyr‑Tyr‑Leu)、 (小分子为Im‑C6‑Tyr‑Tyr‑Ile)作为对照，反应结果如 下： [0175] 表5 [0176] [0177] [0178] 由图5和表5可见 的加入对 的环氧化反应活性显著提高，但锚定基团为3个氨基酸时效果却不明显，由此可见锚定基团的选择并不是简单随意组合。同时，上述Im‑C3‑Gly‑Tyr‑Tyr的获得依照Im‑C6‑Tyr‑Tyr为基础，在Im‑C3‑COOH与NH2‑Tyr‑Tyr的中间连接一个Gly即可获得。上述Im‑C6‑Tyr‑Tyr‑Gly的获得依照Im‑C6‑Tyr‑Tyr为基础，在Im‑C6‑Tyr‑Tyr‑COOH的末端连接一个Gly即可获得。 [0179] 实施例6 [0180] F87A利用 (小分子为Im‑C6‑Trp‑Tyr)催化的环氧化反应。 [0181] 反应体系如下：将4mM (10％MeOH助溶)，0.5μM酶F87A，50μM的小分子，20mM H2O2加入到终体积为1mL的pH8.0的PBS (100mM)中，25℃水浴反应30min后，用1mL的EA萃取，然后干燥有机相添加1mM的二苯甲酮进行GC测试。同时以未添加及添加Im‑C6‑Phe(500μM)小分子作为对照，反应结果如下： [0182] 表6 [0183] [0184] 由图4和表6可见 的加入对 的环氧化反应活性显著提高。 [0185] 实施例7 [0186] F87A利用 (小分子为Im‑C6‑Phe(4NO2)‑Tyr)催化的环氧化反应。 [0187] 反应体系如下：将4mM (10％MeOH助溶)，0.5μM酶F87A，50μM的小分子，20mM H2O2加入到终体积为1mL的pH8.0的PBS (100mM)中，25℃水浴反应30min后，用1mL的EA萃取，然后干燥有机相添加1mM的二苯甲酮进行GC测试。同时以未添加及添加Im‑C6‑Phe(500μM)小分子作为对照，反应结果如下： [0188] 表7 [0189] [0190] 由图6和表7可见 的加入对 的环氧化反应活性高于Im‑C6‑Phe。 [0191] 实施例8 [0192] F87A利用 (小分子为Im‑C6‑Phe(4CH3)‑Tyr)催化的环氧化反应。 [0193] 反应体系如下：将4mM (10％MeOH助溶)，0.5μM酶F87A，50μM的小分子，20mM H2O2加入到终体积为1mL的pH8.0的PBS (100mM)中，25℃水浴反应30min后，用1mL的EA萃取，然后干燥有机相添加1mM的二苯甲酮进行GC测试。同时以未添加及添加Im‑C6‑Phe(500μM)小分子作为对照，反应结果如下： [0194] 表8 [0195] [0196] 由图6和表8可见 的加入对 的环氧化反应活性高于Im‑C6‑Phe。 [0197] 实施例9 [0198] F87A利用 (小分子为Im‑C6‑Tyr‑Phe(4CH3))催化的环氧化反应。 [0199] 反应体系如下：将4mM (10％MeOH助溶)，0.5μM酶F87A，50μM的小分子，20mM H2O2加入到终体积为1mL的pH8.0的PBS (100mM)中，25℃水浴反应30min后，用1mL的EA萃取，然后干燥有机相添加1mM的二苯甲酮进行GC测试。同时以未添加及添加Im‑C6‑Phe(500μM)小分子作为对照，反应结果如下： [0200] 表9 [0201] [0202] 由图6和表9可见 的加入对 的环氧化反应活性高于Im‑C6‑Phe。 [0203] 实施例10 [0204] F87A利用 (小分子为Im‑C6‑Phe(4CF3)‑Tyr)催化的环氧化反应。 [0205] 反应体系如下：将4mM (10％MeOH助溶)，0.5μM酶F87A，50μM的小分子，20mM H2O2加入到终体积为1mL的pH8.0的PBS (100mM)中，25℃水浴反应30min后，用1mL的EA萃取，然后干燥有机相添加1mM的二苯甲酮进行GC测试。同时以未添加及添加Im‑C6‑Phe(500μM)小分子作为对照，反应结果如下： [0206] 表10 [0207] [0208] 由图6和表10可见 的加入对 的环氧化反应活性高于Im‑C6‑Phe。 [0209] 实施例11 [0210] F87A利用 (小分子为Im‑C6‑Tyr‑Phe(4CF3))催化的环氧化反应。 [0211] 反应体系如下：将4mM (10％MeOH助溶)，0.5μM酶F87A，50μM的小分子，20mM H2O2加入到终体积为1mL的pH8.0的PBS (100mM)中，25℃水浴反应30min后，用1mL的EA萃取，然后干燥有机相添加1mM的二苯甲酮进行GC测试。同时以未添加及添加Im‑C6‑Phe(500μM)小分子作为对照，反应结果如下： [0212] 表11 [0213] [0214] 由图6和表11可见 的加入对 的环氧化反应活性高于Im‑C6‑Phe。 [0215] 实施例12 [0216] F87A利用 (小分子为Im‑C6‑Ile‑Phe)催化的亚磺化反应。 [0217] 反应体系如下：将4mM (10％MeOH助溶)，0.5μM酶F87A，50μM的小分子，20mM H2O2加入到终体积为1mL的pH8.0的PBS (100mM)中，25℃水浴反应30min后，用1mL的EA萃取，然后干燥有机相添加1mM的二苯甲酮进行GC测试。反应结果如下：。GC条件：DB‑5柱；进样口温度280℃；FID检测器温度300℃；程序升温条件为100℃保留1min，15℃/min升至200℃不保留，60℃/min升至280℃保留4min；总分析时间为13min。同时以未添加及添加Im‑C6‑Phe(500μM)小分子作为对照，反应结果如下： [0218] 表12 [0219] [0220] 由图7和表12可见 的加入对 的亚磺化反应活性高于Im‑C6‑Phe。 [0221] 实施例13 [0222] F87A利用 (小分子为Im‑C6‑Phe‑Phe)催化的亚磺化反应。 [0223] 反应体系如下：将4mM (10％MeOH助溶)，0.5μM酶F87A，50μM的小分子，20mM H2O2加入到终体积为1mL的pH8.0的PBS (100mM)中，25℃水浴反应30min后，用1mL的EA萃取，然后干燥有机相添加1mM的二苯甲酮进行GC测试。同时以未添加及添加Im‑C6‑Phe(500μM)小分子作为对照，反应结果如下： [0224] 表13 [0225] [0226] 由图7和表13可见 的加入对 的亚磺化反应活性高于Im‑C6‑Phe。 [0227] 实施例14 [0228] F87A利用 (小分子为Im‑C6‑Tyr‑Phe)催化的亚磺化反应。 [0229] 反应体系如下：将4mM (10％MeOH助溶)，0.5μM酶F87A，50μM的小分子，20mM H2O2加入到终体积为1mL的pH8.0的PBS (100mM)中，25℃水浴反应30min后，用1mL的EA萃取，然后干燥有机相添加1mM的二苯甲酮进行GC测试。同时以未添加及添加Im‑C6‑Phe(500μM)小分子作为对照，反应结果如下： [0230] 表14 [0231] [0232] 由图7和表14可见 的加入对 的亚磺化反应活性高于Im‑C6‑Phe。 [0233] 实施例15 [0234] F87A利用 (小分子为Im‑C6‑Phe‑Ile)催化的亚磺化反应。 [0235] 反应体系如下：将4mM (10％MeOH助溶)，0.5μM酶F87A，50μM的小分子，20mM H2O2加入到终体积为1mL的pH8.0的PBS (100mM)中，25℃水浴反应30min后，用1mL的EA萃取，然后干燥有机相添加1mM的二苯甲酮进行GC测试。同时以未添加及添加Im‑C6‑Phe(500μM)小分子作为对照，反应结果如下： [0236] 表15 [0237] [0238] 由图7和表15可见 的加入对 的亚磺化反应活性高于Im‑C6‑Phe。 [0239] 实施例16 [0240] F87A利用 (小分子为Im‑C6‑Ile‑Trp)催化的亚磺化反应。 [0241] 反应体系如下：将4mM (10％MeOH助溶)，0.5μM酶F87A，50μM的小分子，20mM H2O2加入到终体积为1mL的pH8.0的PBS (100mM)中，25℃水浴反应30min后，用1mL的EA萃取，然后干燥有机相添加1mM的二苯甲酮进行GC测试。同时以未添加及添加Im‑C6‑Phe(500μM)小分子作为对照，反应结果如下： [0242] 表16 [0243] [0244] 由图7和表16可见 的加入对 的亚磺化反应活性高于Im‑C6‑Phe。 [0245] 实施例17 [0246] F87A利用 (小分子为Im‑C6‑Tyr‑Trp)催化的亚磺化反应。 [0247] 反应体系如下：将4mM (10％MeOH助溶)，0.5μM酶F87A，50μM的小分子，20mM H2O2加入到终体积为1mL的pH8.0的PBS (100mM)中，25℃水浴反应30min后，用1mL的EA萃取，然后干燥有机相添加1mM的二苯甲酮进行GC测试。同时以未添加及添加Im‑C6‑Phe(500μM)小分子作为对照，反应结果如下： [0248] 表17 [0249] [0250] 由图7和表17可见 的加入对 的亚磺化反应活性高于Im‑C6‑Phe。 [0251] 实施例18 [0252] F87A利用 (小分子为Im‑C6‑Ile‑Tyr)催化的亚磺化反应。 [0253] 反应体系如下：将4mM (10％MeOH助溶)，0.5μM酶F87A，50μM的小分子，20mM H2O2加入到终体积为1mL的pH8.0的PBS (100mM)中，25℃水浴反应30min后，用1mL的EA萃取，然后干燥有机相添加1mM的二苯甲酮进行GC测试。同时以未添加及添加Im‑C6‑Phe(500μM)小分子作为对照，反应结果如下： [0254] 表18 [0255] [0256] 由图7和表18可见 的加入对 的亚磺化反应活性高于Im‑C6‑Phe。 [0257] 实施例19 [0258] F87A利用 (小分子为Im‑C6‑Ile‑Tyr)催化的亚磺化反应。 [0259] 反应体系如下：将4mM (10％MeOH助溶)，0.5μM酶F87A，50μM的小分子，20mM H2O2加入到终体积为1mL的pH8.0的PBS (100mM)中，25℃水浴反应30min后，用1mL的EA萃取，然后干燥有机相添加1mM的二苯甲酮进行GC测试。同时以未添加小分子作为对照，反应结果如下： [0260] 表19 [0261] [0262] 由图7和表19可见 的加入对 的亚磺化反应活性高于Im‑C6‑Phe。 [0263] 实施例20 [0264] F87A利用 (小分子为Im‑C6‑Trp‑Tyr)催化的亚磺化反应。 [0265] 反应体系如下：将4mM (10％MeOH助溶)，0.5μM酶F87A，50μM的小分子，20mM H2O2加入到终体积为1mL的pH8.0的PBS (100mM)中，25℃水浴反应30min后，用1mL的EA萃取，然后干燥有机相添加1mM的二苯甲酮进行GC测试。同时以未添加及添加Im‑C6‑Phe(500μM)小分子作为对照，反应结果如下： [0266] 表20 [0267] [0268] 由图7和表20可见 的加入对 的亚磺化反应活性高于Im‑C6‑Phe。 [0269] 实施例21 [0270] F87A利用 (小分子为Im‑C6‑Phe(4NO2)‑Tyr)催化的亚磺化反应。 [0271] 反应体系如下：将4mM (10％MeOH助溶)，0.5μM酶F87A，50μM的小分子，20mM H2O2加入到终体积为1mL的pH8.0的PBS (100mM)中，25℃水浴反应30min后，用1mL的EA萃取，然后干燥有机相添加1mM的二苯甲酮进行GC测试。同时以未添加及添加Im‑C6‑Phe(500μM)小分子作为对照，反应结果如下： [0272] 表21 [0273] [0274] 由图7和表21可见 的加入对 的亚磺化反应活性高于Im‑C6‑Phe。 [0275] 实施例22 [0276] F87A利用 (小分子为Im‑C6‑Phe(4CH3)‑Tyr)催化的亚磺化反应。 [0277] 反应体系如下：将4mM (10％MeOH助溶)，0.5μM酶F87A，50μM的小分子，20mM H2O2加入到终体积为1mL的pH8.0的PBS (100mM)中，25℃水浴反应30min后，用1mL的EA萃取，然后干燥有机相添加1mM的二苯甲酮进行GC测试。同时以未添加及添加Im‑C6‑Phe(500μM)小分子作为对照，反应结果如下： [0278] 表22 [0279] [0280] 由图7和表22可见 的加入对 的亚磺化反应活性高于Im‑C6‑Phe。 [0281] 实施例23 [0282] F87A利用 (小分子为Im‑C6‑Phe(4CF3)‑Tyr)催化的亚磺化反应。 [0283] 反应体系如下：将4mM (10％MeOH助溶)，0.5μM酶F87A，50μM的小分子，20mM H2O2加入到终体积为1mL的pH8.0的PBS (100mM)中，25℃水浴反应30min后，用1mL的EA萃取，然后干燥有机相添加1mM的二苯甲酮进行GC测试。同时以未添加及添加Im‑C6‑Phe(500μM)小分子作为对照，反应结果如下： [0284] 表23 [0285] [0286] 由图7和表23可见 的加入对 的亚磺化反应活性高于Im‑C6‑Phe。 [0287] 实施例24 [0288] F87V/T268V利用 (小分子为Im‑C6‑Phe‑Phe)催化 的羟化反应。 [0289] 反应体系如下：将10mM (2％DMSO助溶)，0.5μM酶F87V/T268V，1mM的小分子，60mM H2O2加入到终体积为1mL的100mMPBS(pH＝ 8.0)buffer中，25℃水浴反应30min后，用乙酸乙酯(1mL)萃取，取450μL的有机相加入50μL二苯甲酮作为内标(终浓度为1mM)，然后进行GC测定。同时以未添加及添加Im‑C6‑Phe(500μM)小分子作为对照，反应结果如下： [0290] 表24 [0291] [0292] 由图8和表24可见 的加入对 的羟化反应活性高于Im‑C6‑Phe。 [0293] 实施例25 [0294] F87V/T268V利用 (小分子为Im‑C6‑Tyr‑Phe)催化 的羟化反应。 [0295] 反应体系如下：将10mM (2％DMSO助溶)，0.5μM酶F87V/T268V，1mM的小分子，60mM H2O2加入到终体积为1mL的100mMPBS(pH＝ 8.0)buffer中，25℃水浴反应30min后，用乙酸乙酯(1mL)萃取，取450μL的有机相加入50μL二苯甲酮作为内标(终浓度为1mM)，然后进行GC测定。同时以未添加及添加Im‑C6‑Phe(500μM)小分子作为对照，反应结果如下： [0296] 表25 [0297] [0298] 由图8和表25可见 的加入对 的羟化反应活性高于Im‑C6‑Phe。 [0299] 实施例26 [0300] F87V/T268V利用 (小分子为Im‑C6‑Ile‑Trp)催化的羟化反应。 [0301] 反应体系如下：将10mM (2％DMSO助溶)，0.5μM酶F87V/T268V，1mM的小分子，60mM H2O2加入到终体积为1mL的100mMPBS(pH＝ 8.0)buffer中，25℃水浴反应30min后，用乙酸乙酯(1mL)萃取，取450μL的有机相加入50μL二苯甲酮作为内标(终浓度为1mM)，然后进行GC测定。同时以未添加小分子作为对照，反应结果如下： [0302] 表26 [0303] [0304] 由图8和表26可见 的加入对 的羟化反应活性显著提高。 [0305] 实施例27 [0306] F87V/T268V利用 (小分子为Im‑C6‑Tyr‑Trp)催化的羟化反应。 [0307] 反应体系如下：将10mM (2％DMSO助溶)，0.5μM酶F87V/T268V，1mM的小分子，60mM H2O2加入到终体积为1mL的100mMPBS(pH＝ 8.0)buffer中，25℃水浴反应30min后，用乙酸乙酯(1mL)萃取，取450μL的有机相加入50μL二苯甲酮作为内标(终浓度为1mM)，然后进行GC测定。同时以未添加小分子作为对照，反应结果如下： [0308] 表27 [0309] [0310] 由图8和表27可见 的加入对 的羟化反应活性显著提高。 [0311] 实施例28 [0312] F87V/T268V利用 (小分子为Im‑C6‑Tyr‑Tyr)催化 的羟化反应。 [0313] 反应体系如下：将10mM (2％DMSO助溶)，0.5μM酶F87V/T268V，1mM的小分子，60mM H2O2加入到终体积为1mL的100mMPBS(pH＝ 8.0)buffer中，25℃水浴反应30min后，用乙酸乙酯(1mL)萃取，取450μL的有机相加入50μL二苯甲酮作为内标(终浓度为1mM)，然后进行GC测定。同时以未添加小分子作为对照，反应结果如下： [0314] 表28 [0315] [0316] 由图8和表28可见 的加入对 的羟化反应活性显著提高。 [0317] 实施例29 [0318] F87V/T268V利用 (小分子为Im‑C6‑Trp‑Tyr)催化 的羟化反应。 [0319] 反应体系如下：将10mM (2％DMSO助溶)，0.5μM酶F87V/T268V，1mM的小分子，60mM H2O2加入到终体积为1mL的100mMPBS(pH＝ 8.0)buffer中，25℃水浴反应30min后，用乙酸乙酯(1mL)萃取，取450μL的有机相加入50μL二苯甲酮作为内标(终浓度为1mM)，然后进行GC测定。同时以未添加小分子作为对照，反应结果如下： [0320] 表29 [0321] [0322] 由图8和表29可见 的加入对 的羟化反应活显著提高。 [0323] 实施例30 [0324] F87V/T268V利用 (小分子为Im‑C6‑Phe(4CH3)‑Tyr)催化 的羟化反应。 [0325] 反应体系如下：将10mM (2％DMSO助溶)，0.5μM酶F87V/T268V，1mM的小分子，60mM H2O2加入到终体积为1mL的100mMPBS(pH＝ 8.0)buffer中，25℃水浴反应30min后，用乙酸乙酯(1mL)萃取，取450μL的有机相加入50μL二苯甲酮作为内标(终浓度为1mM)，然后进行GC测定。同时以未添加及添加Im‑C6‑Phe(500μM)小分子作为对照，反应结果如下： [0326] 表30 [0327] [0328] 由图8和表30可见 的加入对 的羟化反应活性高于Im‑C6‑Phe。 [0329] 对比例1 [0330] F87A利用 (小分子化合物为Im‑C6‑Val‑Phe)催化 的环氧化反应： [0331] 反应体系如下：将4mM (10％MeOH助溶)，0.5μM酶F87A，50μM的小分子，20mM H2O2加入到终体积为1mL的pH8.0的PBS (100mM)中，25℃水浴反应30min后，用1mL的EA萃取，然后干燥有机相添加1mM的二苯甲酮进行GC测试。同时以未添加及添加Im‑C6‑Phe(500μM)小分子作为对照，反应结果如下： [0332] 表31 [0333] [0334] 由图4和表31可见 的加入对 的环氧化反应活性低于Im‑C6‑Phe，由此可见锚定基团的选择不是随意结合，单个起到作用的氨基酸与其他氨基酸的组合不一定可以呈现出较好的作用，这需要两个氨基酸共同协同发挥作用。 [0335] 综上可述，在对苯乙烯环氧化反应中，二肽双功能小分子在浓度为单氨基酸双功能小分子的1/10时便表现出较为优异的催化活性，这大大的降低了双功能小分子的用量。此外，这种策略也具有普遍适用性，在针对苯甲硫醚磺化和乙基苯羟基化的反应中，也表现出相同的优异性能。这为此策略在实际中的应用提供了更大的可能。 |
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