[0001] 本发明属于多肽衍生物制备技术领域，具体涉及一种亮丙瑞林衍生物及其制备方法。

[0002] 亮丙瑞林(Leuprorelin)是一种强效的促性腺激素释放激素(GnRH)激动药，是视丘下部所产生的黄体生产激素释放激素(LHRH)的高活性类似物，为合成的两端封闭的水溶性九肽。亮丙瑞林可以刺激垂体分泌促性腺激素，诱发生殖器官生产类固醇，长期大量使用会使LHRH受体脱敏，抑制促性腺激素的分泌以及搞完或卵巢甾类的生产，临床上用来治疗或缓解多种性激素依赖性疾病，如子宫肌瘤、子宫内膜异位症、前列腺癌、中枢性性早熟等。

[0003] 亮丙瑞林用于前列腺癌在首次给药的初期，可促进LH(luteinizing hormone，黄体生成素)、T(testos‑terone，睾酮)的分泌，从而抑制前列腺肿瘤的增殖。而醋酸亮丙瑞林可以单独作为治疗前列腺癌的应用，也可与放射疗法配合使用以增加放射性疗法的治疗效果。目前，鲜少有亮丙瑞林衍生物的相关报道。

[0004] 本发明的目的在于提供一种对子宫内膜异位症具有优良治疗效果的亮丙瑞林衍生物，同时其能明显改善衰老的卵巢功能以及对卵巢肿瘤具有较好的治疗效果。

[0005] 本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：一种亮丙瑞林衍生物的制备方法，包括以下步骤：
将带有保护基团的亮丙瑞林与含羧基的化合物溶于溶剂中，然后加入催化剂进行衍生化反应，反应结束后，层析，浓缩，脱保护，过滤，层析纯化，浓缩，干燥，得到亮丙瑞林衍生物粗产物，纯化，得到亮丙瑞林衍生物；
含羧基的化合物为12‑O‑甲基鼠尾草酸、松苓新酸中的至少一种。

[0006] 本发明采用亮丙瑞林与12‑O‑甲基鼠尾草酸、松苓新酸反应制得亮丙瑞林衍生物，该亮丙瑞林衍生物对大鼠子宫内膜异位症的治疗效果，同时能够降低患有子宫内膜异位症的大鼠血清中CA125浓度，进而使亮丙瑞林衍生物对大鼠子宫内膜异位症具有有效的治疗效果；除此之外，该亮丙瑞林衍生物能够提高老龄雌鼠的卵巢系数和卵泡个数，明显改善了衰老的卵巢功能，进而达到调控雌性大鼠的性腺轴的目的；且对卵巢肿瘤具有一定的治疗效果。

[0007] 进一步地，在本发明的一些实施例中，催化剂为二环己基碳二亚胺、4‑二甲胺基吡啶中的至少一种。

[0008] 更进一步地，在本发明的一些实施例中，催化剂中二环己基碳二亚胺、4‑二甲胺基吡啶的重量比为10‑20:1。

[0009] 进一步地，在本发明的一些实施例中，溶剂为四氢呋喃、二氯甲烷、环己烷、环氧丙烷中的至少一种。

[0010] 进一步地，在本发明的一些实施例中，按重量份计，带有保护基团的亮丙瑞林为2.2‑4.7份、含羧基的化合物为1.5‑3.5份、溶剂为200‑400份、催化剂为0.5‑1.2份。

[0011] 进一步地，在本发明的一些实施例中，亮丙瑞林衍生物的纯度高于97.4%，收率高于85.9%。

[0012] 本发明的另一目的是提供一种药物。

[0013] 一种药物，包括亮丙瑞林衍生物和植物甾烷醇酯。

[0014] 进一步地，在本发明的一些实施例中，亮丙瑞林衍生物与植物甾烷醇酯的重量比为1:0.2‑0.35。将亮丙瑞林衍生物与植物甾烷醇酯共同使用，两者可能起协同增强作用，进一步提高了药物对子宫内膜异位症的治疗效果，以及显著改善了衰老的卵巢功能，且对卵巢肿瘤具有更好的治疗效果。

[0015] 本发明还公开了亮丙瑞林衍生物在制备治疗子宫内膜异位症和/或抗肿瘤药物中的用途。

[0016] 本发明采用亮丙瑞林与12‑O‑甲基鼠尾草酸、松苓新酸反应制得亮丙瑞林衍生物，该亮丙瑞林衍生物对大鼠子宫内膜异位症的治疗效果，同时能够降低患有子宫内膜异位症的大鼠血清中CA125浓度，进而使亮丙瑞林衍生物对大鼠子宫内膜异位症具有有效的治疗效果；除此之外，该亮丙瑞林衍生物能够提高老龄雌鼠的卵巢系数和卵泡个数，明显改善了衰老的卵巢功能，进而达到调控雌性大鼠的性腺轴的目的；且对卵巢肿瘤具有一定的治疗效果。因此，本发明是一种对子宫内膜异位症具有优良治疗效果的亮丙瑞林衍生物，同时其能明显改善衰老的卵巢功能以及对卵巢肿瘤具有较好的治疗效果。附图说明

[0017] 图1为亮丙瑞林与亮丙瑞林衍生物的红外光谱图。

[0018] 下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容。应当指出，这些实施例仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。本实施例中所用试剂如无特殊说明，均为市购。

[0019] 需要说明的是，在本发明的一些实施例中，带保护基团的亮丙瑞林的氨基酸序列为：H‑D‑Pyr‑His(Trt)‑Trp(Boc)‑Ser‑Tyr(tBu)‑D‑Leu‑Leu‑Arg(Pdf)‑Pro‑NHEt。

[0020] 其中，关于本发明中所出现的英文缩略语说明如下表所示：进一步地，在本发明的一些实施例中，一种亮丙瑞林衍生物的制备方法，包括以下步骤：
按重量份计，将2.2‑4.7份带有保护基团的亮丙瑞林与1.5‑3.5份含羧基的化合物溶于200‑400份溶剂中，然后加入0.5‑1.2份催化剂在4‑6℃下搅拌反应1‑2h，然后再在23‑
25℃下搅拌反应2‑4h，反应结束后，经凝胶柱层析，浓缩，然后加入至TFA:TIS:H2O(TFA:
TIS:H2O[v:v:v]=90‑95:2.5‑5:2.5‑5)的溶液中，23‑25℃下搅拌反应3‑5h，经异丙醚沉淀，过滤，再经凝胶柱层析纯化，浓缩，冷冻干燥，到亮丙瑞林衍生物粗产物，再将粗产物溶于
0.1‑0.2mol/L的醋酸水溶液中，用0.4‑0.6μm微孔滤膜过滤，滤液经C18柱纯化，流动相：20:
20‑25(v:v)乙腈‑水流动相，流速：120‑150ml/min梯度洗脱，检测波长为270‑290nm，收集目的馏分，浓缩，冷冻干燥，得到亮丙瑞林衍生物，经HPLC检测，其纯度高于97.4%，收率高于
85.9%。

[0021] 以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述。

[0022] 实施例1：一种亮丙瑞林衍生物的制备方法，包括以下步骤：
按重量份计，将3.8份带有保护基团的亮丙瑞林与1.7份12‑O‑甲基鼠尾草酸溶于
300份二氯甲烷中，然后加入0.85份二环己基碳二亚胺与4‑二甲胺基吡啶混合物中，其中二环己基碳二亚胺、4‑二甲胺基吡啶的重量比为15:1，在4℃下搅拌反应1h，然后再在25℃下搅拌反应3h，反应结束后，经凝胶柱层析，浓缩，然后加入至TFA:TIS:H2O(TFA:TIS:H2O[v:v:
v]=95:2.5:2.5)的溶液中，25℃下搅拌反应3h，经异丙醚沉淀，过滤，再经葡聚糖凝胶Sephadex LH_20柱层析纯化，浓缩，冷冻干燥，到亮丙瑞林衍生物粗产物，再将粗产物溶于
0.1mol/L的醋酸水溶液中，用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液经C18柱纯化，流动相：20:25(v:v)乙腈‑水流动相，流速：150ml/min梯度洗脱，检测波长为285nm，收集目的馏分，浓缩，冷冻干燥，得到亮丙瑞林衍生物，经HPLC检测，其纯度为98.2%，收率为87.4%，经质谱分析检测其分子量为1537.90，与理论值接近；其结构式如下：
。

[0023] 本实施例中，带有保护基团的亮丙瑞林的氨基酸序列为：H‑D‑Pyr‑His(Trt)‑Trp(Boc)‑Ser‑Tyr(tBu)‑D‑Leu‑Leu‑Arg(Pdf)‑Pro‑NHEt。

[0024] 实施例2：一种亮丙瑞林衍生物的制备方法，与实施例1不同的是，反应结束后，经凝胶柱层析，浓缩，然后加入至TFA:TIS:H2O(TFA:TIS:H2O[v:v:v]=90:5:5)的溶液中，25℃下搅拌反应3h，经异丙醚沉淀，过滤，再经葡聚糖凝胶Sephadex LH_20柱层析纯化，浓缩，冷冻干燥，到亮丙瑞林衍生物粗产物，再将粗产物溶于0.1mol/L的醋酸水溶液中，用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液经C18柱纯化，流动相：20:25(v:v)乙腈‑水流动相，流速：140ml/min梯度洗脱，检测波长为285nm，收集目的馏分，浓缩，冷冻干燥，得到亮丙瑞林衍生物，经HPLC检测，其纯度为97.6%，收率为85.9%。

[0025] 实施例3：一种亮丙瑞林衍生物的制备方法，与实施例1不同的是，按重量份计，将4.5份带有保护基团的亮丙瑞林与2.5份松苓新酸溶于400份二氯甲烷中，然后加入1.1份二环己基碳二亚胺与4‑二甲胺基吡啶混合物中，其中二环己基碳二亚胺、4‑二甲胺基吡啶的重量比为
15:1，在4℃下搅拌反应1h，然后再在25℃下搅拌反应3h，最终产物经HPLC检测，其纯度为
98.8%，收率为87.5%，经质谱分析检测其分子量为1646.12，与理论值接近；其结构式如下：
。

[0026] 实施例4：一种亮丙瑞林衍生物的制备方法，与实施例3不同的是，反应结束后，经凝胶柱层析，浓缩，然后加入至TFA:TIS:H2O(TFA:TIS:H2O[v:v:v]=90:5:5)的溶液中，25℃下搅拌反应3h，经异丙醚沉淀，过滤，再经葡聚糖凝胶Sephadex LH_20柱层析纯化，浓缩，冷冻干燥，到亮丙瑞林衍生物粗产物，再将粗产物溶于0.1mol/L的醋酸水溶液中，用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液经C18柱纯化，流动相：20:25(v:v)乙腈‑水流动相，流速：140ml/min梯度洗脱，检测波长为285nm，收集目的馏分，浓缩，冷冻干燥，得到亮丙瑞林衍生物，经HPLC检测，其纯度为98.6%，收率为86.3%。

[0027] 实施例5：一种药物，包括实施例1中的亮丙瑞林衍生物和植物甾烷醇酯，其中亮丙瑞林衍生物与植物甾烷醇酯的重量比为1:0.2。

[0028] 实施例6：一种药物，与实施例5不同的是，亮丙瑞林衍生物与植物甾烷醇酯的重量比为1:
0.35。

[0029] 实施例7：一种药物，与实施例5不同的是，其包括实施例3中的亮丙瑞林衍生物和植物甾烷醇酯，其中亮丙瑞林衍生物与植物甾烷醇酯的重量比为1:0.2。

[0030] 实施例8：一种药物，与实施例7不同的是，亮丙瑞林衍生物与植物甾烷醇酯的重量比为1:
0.35。

[0031] 实施例9：一种药物，与实施例5不同的是，其包括醋酸亮丙瑞林（购自湖北恒景瑞化工有限公司）和植物甾烷醇酯，其中亮丙瑞林衍生物与植物甾烷醇酯的重量比为1:0.2。

[0032] 试验例1：亮丙瑞林衍生物红外谱图测定
采用美国Necolit5D×B傅立叶变换红外光谱仪对亮丙瑞林及其亮丙瑞林衍生物的结构进行表征。

[0033] 图1为亮丙瑞林、实施例1中亮丙瑞林衍生物与实施例3中亮丙瑞林衍生物的红外谱图；曲线a、b、c分别为亮丙瑞林、实施例1中亮丙瑞林衍生物与实施例3中亮丙瑞林衍生物的红外谱图；由图1可以看出，相对于亮丙瑞林的红外谱图，实施例1中亮丙瑞林衍生物在‑1 ‑11745cm 附近出现酯基的伸缩振动峰，在1233cm 附近出现C‑O‑C的伸缩振动峰；因此，采用亮丙瑞林与12‑O‑甲基鼠尾草酸反应制得亮丙瑞林衍生物；而实施例3中亮丙瑞林衍生物在‑1 ‑1
1743cm 附近也出现酯基的伸缩振动峰，在1232cm 附近出现C‑O‑C的伸缩振动峰；因此，采用亮丙瑞林与松苓新酸反应制得亮丙瑞林衍生物。

[0034] 试验例2：对子宫异位内膜生长的影响
（1）建立大鼠模型
选取SPF级健康SD雌性大鼠，8‑9周龄，体重180 200g；大鼠适应性喂养7d后，皮下~
苯甲酸雌二醇0.15mg/kg。禁食禁饮12h后采用7%水合氯醛麻醉，于下腹正中、尿道口上端
1cm作2‑3cm纵行切口，结扎子宫系膜血管，然后结扎需切除的子宫段两端，分离子宫内膜。
在腹壁切口两侧作隧道，放置分离的子宫内膜并紧贴肌层，切口缝合，术后每日肌内注射庆大霉素0.10ml，共3d，预防感染。

[0035] （2）分组与给药造模后4周将大鼠随机分为模型组、亮丙瑞林组、实验组（实施例1‑9），每组各6只。
模型组予以生理盐水3ml灌胃；亮丙瑞林组皮下注射醋酸亮丙瑞林（购自湖北恒景瑞化工有限公司）1.5mg/kg；实验组皮下注射亮丙瑞林衍生物或药物1.5mg/kg。

[0036] （3）异位病灶检测分别于给药前和给药后4周、8周，各组均取5只大鼠开腹探查，测量异位病灶体积，计算公式如下：
3 2
异位病灶体积（mm）=长×宽×0.5
3
表1 各组大鼠给药前后异位病灶体积测试结果/mm
由表1可以看出，在给药前，各组大鼠的异位病灶体积无明显差别；在给药4周、8周后，模型组中的异位病灶体积一直呈现增大趋势，而亮丙瑞林组与实验组呈现先减小后增大的趋势，即在给药4周后异位病灶的体积低于在给药8周后异位病灶的体积；对比实施例
1‑4与亮丙瑞林组，在给药4周、8周后，实施例1‑4中大鼠的异位病灶的体积低于亮丙瑞林组，且从4周到8周的增加量也低于亮丙瑞林组，说明采用亮丙瑞林与12‑O‑甲基鼠尾草酸、松苓新酸反应制得亮丙瑞林衍生物，其提高了亮丙瑞林衍生物对大鼠子宫内膜异位症的治疗效果；对比实施例1与实施例5‑6、实施例3与实施例7‑8，实施例5‑6中大鼠的异位病灶的体积低于实施例1，实施例7‑8中大鼠的异位病灶的体积低于实施例3，说明将制得的亮丙瑞林衍生物与植物甾烷醇酯联合制得药物，两者可能起协同增强作用，进一步提高了药物对大鼠子宫内膜异位症的治疗效果。

[0037] （4）血清CA125检测取大鼠眼眶内眦静脉丛血，4℃离心取上清液‑75℃保存，酶联免疫吸附试验法测定血清CA125浓度（CA125是一种糖蛋白性肿瘤相关抗原，它是肿瘤标志物，存在于上皮性卵巢癌组织及患有卵巢瘤、子宫肌瘤等疾病的患者的血清中），试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。

[0038] 表2各组大鼠给药前后CA125浓度测试结果/（U/ml）由表2可以看出，在给药前，各组大鼠血清中的CA125浓度无明显差别；在给药4周、
8周后，模型组中大鼠血清中的CA125浓度逐渐增大，而亮丙瑞林组与实验组中大鼠血清中的CA125浓度逐渐减小；对比实施例1‑4与亮丙瑞林组，在给药4周、8周后，实施例1‑4中大鼠血清中的CA125浓度低于亮丙瑞林组，说明采用亮丙瑞林与12‑O‑甲基鼠尾草酸、松苓新酸反应制得亮丙瑞林衍生物，其降低了大鼠血清中的CA125浓度，进而使亮丙瑞林衍生物对大鼠子宫内膜异位症具有有效的治疗效果；对比实施例1与实施例5‑6、实施例3与实施例7‑8，实施例5‑6中大鼠血清中的CA125浓度低于实施例1，实施例7‑8中大鼠血清中的CA125浓度低于实施例3，说明将制得的亮丙瑞林衍生物与植物甾烷醇酯联合制得药物，进一步提高了药物对大鼠子宫内膜异位症的治疗效果。

[0039] 试验例3：对性腺轴的调控能力
（1）实验分组与建模：选取SD成年雌性大鼠，体质量230‑250g；喂养1周后按体质量随机分为老龄空白组、亮丙瑞林组、老龄实验组（实施例1‑9），每组10只，在正常供应饲料和饮水的情况下，老龄空白组不注射任何药物；亮丙瑞林组、老龄实验组皮下注射0.2μg/100g体质量的醋酸亮丙瑞林（购自湖北恒景瑞化工有限公司）、亮丙瑞林衍生物或药物，饲养5个月，青年对照组在取材前1周开始饲养，正常供应饲料与饮水，不做其他处理。

[0040] （2）卵巢系数和卵泡个数计算：按照卵巢系数（%）=卵巢湿重/体质量×100%，计算每只大鼠的卵巢系数；首先对动物称重，然后用10%水合氯醛麻醉(350mg/100g体质量)，取左右卵巢并固定于中性福尔马林中。对卵巢组织进行切片前采用洗涤、脱水、二甲苯浸泡至透明石蜡包埋，连续切片，厚度为5μm。采用苏木精‑伊红染色法观察卵泡，其中HE染色步骤为：常规脱蜡入水；苏木精液染色10min；流水洗涤；1%盐酸乙醇2s；促蓝液返蓝20s；流水冲洗15min；0.5%伊红液染色3min；常规脱水树胶封片。镜下观察，并对卵泡进行计数。

[0041] 表3 各组大鼠卵巢系数和卵泡个数测试结果组别 卵巢系数（%） 卵泡个数（个）
青年对照组 0.0446±0.0013 7.52±1.36
老龄空白组 0.0278±0.0028 2.09±1.21
亮丙瑞林组 0.0339±0.0015 4.87±1.45
实施例1 0.0372±0.0027 6.19±1.58
实施例2 0.0369±0.0018 6.04±1.39
实施例3 0.0375±0.0021 6.32±1.46
实施例4 0.0377±0.0019 6.49±1.53
实施例5 0.0418±0.0026 6.75±1.36
实施例6 0.0425±0.0026 6.86±1.48
实施例7 0.0423±0.0027 7.02±1.27
实施例8 0.0431±0.0032 7.07±1.32
实施例9 0.0364±0.0015 5.15±1.19
由表3可以看出，青年对照组、亮丙瑞林组与实验组中老龄雌鼠的卵巢系数和卵泡个数均远高于老龄空白组；对比实施例1‑4与亮丙瑞林组，实施例1‑4中老龄雌鼠的卵巢系数和卵泡个数均高于亮丙瑞林组，说明采用亮丙瑞林与12‑O‑甲基鼠尾草酸、松苓新酸反应制得亮丙瑞林衍生物，其提高了老龄雌鼠的卵巢系数和卵泡个数，明显改善了衰老的卵巢功能，进而达到调控雌性大鼠的性腺轴的目的；对比实施例1与实施例5‑6、实施例3与实施例7‑8，实施例5‑6中老龄雌鼠的卵巢系数和卵泡个数高于实施例1，实施例7‑8中老龄雌鼠的卵巢系数和卵泡个数高于实施例3，说明将制得的亮丙瑞林衍生物与植物甾烷醇酯联合制得药物，进一步提高了药物对雌性大鼠性腺轴的调控机能，显著改善衰老的卵巢功能。

[0042] 试验例4：对卵巢恶性畸胎瘤细胞（PA‑1）的影响
（1）将卵巢恶性畸胎瘤细胞（PA‑1）使用1640培养基，置于含5%CO2、饱和湿度、37℃恒温培养箱中培养，每1‑2d传代1次。使用CCK‑8法检测细胞增殖抑制率，其中细胞增殖率与细胞增殖抑制率的计算公式如下：
细胞增殖率（%）=（受试孔OD值‑本底对照孔OD值）/（对照细胞OD‑本底对照值）×
100%
细胞增殖抑制率（%）=（1‑细胞增殖率）×100%
5
（2）细胞分组及用药：选取对数生长期细胞，按照每孔1×10个细胞的浓度铺96孔板，加入培养液至每孔体积l00μL，培养24h后分组，每组测l0组数据，空白组为生理盐水组，亮丙瑞林组为醋酸亮丙瑞林，实验组为实施例1‑9，每组数据设3个复孔及本底对照孔(仅加培养基，无细胞)。亮丙瑞林组与实验组的给药浓度为16mg/L。

[0043] （3）检测指标：检测各组细胞生长抑制率；采用免疫印迹法检测胞浆Cyt‑C与Apaf‑1蛋白含量。

[0044] 表4 各组PA‑1细胞增殖抑制率、Cyt‑C与Apaf‑1蛋白含量组别 细胞增殖抑制率（%） Cyt‑C蛋白 与Apaf‑1蛋白
空白组 0 1 1
亮丙瑞林组 48.36±0.38 2.09±0.04 2.18±0.13
实施例1 59.82±0.75 2.61±0.07 2.94±0.26
实施例2 58.67±1.09 2.58±0.09 2.91±0.18
实施例3 62.04±0.83 2.92±0.06 3.46±0.22
实施例4 61.79±1.56 2.88±0.05 3.27±0.15
实施例5 65.28±2.04 3.04±0.06 3.81±0.26
实施例6 66.43±1.81 3.23±0.08 4.27±0.17
实施例7 68.55±2.07 3.54±0.04 4.51±0.32
实施例8 69.13±2.15 3.62±0.05 4.69±0.26
实施例9 53.74±1.34 2.27±0.09 2.42±0.18
由表4可以看出，亮丙瑞林组与实验组中PA‑1细胞增殖抑制率、Cyt‑C与Apaf‑1蛋白含量均高于空白组；对比实施例1‑4与亮丙瑞林组，实施例1‑4中PA‑1细胞增殖抑制率、Cyt‑C与Apaf‑1蛋白含量高于亮丙瑞林组，说明采用亮丙瑞林与12‑O‑甲基鼠尾草酸、松苓新酸反应制得亮丙瑞林衍生物，其提高了亮丙瑞林衍生物对肿瘤细胞的抑制作用；对比实施例1与实施例5‑6、实施例3与实施例7‑8，实施例5‑6中PA‑1细胞增殖抑制率、Cyt‑C与Apaf‑1蛋白含量高于实施例1，实施例7‑8中PA‑1细胞增殖抑制率、Cyt‑C与Apaf‑1蛋白含量高于实施例3，说明将制得的亮丙瑞林衍生物与植物甾烷醇酯联合制得药物，进一步提高了药物对卵巢肿瘤的治疗效果。

[0045] 本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

[0046] 以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。