利用兰海膜生产高吸光度藻红素的装置

申请号 CN03236855.0 申请日 2003-01-27 公开(公告)号 CN2604440Y 公开(公告)日 2004-02-25
申请人 人宇生物科技股份有限公司; 吕志翼; 发明人 江永棉; 周宏农; 郑俊明; 吕志翼;
摘要 一种利用 锡 兰海膜生产高吸光度藻红素的装置,它包含有第一培养槽、第二培养槽、收集器、 研磨 器、搅拌器及沉淀器;利用锡兰海膜生活史中具有的有性生殖、无性生殖与 营养繁殖 三个世代交替及果孢子丝状体阶段不含各种胶类的特征下,在控制的光线、 温度 及营养条件下,延续其丝状体阶段,并进一步以其为原料,萃取高吸光度比值藻红素的装置。通过其单位重量含有藻红素的高重量比值,达到降低单位成本和减少藻红素纯化步骤的功效。
权利要求

1、一种利用兰海膜生产高吸光度藻红素的装置,其特征是:它包含有 第一培养槽、第二培养槽、收集器、研磨器、搅拌器及沉淀器;
具有培养液的第一培养槽培养锡兰海膜含成熟果孢子囊的配子体,并得到 果孢子;
该第二培养槽临近该第一培养槽,具有500-6000lux的照度、明暗比为 10∶14以上,及15-30℃下的环境,培养该果孢子成长为丝状体;收集该丝状体 的收集器置于该第二培养槽中;研磨该丝状体的研磨器临近该收集器;
该搅拌器临近该研磨器,加入酸缓冲液与研磨后的该丝状体,得到一深色 色素蛋白溶;
该沉淀器临近该搅拌器,用以从该深色色素蛋白溶液沉淀出藻红素。
2、根据权利要求1所述的装置,其特征是:该锡兰海膜从其果孢子丝状体 中萃取的藻红素,经液相层析仪所得出的565nm的层析光谱图。
3、根据权利要求1所述的装置,其特征是:该培养液为SWM-III培养液。
4、根据权利要求3所述的装置,其特征是:该SWM-III培养液为去除有机物 的SWM-III培养液。
5、根据权利要求1所述的装置,其特征是:培养该果孢子丝状体的方法为 旋浮培养法。
6、根据权利要求1所述的装置,其特征是:该培养的环境为20℃,2000lux 的照度与明暗比为12∶12。
7、根据权利要求1所述的装置,其特征是:收集该丝状体的收集器是网布。
8、根据权利要求7所述的装置,其特征是:该网布为20-400网目的网布。
9、根据权利要求1所述的装置,其特征是:该研磨器更包含有干燥器。
10、根据权利要求9所述的装置,其特征是:该干燥器为真空干燥器。
11、根据权利要求9所述的装置,其特征是:该干燥器为温干燥器。
12、据权利要求1所述的装置,其特征是:沉淀该藻红素的沉淀器为盐析 装置。
13、据权利要求12所述的装置,其特征是:该盐析装置中设有60-65%的 硫酸铵溶液。
14、根据权利要求1所述的装置,其特征是:它还包含有纯化器,该纯化 器为胶滤层析装置。
15、据权利要求14所述的装置,其特征是:该胶滤层析装置为使用Sephadex G200的胶滤层析装置。
16、据权利要求1所述的装置,其特征是:它还包含有纯化器,该纯化器 为超过滤装置。

说明书全文

技术领域

本实用新型是有关于用兰海膜(Halymenia ceylanica)生产具有高吸光 度(OD)比值藻红素的装置。利用锡兰海膜生活史中具有的有性生殖、无性生殖 与营养繁殖三个世代交替及果孢子丝状体阶段不含各种胶类的特征下,在控制 的光线、温度及营养条件下,延续其丝状体阶段,并进一步以其为材料,萃取 高吸光度比值藻红素。

背景技术

不论就藻红素、藻蓝素或其它天然蛋白质色素而言,通常具有实用安全性, 对热、酸度等亦具相当程度的稳定性,可应用于食品与化妆品上,同时亦可 作为免疫学上抗体标志用的荧光色素而应用于临床诊断及细胞生化学研究上。
目前市场已开发并应用的有藻蓝素(phycocyanin)与藻红素 (phycoerythrin),其中,藻蓝素生产的原料来源多为可予大量繁殖培养的蓝绿 藻,如螺旋藻(Spirulina)与锈微囊藻(Microcystis),且其培养与生产装置 多享有专利
而藻红素则因原料的缺乏,或因原物料不利于色素生产,而存在产量少及 价格昂贵的缺陷,对全球每年数万磅食用红色色素的需求,必须开发一种天然、 安全、稳定又具特殊荧光释出的红色色素,预估大量生产后,将使价格下降, 更会扩大其应用范围与市场供给。
目前藻红色素蛋白大部分是分离自红藻的大型叶状体,如紫菜(Porphyra) 或仙菜藻(Ceramium)等,少部分则萃取自可大量控制培养的紫球藻 (Porphyridium)。其主要问题在于:
1、目前虽有野生大量红藻资源及栽培的紫菜作为藻红素原料,但因多数红 藻含丰富胶质物(洋菜胶、鹿菜胶、红藻胶),导致色素的萃出不易,尤其是 干燥后的藻类原料更是如此,再加上野生藻种的原料在品和产量上均有季节性 差异,为人所不易掌握。
2、目前紫球藻的培养于收集细胞时,亦有显著的困难,因为单细胞藻体的 收集一向是耗能而耗时的操作,影响生产成本甚大,而藻细胞于培养时所分泌 的可溶性多醣类,除了阻碍细胞的收集外,亦影响到色素的抽取
为了解决上述的问题,美国专利5,358,858提出了一种由头发菜 (Bangiaatropurpurea)及狭叶紫菜(Porphyraangusta)丝状体生产藻红素的方 法,利用头发菜及狭叶紫菜生活史中的丝状孢子体阶段不含各种胶类的特征下, 利用控制的光线、温度及营养条件下,延续其丝状体阶段,并进一步以其为原 料,萃取藻红素,其步骤如下:
1、丝状体的培养与繁殖,从野外采集成熟的头发菜或狭叶紫菜配子体,以 灭菌及毛笔清洗藻体干净,稍阴干后投入含改良过的SWM-III(如表一所示) 培养皿中,培养皿内底部铺有盖玻片,待孢子释放并附着于盖玻片后,在室温 下、1000-4000lux的照度及每日10-16小时照光的培养箱中发芽成长,最后发 育呈分歧多枝的丝状孢子体。
表一 SWM-III的组成
NaNO3 8.5g/100ml                      取2ml
Na2HPO4 0.595g/100ml                 取2ml
Na2EDTA 0.5g/100ml                    取2ml
          0.01625g/100ml                取2ml
FeCl3(或FeCl3·7H2O)0.02885g/100ml  取2ml
*1PI-metal                             取2ml
*2S-3Vitamins                          取2ml
Soil extract                            取50ml
Tris(10cc/l)                            取500mg
Livere xtract                     取10mg
海水pH=7、5                      1升
(调pH时:先以浓HCl调至pH≤7,再以适当浓度的NaOH调至pH7、5,如 此可免于消毒时产生白色沉淀)
其中*1PI-metal为:
H3BO3             12.368g
MnCl2              1.385g
ZnCl2              0.109g
蒸馏水              2升
CoCl2·6H2O       4.479mg
CuCl2·2H2O       0.034mg
其中*2S-3Vitamins为:
ThiaminHCl          0.5g
Capantothenate      0.1g
Nicotinicacid       0.1g
P-aminobenzoicacid  10mg
Biotin              1mg
蒸馏水              2升
Inositol            5g
Folic acid          2mg
Thymine             3mg
B12                1mg
(所有的Stock溶液均存于褐色瓶中,冷藏保存)
2、丝状体刮下后移至含培养液的三角瓶,在上述生长环境条件下培养,育 成丝状体的聚集团。打碎丝状体的聚集团,移至更大生长的量瓶继续发育成更 多的聚集团,并因此渐次扩大培养的体积,在较大体积的照光培养槽中,应予 打气(每分钟300毫升干净空气)大量繁殖培养。通过100-400网目的网布过滤, 滤除的培养液可回收再使用,对后续的培养并无妨碍。
3、藻体收获后,因丝状体结构可经真空或温迅速干燥,再研磨成粉后, 以水或磷酸盐溶液予以充分搅拌萃取、离心,可得澄清的深红藻蛋白溶液;藻 色素的浓缩与纯化,可通过20%硫酸铵溶液去除部分杂质蛋白沉淀,再于溶液 中经60-65%硫酸铵溶液沉淀出色素蛋白,为OD565/OD280=1.4-1.6的粗红色色素, 为食品级、化妆品可用的色素。
4、将沉淀的蛋白进一步通过胶滤层析纯化(gelfiltration),使用 Sephadex G200树酯分离,第一道程序可得OD比为3.3-3.7的藻红素产品,再 次重复即可得OD比为5.1-5.2的藻红素,再经胶体电泳法(SDS)电泳所得的结 果显示纯度约99%,可作为免疫检验用试剂
上述的方法虽然可以避免传统紫菜、仙菜藻萃取色素法需以加热及分离胶 值的复杂手续,或是紫球藻等单细胞植物萃取法,由于其体积小,导致收集的 困难与其分泌的多醣类影响色素的抽取的问题,其主要缺陷在于:
但是头发菜及狭叶紫菜丝状体直接形成的深红藻蛋白溶液,其OD565/OD280 只有1.4-1.6,仍需进行藻色素的浓缩与纯化,来获取高OD值的藻红素,造成 制程复杂及成本较高。因此我们需要开发其它藻种的丝状体,使其初次形成的 深红藻蛋白溶液就具有高OD值的藻红素。
鉴于上述的背景技术中,传统利用头发菜及狭叶紫菜丝状体直接形成的深 红藻蛋白溶液,其吸光度比值偏低的问题。本发明人创造出利用锡兰海膜生产 具有高吸光度比值藻红素的装置。

发明内容

本实用新型的主要目的是提供一种用锡兰海膜生产高吸光度藻红素的装 置,通过其单位重量含有藻红素的高重量比值,达到降低单位成本的目的。
本实用新型的又一个目的是提供一种用锡兰海膜生产高吸光度藻红素的装 置,通过其可萃取具有高吸光度比值藻红素,达到减少藻红素纯化步骤的目的。
本实用新型的目的是这样实现的:一种用锡兰海膜生产高吸光度 藻红素的装置,它是使用生活史具有有性生殖、无性生殖与营养繁殖三个 世代交替的藻种的果孢子的丝状体生产高吸光度比值的藻红素的装置,其特征 是:它包含有第一培养槽、第二培养槽、收集器、研磨器、搅拌器及沉淀器;
具有培养液的第一培养槽培养锡兰海膜含成熟果孢子囊的配子体,并得到 果孢子;
该第二培养槽临近该第一培养槽,具有500-6000lux的照度、明暗比为 10∶14以上,及15-30℃下的环境,培养该果孢子成长为丝状体;收集该丝状体 的收集器置于该第二培养槽中;研磨该丝状体的研磨器临近该收集器;
该搅拌器临近该研磨器,加入酸碱缓冲液与研磨后的该丝状体,得到一深色 色素蛋白溶液;
该沉淀器临近该搅拌器,用以从该深色色素蛋白溶液沉淀出藻红素。
该锡兰海膜从其果孢子丝状体中萃取的藻红素,经液相层析仪所得出的 565nm的层析光谱图。该培养液为SWM-III培养液。该SWM-III培养液为去除有机 物的SWM-III培养液。培养该果孢子丝状体的方法为旋浮培养法。该培养的环境 为20℃,2000lux的照度与明暗比为12∶12。收集该丝状体的收集器是网布。 该网布为20-400网目的网布。该研磨器更包含有干燥器。该干燥器为真空干燥 器。该干燥器为温风干燥器。沉淀该藻红素的沉淀器为盐析装置。该盐析装置 中设有60-65%的硫酸铵溶液。它还包含有纯化器,该纯化器为胶滤层析装置。 该胶滤层析装置为使用Sephadex G200的胶滤层析装置。它还包含有纯化器, 该纯化器为超过滤装置。
下面结合较佳实施例附图详细说明。

附图说明

图1是利用高效能液相层析仪(HPLC)得出的藻红素UV吸收及荧光发散层析 光谱图;
图2是头发菜生活史的示意图;
图3是狭叶紫菜生活史的示意图;
图4是海面生活史的示意图;
图5-图7是传统的头发菜萃取出的纯质藻红素经高效能液相层析仪所得出 的280nm、565nm、615nm的层析光谱图。
图8-图10是传统的狭叶紫菜萃取出的纯质藻红素经高效能液相层析仪所 得出的280nm、565nm、615nm的层析光谱图。
图11-图13是本实用新型的锡兰海膜萃取出的纯质藻红素经高效能液相层 析仪所得出的280nm、565nm、615nm的层析光谱图。
图14-图18是本实用新型利用锡兰海膜生产高吸光度藻红素的装置及其使 用方法示意图。

具体实施方式

下面的较佳实施例仅为说明本实用新型,还可以广泛地在其它藻种的实施 例施行,且本实用新型的范围不受下面较佳实施例的限定。
众所周知,藻胆蛋白是来自藻类体内的一种水溶性荧光蛋白色素。因其具 有特殊的荧光性质,目前主要被广泛的运用于流动细胞仪的荧光试剂上。各种 藻胆蛋白中,藻红素是其中的一种,亦是天然物中荧光强度最高的一种,因此 有许多荧光检测装置采用此类色素。
图1为藻红素利用高效能液相层析仪(HPLC)得出的UV吸收及荧光发散层 析光谱图,其层析条件如下所述:
HPLC column:HYDROCELL DEAE NP10
Column size:50*4.6mm
Buffer A:10mMK-PBS pH6.0
Buffer B:10mMk-PBS,0.5M NaCl pH6.0
Gradient:0%Buffer B→12min→50%Buffer B
Detection:565nm
Flow rate:1ml/min
而高效能液相层析仪主要由高精密度高压体、分离管、侦测仪和记录器 所组成。
参阅图2所示,观察头发菜生活史,有性生殖为产生造果器6(即雌性配偶 体5)与精子囊2(即雄性配偶体1)释放的精于3受精4之后,在果孢子囊7会 发育成果孢子8,里面的果孢子8成熟后,即会散出,变成丝状孢子体9,在侧 腰状色素体b作用下,成长为胞子体10和壳胞子囊11,其放出壳胞子12在单 胞子形成部位15进一步成长为幼体13、单列藻体14,在星状色素体a作用下, 形成单胞子16,单胞子16进一步形成直立体(配偶体)18、多列藻体17成长 为雄性配偶体1。
无性生殖则是由单孢子16直接发育成萌发成幼体13、单列藻体14及小型 藻体,等到一定时候又可产生单孢子16,单孢子16又萌发成单列藻体14及小 型藻体,如此循环一直到适当的环境条件下,单列藻体14及小型藻体所产生的 单孢子16就可萌发成大型藻体17。同时,单列藻体14及小型藻体也能转变成 大型藻体17,再进入有性生殖世代。
参阅图3所示,观察狭叶紫菜生活史中,由于其与图2的头发菜生活史大 体相同,故不详述。我们可以得知上述两种藻类的生活史一般是有性生殖及无 性生殖两个世代交替,传统技术就是利用丝状孢子体阶段不含各种胶类的特征, 在控制的光线、温度及营养条件下,延续其丝状体阶段,并进一步以其为原料, 萃取藻红素。
参阅图4所示,观察海面(Nemalion)生活史,由于其与图2的头发菜生活 史大体相同,故不详述。藻类的生活史除了是以有性生殖及无性生殖两个世代 交替外,另外部分藻类还多出一个营养繁殖世代,即产生四分孢子的孢子体(即 四分孢子体),其过程为造果器受精后形成果孢子体(carposporephyte)、果孢 子(carpospore)、四分孢子体(tetrasporophyte)、四分孢子囊 (tetrasporangium)、最后是四分孢子(tetraspore),其中果孢子与四分孢子都 会萌发成丝状体,但此两种丝状体的特性不同。
本实用新型就是利用具有营养繁殖世代的锡兰海膜,其果孢子丝状体阶段 不含各种胶类的特征,在控制的光线、温度及营养条件下,延续其丝状体阶段, 并进一步以其为原料,萃取出具有高OD值藻红素。
参阅图14-图18所示,本实用新型的装置及其使用方法如下:
1、丝状体的培养与繁殖,将成熟的锡兰海膜含成熟果孢子囊的配子体,以 灭菌海水及毛笔清洗藻体干净,稍阴干后,投入不含有机物的SWM-III培养液102 的第一培养器100中,第一培养器100内底部铺有玻璃片103,待果孢子 101(carpospore)释放并附着于玻璃片103后,在15-30℃下,500-6000lux 的照度,明暗比为10∶14以上,及每日10以上照光的第一培养器100中发芽成 长,最后发育呈分歧多枝的丝状体,如图14所示。
2、丝状体201刮下后,移至含培养液的大型培养槽200,在上述相同生长 环境条件下培养,可育成丝状体的疏松小聚集团,并因此渐次扩大培养的体积, 在较大体积的照光培养槽中,应予打气器202打气,使该小聚集团悬浮于培养 液204中(称为旋浮培养)大量繁殖培养。通过20-400网目的网布203过滤,滤 除的培养液可回收再使用,对后续的培养并无妨碍,如图15所示。
3、藻体303收获后,因丝状体结构可经真空器或温风器301迅速干燥,再 经自动磨粉机302研磨成粉后,取2.4克重的粉末,加入70毫升、10mm的磷 酸溶液或其它酸碱缓冲液304,用搅拌器303予以充分搅拌,以维持溶液pH 值在5-10之间,予以充分搅拌、再以6000rpm、10min、4℃的状态下使用离心 机305,可得澄清的深红藻蛋白溶液306。藻色素的浓缩与纯化,可通过20%硫 酸铵溶液307去除部分杂质蛋白沉淀308,再于溶液中经60%-65%硫酸铵溶液 309沉淀出色素蛋白,其为OD565/OD280=2.66的粗红色色素310,其为食品级或 化妆品可用的色素。上述澄清的深红藻蛋白溶液,也可以用直接收获的湿藻体 磨碎,加磷酸钾溶液后,再以离心机离心取得,而藻色素的浓缩与纯化可通过 超过滤法(ultrafiltration)来进行,如图16-图18所示。
4.将沉淀的蛋白进一步通过胶滤层析纯化(gel filtration),使用120公 分长的Sephadex G200树酯分离,第一道程序可得OD比为4.5以上的藻红素产 品,再次重复,即可得OD比为5.3以上藻红素,再经胶体电泳法(SDS)电泳, 所得的结果显示纯度约99%,可作为免疫检验用试剂。
参阅图5-图7所示,为传统从头发菜萃取出的纯质藻红素经高效能液相层 析仪(HPLC)所得出的280nm、565nm、615nm的层析光谱图,
参阅图8-图10所示,为传统从狭叶紫菜萃取出的纯质藻红素经高效能液 相层析仪所得出的280nm、565nm、615nm的层析光谱图。实际上,从不同的藻 种中所萃取出的藻红素,其经高效能液相层析仪所得出层析光谱图亦有所差异, 就像人类的手指指纹一般。因此,我们可以通过此一特性来分辨出藻红素是由 何种藻种所生产。
参阅图11-图13所示,是本实用新型从锡兰海膜取出的纯质藻红素经高效 能液相层析仪所得出的280nm、565nm、615nm的层析光谱图。
表二为传统的头发菜、狭叶紫菜与本实用新型的锡兰海膜萃取藻红素的比较表。
第一列为单位藻类重量(克)含藻红素重量(毫克)的比值,代表在相同的藻 类重量下可以产出的藻红素,我们可以清楚得知:本实用新型的锡兰海膜,其 含藻红素的比值为最高。
第二、三列为从藻种中萃取出藻红素的吸光度比值(OD565/OD280)及 (OD615/OD565),前者表示藻红素和其它蛋白质纯度的比例,后者表示藻蓝素和藻 红素的纯度比,(OD565/OD280)比值越高表示藻红素纯度越高,其附加价值越高, 越具有食品或化妆品色素利用价值,也越有利后端制成纯化,因可应用于医疗 的免疫检验用试剂上;而因为藻蓝素会吸收藻红素所发出的荧光,造成作为在 食品或化妆品色素用途时荧光颜色不佳,因此(OD615/OD565)越低表示藻蓝素含量 越少,在荧光颜色效果上更佳。同样地,我们可以明显看出:本实用新型的锡 兰海膜,其萃取出藻红素具有最高的吸光度比值。因此,利用本实用新型的锡 兰海膜丝状体来萃取藻红素,其较传统头发菜和狭叶紫菜的丝状体,具有高藻 红素含量与高吸光度比值的优点。
表二各藻种藻粉色素成份分析   藻种     Ba     Pa     Hc   RPE mg/g藻粉     53.5     38.89     46.59   吸光比值A565/A280     1.40     1.54     1.44   吸光比值A615/A565     0.19     0.53     0.10
其中
RPE:一种藻红蛋白,具有亲水性并在水与形成稳定性水溶液,其最大UV 吸收波长及荧光发散波长各为566nm及575nm。
Ba:传统头发菜(Bangia atropurpurea)
Pa:传统狭叶紫菜(Porphyra angusta)
Hc:本实用新型的锡兰海膜(Halymenia ceylanica)
本实用新型是通过举出一个较佳实施例来描述,但是本实用新型并不限定 于所举出的实施例,显而易见地,其它未脱离本实用新型所揭示的精神下,所 完成的等效改变或修饰,均应包含在本实用新型的保护范围之内。
综上所述,本实用新型的实施例能达到所预期的功效,又其所揭露的具体 构造,不仅未曾见诸于同类产品中,亦未曾公开于申请前,具有新颖性、创造 性和实用性。
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