[0001] 本实用新型属于油脂化工技术领域，具体涉及一种高酸价油生产生物柴油的双催化方法及装置。

[0002] 用高酸价油脂生产生物柴油(脂肪酸甲酯)，具有原料可再生、含硫低、不含芳香烃等物质的优点，其燃烧性能与石油柴油相似，部分性能甚至优于石油柴油。目前，用高酸价油脂原料生产生物柴油，现在主流工艺有两条：

[0003] 化学法：因高酸价油脂中含有大量游离脂肪酸，不能只用酸催化剂或者碱性催化剂生产生物柴油，须先用浓硫酸或磷酸作为酸性催化剂预处理，将游离脂肪酸转化为酯，再用碱性催化剂将甘三酯转化为脂肪酸甲酯。

[0004] 但化学方法工艺复杂，甲醇必须过量，造成甲醇损耗大，后续工艺甲醇回收能耗大；采用强酸和强碱，反应温度高，对设备防腐有较高要求，不可避免会伴随副反应，产品氧化严重，颜色深，生产过程中还会产生大量酸碱废水。

[0005] 生物酶法：脂肪酶不仅可以催化脂肪酸和甲醇生成脂肪酸甲酯和水，同时还可以催化甘三酯和甲醇生产脂肪酸甲酯和甘油。具有一种催化剂完成两步反应的优点。高酸价油脂正是酶法很好的原料。

[0006] 生物酶法合成生物柴油可以避免传统化学方法的不足，酶法具有反应条件温和、醇用量少、无污染排放的优点，将其应用于工业领域具有节能环保的优势。但是由于短链醇对酶有一定的毒性，酶的使用寿命短，重复回收利用率较低。产物甘油和水影响反应平衡向右侧进行，无法将油脂酸价降低、彻底转化脂肪酸甲酯从而影响脂肪酸甲酯的收率。发明内容

[0007] 本实用新型的目的在于解决现有技术问题，提供一种高酸价油生产生物柴油的双催化方法，并根据工艺方法提供了一套配套的生产装置。本实用新型所述方法具有生物酶法的节能环保特点，又可提高脂肪酸甲酯的收率，同时操作简单，成本低。

[0008] 本实用新型通过以下技术方案来实现：

[0009] 本实用新型的目的之一是提供一种高酸价油生产生物柴油的双催化方法，包括以下步骤：

[0010] 步骤1：采用固定化脂肪酶在略过量的甲醇条件下催化高酸价油进行转化反应，反应平衡后，得到反应料液1；

[0011] 步骤2：采用树脂催化剂将步骤1的反应料液1中未转化的游离脂肪酸和甲醇转化为脂肪酸甲酯，反应结束后，经处理后，得到生物柴油。

[0012] 优选地，所述高酸价油的酸价为50‑150mgKOH/g；更优选的，高酸价油为高酸价餐厨油、高酸价米糠油等的至少一种，酸价为50‑150mgKOH/g。

[0013] 优选地，所述步骤1中，固定化脂肪酶为无锡优普克生物科技有限公司生产的CTG 1090。该酶对短链醇有很强的耐受性，生产成本远低于进口固定化酶制剂。

[0014] 更优选地，所述固定化脂肪酶可以通过如下方法制备：以耐热酵母基因工程菌为菌种，发酵得到脂肪酶，将所述脂肪酶进行固定化，所述固定化的方法为中国专利CN201811654095.3(发明专利名称：一种脂肪酶的固定化方法)中记载的方法；更优选的所述方法为：在Na2HPO4‑柠檬酸缓冲液中，将脂肪酶与大孔苯乙烯树脂载体固定，经洗涤干燥得到固定化脂肪酶。

[0015] 优选地，所述步骤1中，甲醇的质量为高酸价油质量的16‑20％。

[0016] 优选地，所述步骤1中，固定化脂肪酶的质量为高酸价油质量的1‑5％，更优选为2‑5％。其中，固定化脂肪酶的酶负载量为55000‑75000u/g，更优选为60000u/g。

[0017] 优选地，所述步骤1中，还加入高酸价油质量1‑5％的水，更优选为2％。

[0018] 优选地，所述步骤1中，反应温度为25‑40℃，反应时间为2‑12h，更优选为4‑6h。

[0019] 优选地，所述步骤1中，反应调节pH为4.8‑5.2，更优选地通过氢氧化钠调节至pH4.8‑5.2，更优选pH为5。

[0020] 优选地，所述步骤1中，反应平衡后还对反应液进行沉降分离或离心分离，得到反应料液1；所述沉降分离为，将反应液静置0.5‑5h，静置后，水、甲醇和甘油的混合物沉至底部，并和脂肪酸甲酯分层，将静置并分层后的反应液进行上下层分离，取上层脂肪酸甲酯层为反应料液1。从而实现将反应液分离掉水、甲醇和甘油的目的；所述离心分离是指通过离心机进行离心，实现分离目的。

[0021] 更优选地，所述步骤1中，反应液经沉降分离后得到的脂肪酸甲酯层，还含有微量的水和甲醇，会影响后续反应，可通过加热将其进一步去除。

[0022] 优选的，所述步骤1中，反应料液1的酸价为5‑8mgKOH/g，可根据酸价控制反应时间。

[0023] 优选地，所述步骤2中，树脂催化剂为树脂酯化催化剂，树脂酯化催化剂为固体酸树脂催化剂；更优选的为型号Tulsimer T‑63MP的树脂催化剂。更优选的树脂催化剂质量为反应料液1质量的0.1‑10％，更优选的质量比为1‑3％。

[0024] 优选地，所述步骤2中，甲醇的质量为反应料液1总质量的10‑15％。

[0025] 优选地，所述步骤2中，反应温度为110‑150℃，反应方式为连续化反应，酸价降至0.5‑1mgKOH/g，反应结束。更优选的反应时间为1‑8h。更优选为2‑4h。

[0026] 优选地，所述步骤2中，生物柴油的酸价为0.5‑1mgKOH/g。

[0027] 优选地，所述步骤2中，处理包括分离步骤；更进一步，所述分离为将反应后的料液中的甲醇和水分离去除，更进一步，所述分离为反应后的料液于110‑150℃下经闪蒸罐，使甲醇和水汽化从而去除。更进一步，所述处理还包括精制。

[0028] 本实用新型的另一目的是提供一种高酸价油生产生物柴油的双催化装置，所述装置包括通过管道依次连通的酶反应罐、沉降罐、加热釜、换热器、树脂催化柱和闪蒸罐。

[0029] 优选地，所述酶反应罐的下部设置有第一排料口和第二排料口。

[0030] 更优选地，所述酶反应罐的第一排料口设有过滤装置，可以有效拦截固定化脂肪酶；更优选的，第一排料口通过管道直接与沉降罐连通，此时，酶反应罐内反应结束的物料通过第一排料口排出，在过滤装置作用下拦截固定化脂肪酶，过滤后的其他物料通过管道输送至沉降罐内进行沉降。

[0031] 更优选地，所述装置还包括酶回收器，所述酶回收器通过管道与酶反应罐的第二排料口连通；所述酶反应罐的固定化脂肪酶需要更换时，从第二排料口排出并通过管道输送至酶回收器。

[0032] 优选地，所述酶反应罐还配合设置有循环水系统，循环水温度为 25‑40℃，用于保证酶反应罐的温度。

[0033] 优选地，所述沉降罐还通过管道连通向甘油精制车间，含有甘油的混合物通过管道输送至甘油精制车间。

[0034] 优选地，所述加热釜配合设置有蒸汽加热源，更优选的还配合设置有冷却水系统。

[0035] 优选地，所述装置还包括有回收罐。

[0036] 优选地，所述加热釜配合设置有第一冷凝器；更优选的所述第一冷凝器配合设置有冷却水循环系统；更优选的所述第一冷凝器为卧式冷凝器。更优选的所述第一冷凝器通过管道连通回收罐。第一冷凝器将加热釜加热蒸出的水和甲醇冷凝回收，并通过管道输送至回收罐。

[0037] 优选地，所述换热器为螺旋板换热器。

[0038] 优选地，所述树脂催化柱为填充有固体酸树脂催化剂的树脂催化柱，更优选的固体酸树脂催化剂为型号Tulsimer T‑63MP的树脂催化剂，包含但不限于此型号。树脂催化柱可多组串联，便于连续化生产及更换。

[0039] 优选地，所述闪蒸罐配合设置有第二冷凝器；更优选的所述第二冷凝器为立式冷凝器。更优选的所述第二冷凝器通过管道连通回收罐。第二冷凝器将闪蒸罐汽化的甲醇和水冷凝，并通过管道输送至回收罐。

[0040] 优选地，所述管道上按需设置有给料泵，对管道内的物料进行输送；更优选的，连通酶反应罐和沉降罐的管道、连通沉降罐和加热釜的管道、连通加热釜和换热器的管道上分别设有给料泵。

[0041] 优选地，各管道与装置的连接处还配合设置有阀门。

[0042] 本实用新型还提供了一种上述高酸价油生产生物柴油的双催化装置的工艺，包括如下步骤：

[0043] 步骤1固定化脂肪酶催化反应在酶反应罐完成：

[0044] 11)投料

[0045] 初次生产，先将高酸价油脂投入酶反应罐，初始原料用氢氧化钠调至 pH4.8‑5.2，再加入高酸价油脂重量16％‑20％的甲醇，最后加入2％左右的水，加料过程中开启搅拌，开启循环水系统，循环水温度25℃‑40℃；更优选的甲醇可以在反应过程中采用流加方式加入；

[0046] 12)酶反应

[0047] 通过酶反应罐人孔加入底物总重2‑5％的固定化脂肪酶，开始反应；维持搅拌和罐内温度稳定，根据终点酸价控制反应时间，终点酸价在 5‑8mgKOH/g左右，反应时间在4‑12h左右。

[0048] 13)放罐和再次投料

[0049] 酶反应罐底部设有第一排料口和第二排料口，其中罐底的第一排料口配合设有过滤装置，可以有效拦截固定化脂肪酶，第二排料口没有过滤装置，可将罐内的固定化酶排出至酶回收器中回收；酶反应结束，物料通过给料泵输送到沉降罐；正常连续生产时，不需要将固定化脂肪酶排出罐外，只需要依次加入高酸价油、甲醇、水，开启搅拌和循环系统，即可继续生产；由于反应过程中固定化酶不可避免会有损失和失活，必要时需补充。反应采用酶反应罐间歇批次法形式，一批次反应结束后进行放罐，并进行物料的补加，继续进行生产；

[0050] 14)沉降

[0051] 物料进入沉降罐中静置0.5‑5h，水、甲醇和甘油的混合物会在沉降罐底部汇集，沉降罐内物料实现分层，下层物料通过给料泵输送到甘油精制车间，上层物料通过给料泵输送到加热釜；

[0052] 15)脱水、甲醇

[0053] 上层物料中还含有微量的水和甲醇，水会影响步骤2的树脂催化反应，通过加热釜和卧式冷凝器，将水和甲醇回收，最后存于回收罐中。加热釜配套设有蒸汽加热源，卧式冷凝器配套设有冷却水循环系统；

[0054] 步骤2树脂催化反应：

[0055] 21)加入甲醇

[0056] 完成蒸馏操作后，将加热釜的加热蒸汽切换成冷却水，将物料降温到甲醇沸点以下，再次加入甲醇，添加量为底物总质量的10‑15％，混合均匀；

[0057] 22)树脂催化反应

[0058] 混合好的物料经给料泵依次输送至换热器、树脂催化柱、闪蒸罐，可完成化学催化工艺，闪蒸后的物料酸价在0.5‑1mgKOH/g，可输送到脂肪酸甲酯精制车间进行进一步精制。

[0059] 其中，换热器为螺旋板换热器，采用蒸汽加热，将物料加热到130‑150℃。树脂催化生产方式为连续化生产，树脂催化柱可采用多组串联，多个催化柱串联，可根据生产情况随时更换。物料进入闪蒸罐时，温度在 110‑150℃，其中的甲醇和水会汽化，通过立式冷凝器回收到回收罐中。回收罐中含水甲醇可直接作为第一步的酶法工艺的原料。

[0060] 酶反应罐、沉降罐、加热釜和卧式冷凝器，可根据具体产能和生产要求调整设备数量和大小，以满足生产需要。

[0061] 与现在技术相比，本实用新型具有以下有益效果：

[0062] 本实用新型提供一种高酸价油生产生物柴油的双催化方法，首先采用固定化酶在略过量的甲醇条件下催化高油酸油脂转化为脂肪酸甲酯，反应平衡后，产物酸价在5‑8mgKOH/g左右，此时产物中含有少量甘油酯(＜ 1％，可在后期脂肪酸甲酯蒸馏精制过程分离)，水和甘油通过沉降分离，也可离心去除。随后采用树脂催化剂将游离脂肪酸转化为脂肪酸甲酯，最终底物酸价可降至0.5‑1mgKOH/g。后期的脂肪酸甲酯蒸馏、脱色等进一步的精制工艺，采用现有技术工艺即可，本实用新型双催化剂法得到的产品纯度更高，精制环节更简单。

[0063] 1、采用的固定化酶，相对于传统酶法工艺，可实现酶的重复使用。

[0064] 2、通过特殊的固定化工艺和反应条件，酶对甲醇的耐受性更强，甲醇可一次性加入到反应容器中。

[0065] 3、采用树脂催化剂来处理酶法游离脂肪酸转化不彻底问题，同时树脂催化剂可重复使用，补足了酶法的不足，并避免了大量污水产生。

[0066] 4、采用的固定化酶和树脂催化剂均可重复使用，降低生产成本。

[0067] 5、工艺过程中回收的含水甲醇，可直接作为酶法工艺原料，减少甲醇损耗，节省甲醇精制能耗。

[0068] 6、酶法工艺反应条件温和，利于甘油的后续精制，树脂催化剂也可重复使用，避免大量酸碱废水产生，环保节能。附图说明

[0069] 图1是本实用新型催化装置的一种结构示意图；

[0070] 图中：1、酶反应罐，2、酶回收器，3、沉降罐，4、加热釜，5、换热器，6、树脂催化柱，7、闪蒸罐，8、回收罐，9、第一冷凝器，10、第二冷凝器。

[0071] 下面通过具体实施例，并结合附图，对本实用新型的技术方案作进一步的具体说明。

[0072] 本实用新型提供了一种高酸价油生产生物柴油的双催化方法及装置。

[0073] 本实用新型所述的一种高酸价油生产生物柴油的双催化方法，包括以下步骤：

[0074] 步骤1：采用固定化脂肪酶在略过量的甲醇条件下催化高酸价油进行转化反应，反应平衡后，得到反应料液1；

[0075] 步骤2：采用树脂催化剂将步骤1的反应料液1中未转化的游离脂肪酸和甲醇转化为脂肪酸甲酯，反应结束后，经处理后，得到生物柴油。

[0076] 本实用新型一个实施例中，所述高酸价油的酸价为50‑150mgKOH/g；更优选的，高酸价油为高酸价餐厨油、高酸价米糠油等的至少一种，酸价为50‑150mgKOH/g。

[0077] 本实用新型一个实施例中，所述步骤1中，固定化脂肪酶为无锡优普克生物科技有限公司生产的 CTG 1090。该酶对短链醇有很强的耐受性，生产成本远低于进口固定化酶制剂。

[0078] 本实用新型一个实施例中，所述固定化脂肪酶可以通过如下方法制备：以耐热酵母基因工程菌为菌种，发酵得到脂肪酶，将所述脂肪酶进行固定化，所述固定化的方法为中国专利CN201811654095.3(发明专利名称：一种脂肪酶的固定化方法)中记载的方法；更优选的所述方法为：在Na2HPO4‑ 柠檬酸缓冲液中，将脂肪酶与大孔苯乙烯树脂载体固定，经洗涤干燥得到固定化脂肪酶。

[0079] 本实用新型一个实施例中，所述步骤1中，甲醇的质量为高酸价油质量的16‑20％。

[0080] 本实用新型一个实施例中，所述步骤1中，固定化脂肪酶的质量为高酸价油质量的2‑5％。其中，固定化脂肪酶的酶负载量为55000‑75000u/g，更优选为60000u/g。

[0081] 本实用新型一个实施例中，所述步骤1中，还加入高酸价油质量1‑5％的水，更优选为2％。

[0082] 本实用新型一个实施例中，所述步骤1中，反应温度为25‑40℃，反应时间为4‑12h。反应料液1的酸价为5‑8mgKOH/g，可根据酸价控制反应时间。

[0083] 本实用新型一个实施例中，所述步骤1中，反应调节pH为4.8‑5.2，更优选地通过氢氧化钠调节至pH4.8‑5.2，更优选pH为5。

[0084] 本实用新型一个实施例中，所述步骤1中，反应平衡后还对反应液进行沉降分离或离心分离，得到反应料液1；所述沉降分离为，将反应液静置0.5‑5h，静置后，水、甲醇和甘油的混合物沉至底部，并和脂肪酸甲酯分层，将静置并分层后的反应液进行上下层分离，取上层脂肪酸甲酯层为反应料液1。从而实现将反应液分离掉水、甲醇和甘油的目的；所述离心分离是指通过离心机进行离心，实现分离目的。

[0085] 本实用新型一个实施例中，所述步骤1中，反应液经沉降分离后得到的脂肪酸甲酯层，还含有微量的水和甲醇，会影响后续反应，可通过加热将其进一步去除。

[0086] 本实用新型一个实施例中，所述步骤2中，树脂催化剂为树脂酯化催化剂，树脂酯化催化剂为固体酸树脂催化剂；更优选的为型号Tulsimer T‑63MP的树脂催化剂。

[0087] 本实用新型一个实施例中，所述步骤2中，甲醇的质量为反应料液1 总质量的10‑15％。

[0088] 本实用新型一个实施例中，所述步骤2中，反应温度为110‑150℃，反应方式为连续化反应，酸价降至0.5‑1mgKOH/g，反应结束。

[0089] 本实用新型一个实施例中，所述步骤2中，生物柴油(即脂肪酸甲酯) 的酸价为0.5‑1mgKOH/g。

[0090] 本实用新型一个实施例中，所述步骤2中，处理包括分离步骤；更进一步，所述分离为将反应后的料液中的甲醇和水分离去除，更进一步，所述分离为反应后的料液于110‑150℃下经闪蒸罐，使甲醇和水汽化从而去除。更进一步，所述处理还包括精制。

[0091] 本实用新型一个实施例中，所述固定化脂肪酶可以通过如下方法制备：以耐热酵母基因工程菌为菌种，发酵得到脂肪酶，将所述脂肪酶进行固定化，所述固定化的方法参考中国专利CN201811654095.3(发明专利名称：一种脂肪酶的固定化方法)中记载的方法，得到固定化脂肪酶。

[0092] 更进一步，所述耐热酵母基因工程菌的制备及表达步骤如下：

[0093] 1、脂肪酶基因筛选方法：

[0094] 1)采用强力土壤DNA提取试剂盒(Powersoil DNA Isolation Kit)，从油脂厂(张家港中粮油脂)周围环境土壤中分离并纯化基因组DNA；

[0095] 2)以分离纯化的基因组DNA为样本，利用试剂盒(CopyControlTM Fosmid Library Production Kit)构建宏基因组Fosmid文库；

[0096] 3)Fosmid文库筛选脂肪酶基因

[0097] 筛选培养基(w/v)：0.5％酵母膏，1％蛋白胨，1％NaCl，1％橄榄油， 0.05％罗丹明B，2％琼脂粉

[0098] 稀释涂布法：将Fosmid文库菌液涂布在筛选培养基上，于37℃培养箱中培养2‑3天，挑取菌落周围形成较大透明圈的菌落，透明圈越大表明菌落产酶能力越强。

[0099] 4)脂肪酶基因鉴定

[0100] 利用质粒提取试剂盒从3)的Fosmid文库中挑取的单克隆菌株中提取质粒，并送上海生物工程有限公司测序，来源于Fosmid文库的新型脂肪酶基因序列如下所示。

[0101] 核苷酸序列SEQ ID NO.3：

[0102] ATGAGATATCATAGATTTCTGAGCATTCTGCTGATTTGCATGCTGT CAGCAGTTAGCATTTTTGCATTTCAAACATCAACAGCGGCAGCATCAA GAAATCCGGTTATTATGGTTCATGGCATTGGCGGCGCATCAAGCAATT TTGCAGGCATTAAAAGCTATCTGGTTTCACAAGGCTGGAGCGGCAGA AATCTGTATGCAGTTGACTTTTTCGATAAAACAGGCAATAATAGAAGA AATGCGAAACAACTGGCAGCATATCTGGATGAAGTGCTGAAGAAAAC AGGCAAAAGCAAAGTTGATATTCTGGCACATTCAATGGGCGGCGCAA ATACAATTTATTGGATTAAAAATCTGGATGGCGGCGATAAAGTTGAAC ATGTTCTGAGCCTGGGCGGCGCAAATAGACTGGTTACATCAACAGCA CCGGCAGGCACAGATCCGAATCAAAAAATTCTGTATACATCAATTTAT AGCACAACAGATTATCTGACACCGTATAGACTGTCAATTGATGGCGCA AAAAATGTGCTGATTCATGGCGTTGGCCATATTGGCCTTCTGACATCAT CACAAGTTAAAGGCTATGTTAAAGAAGGCCTGAATGGCGGCGGCCAA AAT

[0103] 对应的氨基酸序列SEQ ID NO.4：

[0104] MRYHRFLSILLICMLSAVSIFAFQTSTAAASRNPVIMVHGIGGASSNF AGIKSYLVSQGWSGRNLYAVDFFDKTGNNRRNAKQLAAYLDEVLKKTG KSKVDILAHSMGGANTIYWIKNLDGGDKVEHVLSLGGANRLVTSTAPA GTDPNQKILYTSIYSTTDYLTPYRLSIDGAKNVLIHGVGHIGLLTSSQVKG YVKEGLNGGGQN

[0105] 2、脂肪酶基因的克隆与表达

[0106] 利用SignalIP5.0预测Seq3的信号肽，去除信号肽后以毕赤酵母密码子偏好性进行密码子优化，优化基因命名为Seq4，将优化基因送上海生物工程有限公司进行合成，优化基因序列如下所示，并在P.pastoris GS115中表达。

[0107] 核苷酸序列SEQ ID NO.5：

[0108] TCTAGAAACCCAGTTATTATGGTTCATGGTATTGGTGGTGCTTCTT CTAACTTCGCTGGTATTAAGTCTTACTTGGTTTCTCAAGGTTGGTCTGG TAGAAACTTGTACGCTGTTGATTTCTTTGATAAGACTGGTAACAACAG AAGAAACGCTAAGCAATTGGCTGCTTACTTGGATGAAGTTTTGAAAA AGACTGGTAAATCTAAGGTTGATATTTTGGCTCATTCTATGGGTGGTGC TAACACTATCTACTGGATTAAGAACTTGGATGGTGGAGATAAGGTTGA ACATGTTTTGTCTTTGGGTGGTGCTAACAGATTGGTTACTTCTACTGCT CCAGCTGGTACTGATCCAAACCAAAAGATTTTGTACACTTCTATCTAC TCTACTACTGATTACTTGACTCCATACAGATTGTCTATTGATGGTGCTA AGAACGTTTTGATTCATGGTGTTGGTCATATTGGTTTGTTGACTTCTTC TCAAGTTAAGGGTTACGTTAAGGAAGGTTTGAACGGTGGTGGTCAAA AC

[0109] 对应的氨基酸序列SEQ ID NO.6：

[0110] SRNPVIMVHGIGGASSNFAGIKSYLVSQGWSGRNLYAVDFFDKTGN NRRNAKQLAAYLDEVLKKTGKSKVDILAHSMGGANTIYWIKNLDGGD KVEHVLSLGGANRLVTSTAPAGTDPNQKILYTSIYSTTDYLTPYRLSIDGA KNVLIHGVGHIGLLTSSQVKGYVKEGLNGGGQN

[0111] 利用限制性内切酶Not I和AvrII分别对合成的Seq4基因和pPIC9K空载体进行双酶切，利用T4 DNA连接酶16℃连接过夜,转化至E.coli JM109 感受态细胞，涂布于LB平板(含100μg/mL的Amp)，筛选出阳性转化子，并提取得到重组质粒pPIC9K‑Seq4。pPIC9K‑Seq4经限制性内切酶Sal I线性化后，利用电转化法(1500V,5ms)把重组质粒转化到宿主菌P. pastoris GS115中，并将转化物涂布于MD平板(含250μg/mL的G418)， 30℃培养2‑3d后，可挑取较大的阳性转化子菌落，提取酵母基因组利用引物3’‑AOX1和5’AOX1进行PCR验证，得到重组菌株GS115/pPIC9K‑Seq4。

[0112] 引物序列如下：

[0113] 3’‑AOX1 GCAAATGGCATTCATTCTGACATCC(SEQ ID NO.1)

[0114] 5’‑AOX1 GACTGGTTCCAATTGACAAGC(SEQ ID NO.2)

[0115] 将重组菌株GS115/pPIC9K‑Seq4在含有250μg/mL G418的YPD平板上划线，30℃培养2‑3d。挑取一环平板上的单菌落，接种至25mL BMGY 培养基中，30℃，200rpm振荡培养16‑20h至OD600为2‑6。6000r/min离心10min，收集菌体并用100mL的BMMY培养基重悬，28℃，
200rpm 振荡培养120h，每隔24h添加1％的甲醇诱导表达并且取样检测OD600、发酵液上清的蛋白浓度和酶活性。蛋白浓度的检测使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒进行定量。当甲醇诱导发酵至96h时，所有菌株的胞外总蛋白浓度均达到最高，因此，在发酵96h时收集发酵上清液。得到目标脂肪酶。脂肪酶活力检测数据约为100000u/ml左右。

[0116] 涉及到的培养基配方如下：

[0117] LB液体培养基：蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％，pH7.0。

[0118] YPD(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium):Yeast Extract 1％,Trypton2％,Dextrose 2％，制作平板时加入Agar 2％。121℃高压灭菌20min。用于筛选G418抗性时加入G418至终浓度为0.25mg/mL‑1.0mg/mL，即 YPD‑G418平板。

[0119] MD(Minimal Dextrose Medium):YNB 1.34％,Biotin 4×10‑5％,Dextrose 2％,Agar 2％。

[0120] MM(Minimal Methanol Medium):YNB1.34％,Biotin4×10‑5％,Methanol 0.5％,Agar2％。

[0121] BMGY(Buffered Glycerol‑complex Medium):Yeast Extract 1％,Trypton 2％,‑5YNB 1.34％,Biotin 4×10 ％,Glycerol 1％,磷酸钾溶液100mmol/L。

[0122] BMMY(Buffered Methanol‑complex Medium):Yeast Extract 1％,Trypton 2％,‑5YNB 1.34％,Biotin 4×10 ％,Methanol 0.5％,磷酸钾溶液100mmol/L。

[0123] 培养基中的单位为％(W/V)。

[0124] 脂肪酶活力测定方法：

[0125] 根据Kordel等(Kordel,M,B.Hofmann,D.Schomburg,and R.D.Schmid.1991.Extracellular lipase of Pseudomonas sp.strain ATCC 21808:
purification,characterization,crystallization,and preliminary X‑ray
diffraction data.J.Bacteriol.173:4836–4841)的方法，以对硝基苯酚棕榈酸酯 p‑nitrophenyl palmitate(p‑NPP)为底物进行酶活测定。酶活的定义：一定反应条件下每分钟产生1μmol对硝基苯酚的酶量为一个脂肪酶水解酶活国际单位。

[0126] 本实用新型一个实施例中，所述固定化脂肪酶的固定方法如下：

[0127] 1)将Na2HPO4溶液和柠檬酸溶液混合均匀，得到Na2HPO4‑柠檬酸缓冲液；

[0128] 2)将液体脂肪酶溶于Na2HPO4‑柠檬酸缓冲液中，调节pH值为7.5‑8.5，得到酶缓冲溶液；

[0129] 3)将载体加入酶缓冲溶液中，得到载体/脂肪酶混合液，然后将载体/ 脂肪酶混合液在空气浴摇床进行固定，经过滤、洗涤、干燥，得到固定化脂肪酶。

[0130] 更进一步，所述Na2HPO4溶液的浓度为0.2mol/L；所述柠檬酸溶液的浓度为0.1mol/L；所述Na2HPO4溶液和柠檬酸溶液的质量比为30～40：1。

[0131] 更进一步，所述Na2HPO4‑柠檬酸缓冲液pH值为8.0。

[0132] 更进一步，所述酶缓冲溶液中脂肪酶浓度为50g/L～150g/L。

[0133] 更进一步，所述载体为大孔苯乙烯树脂ECR1090M，孔径为900～ 1100A，表面积＞2
750m/g。

[0134] 更进一步，所述固定温度为20℃～40℃，转速为100rmp，固定时间为 3～8h。

[0135] 更进一步，所述载体/脂肪酶混合液中载体的含量为40～60mg/mL。

[0136] 本实用新型还提供一种高酸价油生产生物柴油的双催化装置，所述装置包括通过管道依次连通的酶反应罐1、沉降罐3、加热釜4、换热器5、树脂催化柱6和闪蒸罐7。

[0137] 本实用新型一个实施例中，所述酶反应罐1的下部设置有第一排料口和第二排料口。更优选地，所述酶反应罐1的第一排料口设有过滤装置，例如过滤筛网等可以实现固液分离的过滤装置，可以有效拦截固定化脂肪酶；更优选的，第一排料口通过管道直接与沉降罐3连通，此时，酶反应罐1内反应结束的物料通过第一排料口排出，在过滤装置作用下拦截固定化脂肪酶，过滤后的其他物料通过管道输送至沉降罐3内进行沉降。

[0138] 本实用新型一个实施例中，所述装置还包括酶回收器2，所述酶回收器2通过管道与酶反应罐1的第二排料口连通；所述酶反应罐1的固定化脂肪酶需要更换时，从第二排料口排出并通过管道输送至酶回收器2。

[0139] 本实用新型一个实施例中，所述酶反应罐1还配合设置有循环水系统，循环水温度为25‑40℃，用于保证酶反应罐1的温度。

[0140] 本实用新型一个实施例中，所述沉降罐3还通过管道连通向甘油精制车间，含有甘油的混合物通过管道输送至甘油精制车间。

[0141] 本实用新型一个实施例中，所述加热釜4配合设置有蒸汽加热源，更优选的还配合设置有冷却水系统。

[0142] 本实用新型一个实施例中，所述装置还包括有回收罐8。

[0143] 本实用新型一个实施例中，所述加热釜4配合设置有第一冷凝器9；更优选的所述第一冷凝器9配合设置有冷却水循环系统；更优选的所述第一冷凝器9为卧式冷凝器。更优选的所述第一冷凝器9通过管道连通回收罐8。第一冷凝器9将加热釜4加热蒸出的水和甲醇冷凝回收，并通过管道输送至回收罐8。

[0144] 本实用新型一个实施例中，所述换热器5为螺旋板换热器。

[0145] 本实用新型一个实施例中，所述树脂催化柱6为填充有固体酸树脂催化剂的树脂催化柱，更优选的固体酸树脂催化剂为型号Tulsimer T‑63MP的树脂催化剂，包含但不限于此型号。树脂催化柱可多组串联，便于连续化生产及更换。

[0146] 本实用新型一个实施例中，所述闪蒸罐7配合设置有第二冷凝器10；更优选的所述第二冷凝器10为立式冷凝器。更优选的所述第二冷凝器10 通过管道连通回收罐8。第二冷凝器10将闪蒸罐7汽化的甲醇和水冷凝，并通过管道输送至回收罐8。

[0147] 本实用新型的实施例中，所述管道上按需设置有给料泵，对管道内的物料进行输送；更优选的，连通酶反应罐1和沉降罐3的管道、连通沉降罐3和加热釜4的管道、连通加热釜4和换热器5的管道上分别设有给料泵。

[0148] 本实用新型的实施例中，各管道与装置的连接处还配合设置有阀门。

[0149] 以下通过具体实施例进行进一步详细说明本实用新型所述的高酸价油生产生物柴油的双催化方法及装置。

[0150] 实施例1

[0151] 一种高酸价油生产生物柴油的双催化装置，所述装置包括通过管道依次连通的酶反应罐1、沉降罐3、加热釜4、换热器5、树脂催化柱6和闪蒸罐7。

[0152] 实施例2

[0153] 在实施例1的基础上，所述酶反应罐1的下部设置有第一排料口和第二排料口。所述酶反应罐1的第一排料口设有过滤装置，可以有效拦截固定化脂肪酶。第一排料口通过管道直接与沉降罐3连通，此时，酶反应罐 1内反应结束的物料通过第一排料口排出，在过滤装置作用下拦截固定化脂肪酶，过滤后的其他物料通过管道输送至沉降罐3内进行沉降。

[0154] 实施例3

[0155] 在实施例2的基础上，所述酶反应罐1还配合设置有循环水系统，循环水温度为25‑40℃，用于保证酶反应罐1的温度。

[0156] 实施例4

[0157] 在实施例3的基础上，所述加热釜4配合设置有蒸汽加热源，和冷却水系统。

[0158] 实施例5

[0159] 在实施例4的基础上，所述换热器5为螺旋板换热器。

[0160] 实施例6

[0161] 在实施例5的基础上，所述树脂催化柱6为填充有固体酸树脂催化剂的树脂催化柱，更优选的固体酸树脂催化剂为型号Tulsimer T‑63MP的树脂催化剂，包含但不限于此型号。树脂催化柱可多组串联，便于连续化生产及更换。

[0162] 实施例7

[0163] 在实施例6的基础上，所述装置还包括有回收罐8。

[0164] 实施例8

[0165] 在实施例7的基础上，所述加热釜4配合设置有第一冷凝器9；所述第一冷凝器9配合设置有冷却水循环系统；所述第一冷凝器9为卧式冷凝器。所述第一冷凝器9通过管道连通回收罐8。第一冷凝器9将加热釜4 加热蒸出的水和甲醇冷凝回收，并通过管道输送至回收罐8。

[0166] 实施例9

[0167] 在实施例8的基础上，所述闪蒸罐7配合设置有第二冷凝器10；所述第二冷凝器10为立式冷凝器。所述第二冷凝器10通过管道连通回收罐8。第二冷凝器10将闪蒸罐7汽化的甲醇和水冷凝，并通过管道输送至回收罐 8。

[0168] 实施例10

[0169] 在实施例9的基础上，所述装置还包括酶回收器2，所述酶回收器2 通过管道与酶反应罐1的第二排料口连通；所述酶反应罐1的固定化脂肪酶需要更换时，从第二排料口排出并通过管道输送至酶回收器2。更优选的第二排料口位于酶反应罐1底部中间位置。利于固定化脂肪酶的沉降和排出。

[0170] 实施例11

[0171] 在实施例10的基础上，所述沉降罐3还通过管道连通向甘油精制车间，含有甘油的混合物通过管道输送至甘油精制车间。

[0172] 实施例12

[0173] 基于实施例10的装置，所述装置的工艺，包括如下步骤：

[0174] 步骤1固定化脂肪酶催化反应在酶反应罐1完成：

[0175] 11)投料

[0176] 初次生产，先将高酸价油脂投入酶反应罐1，初始原料用氢氧化钠调至pH4.8‑5.2，再加入高酸价油脂重量16％‑20％的甲醇，最后加入2％左右的水，加料过程中开启搅拌，开启循环水系统，循环水温度25℃‑40℃；更优选的甲醇可以在反应过程中采用流加方式加入；

[0177] 12)酶反应

[0178] 通过酶反应罐1人孔加入底物总重2‑5％的固定化脂肪酶，开始反应；维持搅拌和罐内温度稳定，根据终点酸价控制反应时间，终点酸价在 5‑8mgKOH/g左右，反应时间在4‑12h左右。

[0179] 13)放罐和再次投料

[0180] 酶反应罐1底部设有第一排料口和第二排料口，其中罐底的第一排料口配合设有过滤装置，可以有效拦截固定化脂肪酶，第二排料口没有过滤装置，可将罐内的固定化酶排出至酶回收器2中回收；酶反应结束，物料通过给料泵输送到沉降罐3；正常连续生产时，不需要将固定化脂肪酶排出罐外，只需要依次加入高酸价油、甲醇、水，开启搅拌和循环系统，即可继续生产；由于反应过程中固定化酶不可避免会有损失和失活，必要时需补充。反应采用酶反应罐间歇批次法形式，一批次反应结束后进行放罐，并进行物料的补加，继续进行生产；

[0181] 14)沉降

[0182] 物料进入沉降罐3中静置0.5‑5h，水、甲醇和甘油的混合物会在沉降罐3底部汇集，沉降罐3内物料实现分层，下层物料通过给料泵输送到甘油精制车间，上层物料通过给料泵输送到加热釜4；

[0183] 15)脱水、甲醇

[0184] 上层物料中还含有微量的水和甲醇，水会影响步骤2的树脂催化反应，通过加热釜4和卧式冷凝器9，将水和甲醇回收，最后存于回收罐8中。加热釜4配套设有蒸汽加热源，卧式冷凝器9配套设有冷却水循环系统；

[0185] 步骤2树脂催化反应：

[0186] 21)加入甲醇

[0187] 完成蒸馏操作后，将加热釜4的加热蒸汽切换成冷却水，将物料降温到甲醇沸点以下，再次加入甲醇，添加量为底物总质量的10‑15％，混合均匀；

[0188] 22)树脂催化反应

[0189] 混合好的物料经给料泵依次输送至换热器5、树脂催化柱6、闪蒸罐7，可完成化学催化工艺，闪蒸后的物料酸价在0.5‑1mgKOH/g，可输送到脂肪酸甲酯精制车间进行进一步精制。

[0190] 其中，换热器5为螺旋板换热器，采用蒸汽加热，将物料加热到 130‑150℃。树脂催化生产方式为连续化生产，树脂催化柱6可采用多组串联，多个催化柱串联，可根据生产情况随时更换。物料进入闪蒸罐7时，温度在110‑150℃，其中的甲醇和水会汽化，通过立式冷凝器10回收到回收罐8中。回收罐8中含水甲醇可直接作为第一步的酶法工艺的原料。

[0191] 酶反应罐1、沉降罐3、加热釜4和卧式冷凝器9，可根据具体产能和生产要求调整设备数量和大小，以满足生产需要。

[0192] 实施例13

[0193] 基于实施例10的装置，准确称取2kg高酸价酶法脱胶米糠油 (91.42mgKOH/g)，加入0.32kg甲醇、0.04kg水，搅拌均匀，将底物加热到30℃，反应pH为5.0，加入0.04kg固定化脂肪酶，反应8小时，过滤回收固定化酶，滤液静置2h分层，分液去除下层的水、甲醇和甘油的混合物，上层蒸馏去除残留水和甲醇。测得上层物料酸价为5.85mgKOH/g。再次用回收的固定化脂肪酶重复上述试验，连续使用15个批次，酸价最高批次为7.72mgKOH/g，酶活力没有显著降低，稳定性良好，寿命长。

[0194] 收集上述15个批次的上层物料，混合均匀，测得酸价6.78mgKOH/g。以树脂催化剂质量占上层物料质量3％用树脂催化剂中试设备继续进行树脂催化反应，3h后酸价降低到0.82mgKOH/g。

[0195] 实施例14

[0196] 称取5kg高酸价餐厨油(124.75mgKOH/g)，加入0.9kg甲醇、0.1kg 水，搅拌均匀，将底物加热到25℃，反应pH为5.2，加入0.1kg固定化脂肪酶，反应12小时，过滤回收固定化酶，滤液静置4h分层，分液去除下层的水、甲醇和甘油的混合物，上层蒸馏去除残留水和甲醇。测得上层物料酸价为7.12mgKOH/g。

[0197] 以树脂催化剂质量占上层物料质量1％将上层物料继续在树脂催化柱下进行反应4h，酸价降低至0.91mgKOH/g。

[0198] 实施例15

[0199] 称取1kg高酸价餐厨油(66.78mgKOH/g)，加入0.18kg甲醇、0.02kg 水，搅拌均匀，将底物加热到35℃，反应pH为4.8，加入0.02kg固定化脂肪酶，反应10小时，过滤回收固定化酶，滤液静置1h分层，分液去除下层的水、甲醇和甘油的混合物，上层蒸馏去除残留水和甲醇。测得上层物料酸价为5.52mgKOH/g。

[0200] 以树脂催化剂质量占上层物料质量5％将上层物料继续在树脂催化柱下进行反应1h，酸价降低至0.67mgKOH/g。

[0201] 以上所述的实施例只是本实用新型的较佳方案，并非对本实用新型作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。