深红沙雷氏菌及其应用 |
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| 申请号 | CN202210836233.X | 申请日 | 2022-07-15 | 公开(公告)号 | CN116355782A | 公开(公告)日 | 2023-06-30 |
| 申请人 | 海南大学; | 发明人 | 刘柱; 彭欣; 唐燕琼; 李宏; 李娟娟; 马香; 林敏; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及深红沙雷氏菌(Serratia rubidaea)在制备 有机肥 方面的应用，其中，所述深红沙雷氏菌于2022年7月6日保藏于湖北省武汉市的中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号为CCTCC M 20221042。本 申请 不仅解决了低值鱼、鱼肉实用废料等的资源浪费问题，实现了废弃资源的重新利用，而且利用本申请的深红沙雷氏菌制备的 氨 基酸 肥料 高肥效、无污染、无公害，节约生产成本并可在一定程度上减轻环境污染。 | ||||||
| 权利要求 | 1.深红沙雷氏菌(Serratia rubidaea)在制备有机肥方面的应用，其中，所述深红沙雷氏菌于2022年7月6日保藏于湖北省武汉市的中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号为CCTCC M 20221042。 |
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| 说明书全文 | 深红沙雷氏菌及其应用技术领域背景技术[0002] 土壤环境的恶化带来了作物减产的问题，增加作物产量、合理科学的施肥具有重大意义。很早之前，化肥因其制作成本低，成分稳定，容易保存等优点，受到了广泛的使用。随着绿色农业的不断发展，传统化肥的弊端也逐渐展示出来：有效成分单一，肥料利用率低，过度使用可导致水体的富营养化，且施用后会造成土壤污染与板结等。高肥效、无污染、无公害的生物液肥，更符合绿色农业的发展要求。目前，利用生物菌剂发酵培养的生物液肥价格还比较高昂，因此开发出一种更加经济实惠的肥料生产方式仍是目前研究的热点。 发明内容[0003] 针对现有技术中存在的技术问题，本发明提出了深红沙雷氏菌(Serratia rubidaea)在制备有机肥方面的应用，其中，所述深红沙雷氏菌于2022年7月6日保藏于湖北省武汉市的中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC M，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为CCTCC M 20221042。 [0004] 一种有机肥，包括：深红沙雷氏菌及供其分解的介质；或者包括介质被深红沙雷氏菌分解后获得的发酵液或发酵液清液；其中，所述深红沙雷氏菌于2022年7月6日保藏于湖北省武汉市的中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为CCTCC M 20221042。 [0005] 如上所述的有机肥，所述介质为富含蛋白质的动物实用废料，包括但不限于鱼类实用废料、虾类实用废料、蟹类实用废料、或者贝壳类实用废料。 [0006] 如上所述的有机肥，所述介质为金枪鱼实用废料。 [0007] 如上所述的有机肥，其为氨基酸肥料。 [0008] 如上所述的有机肥，其为氨基酸液肥。 [0009] 一种如上所述的有机肥的制备方法，包括：提供供沙雷氏菌分解的介质；对所述介质灭菌处理；接种深红沙雷氏菌至灭菌处理后的介质；以及发酵所述深红沙雷氏菌；其中，发酵的温度为25‑30℃，或者30‑35℃；发酵时间为12‑16小时。 [0010] 一种深红沙雷氏菌(Serratia rubidaea)制备的有机肥在提高植物种子发芽率、促进植物生长方面的应用，其中，所述深红沙雷氏菌于2022年7月6日保藏于湖北省武汉市的中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为CCTCC M 20221042。 [0011] 一种提高植物种子发芽率的方法，包括：获取如上任一所述的有机肥；以及将所述有机肥与植物种子、培养植物的培养基或者播种的土壤混合。 [0012] 一种促进植物生长的方法，包括：获取如权上任一所述的有机肥；以及将所述有机肥喷施至植物叶面，或者施予植物生长的土壤。 [0013] 本申请不仅解决了低值鱼、鱼肉实用废料等的资源浪费问题，实现了废弃资源的重新利用，而且利用本申请的深红沙雷氏菌制备的氨基酸肥料高肥效、无污染、无公害，节约生产成本并可在一定程度上减轻环境污染。附图说明 [0014] 下面，将结合附图对本发明的优选实施方式进行进一步详细的说明，其中： [0015] 图1是根据本申请一个实施例对从土壤中分离的产酶菌株的筛选鉴定，其中，图1A为根据本申请一个实施例的酪蛋白平板筛选时R3菌株产生的水解圈图；图1B为根据本申请一个实施例的用16S引物扩增细菌基因后所获的PCR产物的凝胶电泳分离图谱；图1C是根据本申请一个实施例的通过序列比对后获得的产蛋白酶菌株系统进化树；以及[0016] 图2是根据本申请一个实施例的深红沙雷氏菌发酵鱼肉实用废料后获得的氨基酸肥料对菜心种子萌发及生长的影响。 具体实施方式[0017] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。 [0018] 在以下的详细描述中，可以参看作为本申请一部分用来说明本申请的特定实施例的各个说明书附图。在附图中，相似的附图标记在不同图式中描述大体上类似的组件。本申请的各个特定实施例在以下进行了足够详细的描述，使得具备本领域相关知识和技术的普通技术人员能够实施本申请的技术方案。应当理解，还可以利用其它实施例或者对本申请的实施例进行结构、逻辑的改变。 [0019] 本申请涉及的相关术语具有以下含义： [0020] 术语“Serratia rubidaea”、“深红沙雷氏菌”是指沙雷氏菌属(Serratia)的一个菌种，是革兰氏阴性小杆菌，可分泌蛋白酶。沙雷氏菌属在自然界中分布非常广泛，可存在于水，植物叶片，土壤以及人类呼吸道和肠道内。早期沙雷氏菌属一直被认为是非致病菌，但近期沙雷氏菌逐渐作为一种条件致病菌受到了人们的广泛关注。但截至目前未见沙雷氏菌可以使植物致病的报道。 [0021] 在本申请中，深红沙雷氏菌分离自海南红树林土壤，为本实验室自行分离、保藏。在本申请中，深红沙雷氏菌(Serratia rubidaea)于2022年7月6日保藏于湖北省武汉市的中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为CCTCC M 20221042。 [0022] 术语“发酵”在本申请中是指利用深红沙雷氏菌降解介质获得氨基酸肥料。在一些实施例中，介质为富含蛋白质的动物实用废料。 [0023] 术语“介质”可以是鱼类、虾类、蟹类、贝壳类等的未经灭菌处理的实用废料。当介质经灭菌处理后，即变成供深红沙雷氏菌发酵分解的培养基。在一些实施例中，灭菌处理为将介质置于灭菌锅中灭菌，灭菌条件为121℃，15‑25min，优选为20min；或者灭菌条件为117℃，20‑40min，优选为30min。在一个实施例中，介质是金枪鱼鱼肉实用废料。在一个实施例中，介质时金枪鱼匀浆。在一些实施例中，介质中可加入适量纯水。 [0024] 本领域技术人员应当了解，深红沙雷氏菌可以分泌蛋白酶，而鱼类、虾类、蟹类及贝壳类等水产的肉质实用废料均以蛋白质为主要成分，因此，鱼类、虾类、蟹类及贝壳类等以蛋白质为主要成分的物质均可以作为本申请深红沙雷氏菌发酵的介质。在本申请中，金枪鱼鱼肉实用废料作为介质仅为本申请的一个实施例，不以此限定介质的种类。 [0025] 术语“实用废料”是指鱼类、虾类、蟹类、贝壳类等富含蛋白质的物质被加工后残余分离的下脚或肥料，其中含有丰富的蛋白质，以便于深红沙雷氏菌对其分解。在一些实施例中，实用废料为罐头、食品加工后的肥料。 [0027] 术语“有机肥”在本申请中是指深红沙雷氏菌降解介质后获得的氨基酸肥料。在一些实施例中，有机肥料可以是固体肥料、液体肥料，也可以是固液混合的肥料。本申请不限定有机肥的固、液形态，本领域技术人员可以根据实际需要选择合适形态的有机肥。在一个实施例中，本申请的有机肥是指利用沙雷氏菌降解介质后获得的氨基酸液态肥料。进一步地，本申请的有机肥是指利用沙雷氏菌降解金枪鱼后获得的氨基酸液态肥料。 [0028] 术语“福林酚法(Lowry法)”是灵敏的蛋白质测定方法之一，可用于测定蛋白酶活力。本申请利用福林酚法测定多株菌株所分泌的蛋白酶的活力，用以筛选合适菌株。 [0029] 术语“蛋白酶酶活”、“蛋白酶活力”具有相同的含义，是指是指在特定条件(25℃，其它为最适条件)下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。在本申请中，酶活单位定义为40℃条件下1mL酶液每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸对应消耗的酶量为1个蛋白酶活力单位，用U/mL表示。根据本申请的一个实施例，根据以下公式计算蛋白酶酶活： [0030] 酶活力(U/mL)＝OD680×K×(4/10)×N [0031] 术语“液质联用”、“LC‑MS”是指又叫液相色谱‑质谱联用技术，它以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。本申请中使用液质联用仪测定下脚富含蛋白质的介质被深红沙雷氏菌降解前后的氨基酸含量变化。 [0032] 随着现代节水灌溉技术的成熟，液肥的生产和使用也得到了迅速的发展。氨基酸液肥作为液体肥料中的一种，具有肥效快，清洁无污染，改善作物品质，增加植物的代谢和抗逆能力，改善土壤理化性质，提高保水保肥能力等优点。利用动植物的实用废料发酵或水解来制备氨基酸液肥，不仅可以实现对废弃蛋白资源的重新利用，增加产品的附加值，制成的液肥还可以用来提高农作物的产量和品质。但目前还未有报道使用深红沙雷氏菌制备氨基酸液肥。 [0033] 水解制备氨基酸液肥的方法包括：酶水解、酸水解及碱水解。酶水解需要在比较温和的条件下进行，对反应条件的控制比较严格；酸水解过程中的水解产物有异味，产生的酸液也会对环境造成污染；碱水解则会使L型氨基酸变成D型且水解方法不存在专一性。与酸碱水解和酶水解相比，将产蛋白酶的菌株直接加入实用废料中进行微生物发酵，在很大程度上节约了生产成本，被认为是处理动植物实用废料最经济且有效的手段。 [0034] 鱼类产品的加工过程中，鱼肉资源并不能得到充分的利用，会产生60％以上的实用废料，其中富含鱼蛋白。微生物逐渐作为制备高效和安全的生物液肥的基础，在现代农业生产中有着广泛的应用。利用生物降解生产出的液肥，具有以下特点：肥料利用效率高，用量少；养分吸收快，肥效好；针对性强；便于喷施，经济环保；可以补充作物根部对养分吸收的不足。以鱼肉实用废料为原料，利用深红沙雷氏菌进行发酵，将其制备成氨基酸液肥，通过叶面喷施、种子浸泡、培养基或土壤混合等方式来提高农作物的产量和品质，不仅可以实现对废弃鱼蛋白资源的重新利用，增加鱼类产品的附加值，不仅能实现能源的二次利用，还能在一定程度上减轻环境污染。 [0035] 本发明的目的是提供一种沙雷氏菌及其应用，该菌可以通过降解鱼类实用废料来生产氨基酸液肥。通过种子萌发实验，证明了生产出的液肥可以促进菜心种子的萌发。本领域技术人员应当了解，氨基酸肥料的肥力不仅体现在种子萌发时期，作物生长的各个阶段均需要大量的各种氨基酸摄取。本申请以种子萌芽为例说明该氨基酸肥料的效力，但是将本申请由深红沙门氏菌发酵获得的氨基酸各种形式的氨基酸肥料用于植物生长的各个时期，均在本申请的保护范围之内。 [0036] 根据本申请的一个实施例，深红沙雷氏菌发酵鱼肉制备氨基酸液肥的方法，包括以下步骤： [0037] 将鱼肉实用废料打成匀浆，加入适量纯水，121℃灭菌20min。 [0038] 将深红沙雷氏菌接种于灭菌后的鱼肉培养基中，在30℃，pH为6条件下培养12‑16h，获得发酵液。 [0039] 将发酵液5000rpm离心，去菌体，上清即为所得的氨基酸液肥原液。 [0040] 下面将通过实施例描述本申请的技术方案： [0041] 实施例1：土壤菌株的分离、纯化及蛋白酶酶活测定 [0042] 根据本申请的一个实施例，可以从红树林的土壤中分离、纯化细菌，检测其产蛋白酶的活性。 [0043] 1.制备土壤稀释液。称取10g红树林土壤，将其混于100mL无菌水中。得到的上清液即为土壤原液。 [0044] 然后将土壤原液稀释10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍等。按土壤原液的稀释倍数，将试管分别标号为0，1，2，3，4，5，6。 [0045] 2.涂板。将步骤1中各试管中的微生物，涂布于酪蛋白固体培养基上，利用封口膜封装。根据实验及统计的需求，可以将每个稀释度的溶液涂布于多个固体培养基表面。例如将每个稀释度的溶液均涂布于3个固体培养基表面。 [0046] 3.微生物培养。将涂布细菌的固体培养基放置在30度恒温环境中培养12小时以上。 [0047] 4.计数。计算每个酪蛋白固体培养基上能产生水解圈的菌落个数，观察其菌落形态特征，并记录结果。 [0048] 5.平板划线分离。将上述步骤中得到的菌落划线分离，置于适合温度重新培养。如此操作，不仅可以将单克隆菌种分离，还可以对单克隆菌种扩繁和保存，且利于后续测序、分类试验。 [0049] 6.菌种保存和鉴定。 [0050] 7.福林酚法测酶活。表1为根据本申请一个实施例的福林酚法测酶活的参数列举。 [0051] 图1是根据本申请的一个实施例对从土壤中分离的产酶菌株的筛选鉴定。图1A为酪蛋白平板筛选时R3菌株产生的水解圈图，从图中可以看出，R3菌株外表呈红色，可使酪蛋白平板产生水解圈。图1B是用16S引物扩增细菌基因后所获的PCR产物的凝胶电泳分离图谱；图1C是通过序列比对后获得的产蛋白酶菌株系统进化树，通过序列比对分析，鉴定该菌是深红沙雷氏菌(Serratia rubidaea)。 [0052] [0053] 表1福林酚法测酶活参数 [0054] 实施例2：鉴定菌株种类 [0055] 根据本申请的一个实施例，可以用16S通用引物对菌株种类进行初步鉴定。根据本申请的一个实施例，可以直接将菌株作为底物进行菌种鉴定，也可以先提取基因组DNA，将基因组DNA作为底物进行菌种鉴定。 [0056] 1.进行16S rDNA的PCR扩增。选用通用引物27F和1492R进行PCR扩增，其中27F和1492R的DNA序列如下： [0057] 27F：5’‑AGAGTTTGATCCTGGCTCAG‑3’； [0058] 1492R：5’‑GGTTACCTTGTTACGACTT‑3’。 [0059] 根据选取的不同DNA聚合酶，选择适合的PCR反应体系以及反应条件。本申请不限定任何种类DNA聚合酶的使用，也不限定使用同一种DNA聚合酶后PCR反应体系与反应条件。例如，选用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增时，可参考如表1所列的反应体系： [0060] [0061] [0062] 表2PCR体系表(50μL) [0063] PCR的反应条件为：首先进行预变性，条件为94℃、5min，然后进入循环程序，每个循环程序是94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min 30s，进行30个循环，最后72℃保温7min。 [0064] 根据本申请的一个实施例，使用琼脂糖凝胶电泳检测以提取的基因组DNA为模板经16S通用引物进行PCR后得到的DNA片段的含量与品质。图1B为根据本申请的一个实施例为根据所提取的细菌基因组DNA为模板经16S通用引物进行PCR后得到的DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图。如图1B所示，3组实验均得到条带单一、浓度符合后续测序鉴定需求的PCR产物。 [0065] 2.菌株种类鉴定。根据本申请的一个实施例，可以对上述实验得到的PCR产物测序处理。将得到的测序结果与现有菌种序列进行比对，最终得到所鉴定菌株的种类。例如，将测序得到的结果输入至NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行blast，即可得到所鉴定菌株种类。图1C是根据本申请的一个实施例，采用16S引物对所分离的菌株进行PCR扩增获得16S rDNA，并通过序列比对后获得的系统进化树，鉴定得到的是深红沙雷氏菌(Serratia rubidaea)。根据图1C中所示的系统进化树，可以很清晰的看出本申请的深红沙雷氏菌(Serratia rubidaea)与其他细菌种属的进化关系。 [0066] 实施例3：氨基酸液肥的制备 [0067] 1.鱼肉培养基的制备 [0068] 从市场上购买金枪鱼实用废料，用绞肉机将其搅碎成匀浆，按照不同比例金枪鱼匀浆：水(1：1，1：4，1：9，1:19)制作培养基，将制成的鱼肉培养基于121℃高温灭菌20min。 [0069] 2.氨基酸液肥的发酵 [0070] 在灭好菌的鱼肉培养基中添加1％的深红沙雷氏菌菌株，在30℃，150rpm转速下发酵24h。 [0071] 3.发酵前后氨基酸含量的测定 [0072] 通过液质联用(LC‑MS)测定发酵前后鱼肉培养基中的氨基酸的含量变化，确定深红沙雷氏菌发酵效果。其中，发酵前后氨基酸含量如表3所示。 [0073] [0074] 表3发酵前后氨基酸含量表 [0075] 实施例4：种子萌发实验 [0076] 1.挑选大小相对一致，颗粒饱满，无病虫伤害的菜心种子，放在75％的乙醇中浸泡5min，然后用超纯水清洗干净。 [0077] 2.氨基酸液肥浓度设置为50、100、150、200、300、400mg/L六个浓度梯度，用市场上购买的氨基酸液肥作为阳性对照，用清水做阴性对照。每组选取35颗种子均匀播撒在直径为10cm且铺有各处理液浸润的滤纸片的平板内，置于光照培养箱中，每天12h光照培养。每个处理设置三个重复。 [0078] 3.每天向平板内添加各对应处理的液体数滴，以浸润滤纸片且稍有剩余为准，每隔12h记录一次种子的发芽情况，并记录种子萌发三天后的根及芽长，确定不同处理对种子萌发过程的影响。 [0079] 图2是根据本申请的一个实施例的深红沙雷氏菌发酵鱼肉实用废料后对菜心种子萌发及生长的影响。图2A及图2B均为萌发3天后的结果。其中，图2A中纵轴依次表示为使用清水、使用50mg/L本申请的氨基酸液肥、使用100mg/L本申请的氨基酸液肥、使用150mg/L本申请的氨基酸液肥、使用200mg/L本申请的氨基酸液肥以及使用市场上购买的商用氨基酸液肥浸泡种子处理；横轴表示每种处理方式重复10次。图2B中纵坐标表示种子发芽后的根长与芽长，横坐标表示上述清水、不同浓度本申请氨基酸液肥及商用液肥处理种子。表4为不同时间段内的种子萌发率。结合图2A‑图2B及表4可以明显看出，本申请发酵生产出的氨基酸液肥，可以促进菜心的萌发，与市场购买的氨基酸液肥有想要相同的生理功能，说明该发酵液可以在一定程度上替代市场上的氨基酸液肥。进一步地，本申请发酵产生的氨基酸液肥处理过的种子生长质量无论在根伸长还是出芽长度，均好于清水处理和市场购买的氨基酸液肥处理的种子。 [0080] [0081] [0082] 表4种子萌发率 [0083] 本发明公开的深红沙雷氏菌是从海南红树林的土壤中分离的，用深红沙雷氏菌发酵鱼肉实用废料制备氨基酸液肥，通过种子浸泡方式明显提高了种子的发芽率。既实现了对废弃鱼蛋白资源的重新利用，又能促进种子的萌发。 [0084] 上述实施例仅供说明本发明之用，而并非是对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明范围的情况下，还可以做出各种变化和变型，因此，所有等同的技术方案也应属于本发明公开的范畴。 |
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