[0001] 本发明属于微生物菌技术领域，涉及一种空气芽孢杆菌菌株及其用途。

[0002] 煤炭开采及加工过程会产生大量煤矸石，一般占煤炭总产量10％～15％,目前我国有煤石山1500多座，侵占土地约1.5x104 km,已成为我国产出量最大的工业固体废物之一。大量煤矸石无序堆放，污染水土，破坏生态环境。煤矸石具有硫分含量高、养分含量低、持水保肥性能差等特点对于矸石堆场生态恢复工作造成极大因难。

[0003] 近年来煤矸石的利用方式主要有：作为燃料替代煤炭或掺入煤炭；生产化工产品以及新型材料；提取稀有元素；用作建筑材料，主要是制砖、制作水泥、用作混凝土掺和料、制作保温材料以及用作筑路和填充材料。煤矸石作为燃料时，含碳量太低，导致效率低下；作为建筑材料时，由于煤矸石中的硫、有机质等的氧化，会导致鼓包、粉化，硫、磷、氮等成份还会影响煤矸石制品的强度和质量。所以，煤矸石未得到有效利用。

[0004] 煤矸石中的有机质含量一般在15％～25％，并含有丰富的植物生长所需的氮、磷、钾、钙等元素，因此，可将其用作制备微生物矿物肥料的原料；但是由于煤矸石所含的磷、钾等成份大多以难溶的矿物形式存在，不能被植物直接吸收利用；而添加外源微生物是提升煤矸石肥力的方法之一，该法是利用微生物自身代谢以及微生物与煤矸石之间相互作用来改善煤矸石养分含量，具有高效、经济、清洁并能减轻污染物对人类健康危害等优点；解磷细菌是一类能分泌胞外磷酸酶和有机酸的细菌总称，能使煤矸石中难溶性无机磷和钾释放，转化为能被植物吸收的有效磷、速效钾、有交换性钙、水解氮等，从而促进植物对其的吸收利用；利用解磷细菌、解钾细菌处理煤矸石可明显提高其养分含量；例如专利申请202010819005.2，一种纺锤形赖氨酸芽孢杆菌菌株及其用途，从风化的煤矸石及其附近土壤中分离提取获得菌株，用于解离煤矸石中的磷、钾、钙和氮，但是这种方法存在采用静止培养方式，解离温度不高于37℃，解离体系的pH为8，低于现有巨大芽孢杆菌解离体系的pH，使得菌的解离条件受到限制，不能满足更多解离场合。

[0005] 为了解决上述煤矸石解离菌存在的技术问题，本发明旨在提供一种空气芽孢杆菌菌株及其应用，从玉米地根际土壤中培育筛选得到的空气芽孢杆菌菌株具有很好的耐碱性和耐高温性，解离条件应用范围广，能用于高效解离煤矸石的钾元素、磷元素和氮元素。

[0006] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

[0007] 一种空气芽孢杆菌菌株，所述空气芽孢杆菌菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 20232075；保藏时间是2023年10月30日。

[0008] 进一步限定，所述空气芽孢杆菌菌株的16S rDNA基因序列如序列表No.1。

[0009] 进一步限定，所述空气芽孢杆菌菌株是从玉米地根际土壤中培育筛选得到的。

[0010] 空气芽孢杆菌菌株在解离煤矸石中磷、钾和水解氮的应用。

[0011] 进一步限定，所述空气芽孢杆菌菌株解离煤矸石中磷、钾和水解氮的过程是：将空气芽孢杆菌菌株接入LB液体培养基中，扩大培养至对数期，放置于恒温摇床中充分混匀；然后加入煤矸石，在温度40～50℃，pH 8～9范围下，培养4～5天；所述每g煤矸石对应接种2.5ml空气芽孢杆菌菌株菌剂。

[0012] 进一步限定，所述LB液体培养基是由5g蛋白胨、5g氯化钠、1g牛肉膏、2g酵母膏和1000mL蒸馏水混合而成的，LB液体培养基的pH为7.4。

[0013] 一种用于解离煤矸石中磷、钾和水解氮的制品，所述制品的活性成分包括或是空气芽孢杆菌菌株。

[0014] 可以理解为，一种用于解离煤矸石中磷、钾和水解氮的制品，制品的活性成分是空气芽孢杆菌菌株。将空气芽孢杆菌菌株作为活性成分用来制备解离煤矸石中磷、钾和水解氮的制品，这种制品中的活性成分对煤矸石中速效钾、有效磷和水解氮均有较好的解离作用。

[0015] 还可以理解为，一种用于解离煤矸石中磷、钾和水解氮的制品，制品的活性成分包括空气芽孢杆菌菌株，也就是说制品的活性成分还包括制备制品的常规活性成分，这些常规活性成分与空气芽孢杆菌菌株混合，共同对煤矸石中速效钾、有效磷和水解氮均有较好的解离作用。

[0016] 一种用于解离煤矸石中磷、钾和水解氮的菌剂，所述菌剂包括空气芽孢杆菌菌株。

[0017] 可以理解为，一种用于解离煤矸石中磷、钾和水解氮的菌剂，菌剂包括空气芽孢杆菌菌株；菌剂还包括其他制备菌剂的常规成分。这些常规成分与空气芽孢杆菌菌株混合，共同对煤矸石中速效钾、有效磷和水解氮均有较好的解离作用。

[0018] 本发明的有益效果是：

[0019] 1、本发明通过从陕西榆林某玉米地采集的土壤内筛选出微生物空气芽孢杆菌菌株，具有很好的耐高温、耐碱性，适用范围广。

[0020] 2、本发明筛选的空气芽孢杆菌株经鉴定为空气芽孢杆菌Bacillus aeriusY‑33，能高效解离出煤矸石中的不溶性的磷、钾、氮，尤其是对不溶性钾的解钾效果优于传统解钾菌株。

[0021] 3、本发明筛选出的微生物空气芽孢杆菌株，能制成解离煤矸石的制品或是制成菌剂，实现对煤矸石中不溶性的磷、钾、氮的解离，使其转换成有效磷、速效钾和水解氮，有利于煤矸石在微生物肥料等方面的应用，提升煤矸石的附加价值。附图说明

[0022] 图1为Y‑33革兰氏染色实验下的菌种形态；

[0023] 图2为Y‑33菌株的菌落形态；

[0024] 图3为Y‑33菌株的系统发育进化树；

[0025] 图4为Y‑33菌株的细菌生长曲线；

[0026] 图5为不同pH下三种菌株解离四天时的效果对比；

[0027] 图6为不同pH下三种菌株解离五天时的效果对比；

[0028] 图7为不同温度下三种菌株解离四天时的效果对比；

[0029] 图8为不同温度下三种菌株解离五天时的效果对比。

[0030] 现结合附图以及实施例对本发明做详细的说明。

[0031] 实施例1菌株筛选鉴定

[0032] 本实施例中，采用的仪器如下。

[0033] HH.S11‑4型恒温水箱，北京长安科学仪器厂；DHG‑9053AS型电热恒温鼓风干燥箱，上海经济区沈荡中新电器厂；AMA440N型全自动高压灭菌锅，美国Astell；PYX‑DHS型隔水式电热恒温培养箱，上海跃进医疗机械厂；TGL‑20M型台式高速冷冻离心机，长沙高新开发区湘仪贝克仪器仪表有限公司；TC‑412型PCR仪，英国Techne；YCP‑33A型电泳槽，北京六一仪器厂；UV2000型紫外可见分光光度计，尤尼柯上海仪器有限公司；6400A型火焰光度计，上海精密科学仪器有限公司。

[0034] 本实施例中，采用培养基如下。

[0035] 难溶性无机磷固体培养基(PVK)：葡萄糖10g，(NH4)SO4 0.5g，NaCl 0.3g，KC1 0.3g，Mg2SO4·H2O 0.3g，FeSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·H2O 0.03g，Ca3(PO4)210g，15～20g琼脂和1000mL蒸馏水，pH值7.0～7.2。

[0036] 难溶性无机磷液体培养基：葡萄糖10g，(NH4)SO4 0.5g，NaCl 0.3g，KC1 0.3g,Mg2SO4·H2O 0.3g，FeSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·H2O 0.03g，Ca3(PO4)2 10g和1000mL蒸馏水，pH值7.0～7.2。

[0037] 亚历山大固体培养基配方：葡萄糖5g、硫酸铵0.5g、酵母粉0.5g、硫酸镁0.3g、磷酸氢二钠2g、硫酸亚铁0.03g、硫酸锰0.03g、钾长石(K2O·Al2O3·6SiO2)2g、琼脂和1000mL蒸馏水。

[0038] 亚历山大液体培养基配方：葡萄糖5g、硫酸铵0.5g、酵母粉0.5g、硫酸镁0.3g、磷酸氢二钠2g、硫酸亚铁0.03g、硫酸锰0.03g、钾长石(K2O·Al2O3·6SiO2)2g和蒸馏水1000mL。

[0039] LB固体培养基：蛋白胨5g，氯化钠5g，牛肉膏1g，酵母膏2g，15～20g琼脂和蒸馏水1000mL，pH值7.4。

[0040] 菌株的筛选方法是：采用5点取样法，从陕西榆林某玉米地采集土壤。

[0041] 准确称取10g土壤样品于灭菌的250mL的锥形瓶中，加入90mL无菌水；在180r/min，‑227℃左右的恒温摇床中振荡30min；振荡30min以后，取上清液逐级稀释至1.0×10 、1.0×‑3 ‑4 ‑5 ‑6 ‑7
10 、1.0×10 、1.0×10 、1.0×10 、1.0×10 。每种浓度分别取100μL涂布于3个解钾细菌筛选固体培养基上；将平板放于35℃恒温培养箱中培养3～4天；将外观特征不同的单菌落划线接种于解钾细菌筛选固体培养上；待菌株长出后，通过菌落外观形态观察以及细菌显微形态观察，观察菌株的纯化情况，没有达到纯化要求，则进行多次重复划线培养，直到获得单一菌株，经过细菌菌种优化实验结果选择解磷解钾效果较好的菌株，并命名为Y‑33。

[0042] 将Y‑33细菌接种于LB固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培养18～24h,染色后在显微镜下进行观察，结果参见图1；同时观察Y‑33菌株的形态，结果参见图2。

[0043] 从图1可以看出：该菌株为革兰氏阳性菌。

[0044] 从图2可以看出，Y‑33菌落是白色、形状规则、表面有光泽的菌群。

[0045] 本实施例中，采用快速无毒DNA提取试剂盒提取菌株DNA，利用特定引物序列，通过PCR技术扩增目的片段，对扩增结果进行测序。

[0046] 扩增引物信息：27F(5’‑AGAGTT TGATCC TGG CTC AG‑3’)；1492R(5’‑AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA3‑’)

[0047] PCR程序如下:95℃，5min；94℃，1min；55℃，1min；72℃，1min，30个周期；72℃，10min。

[0048] Y‑33菌株的测序结果如下。

[0049] AGCGTGCAGTCGAGCGGACAGAAGGGAGCTTGCTCCCGGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAGTTCCTTGAACCGCATGGTTCAAGGATGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCAAGAGTAACTGCTTGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCTTCGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCTGCGAGACCGCAAGGTTTAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGG。

[0050] 进一步的，将测序结果与NCBI基因库中比较，使用MEGA6.06中绘制系统发育树，发育树如图3所示，最终根据相似度大小确认目的菌种。

[0051] 参见图3，Y‑33菌株与MN098858.1Bacillus aerius strain TS2‑12A16S ribosomal RNA gene partial sequence在同一分枝上，亲缘关系最近；故菌种鉴定为空气芽孢杆菌Y‑33，拉丁名称为Bacillus aerius Y‑33。

[0052] Bacillus aerius Y‑33，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 20232075；保藏时间是2023年10月30日。

[0053] 取该菌株用接种环接种于LB液体培养基中，在35℃条件下，培养至对数期(24h±2h)。取上述菌液的10mL接种于装有200mL的液体LB培养基中,混匀后分别取5mL混合液分别装于上有标记的20支无菌试管中。将已接种的试管置35℃、180r/min的摇床中培养。用未接种的LB液体培养基做空白，在600nm波长下与待测样进行光电比浊，测定结果如图4所示。

[0054] 从图4细菌生长曲线显示出，Y‑33细菌在0h‑10h处于延迟期，10h‑30h处于对数期，30h‑40h处于稳定期，40h之后处于衰亡期。

[0055] 实施例2

[0056] 利用实施例1筛选的Y‑33菌株对煤矸石进行解离，测定处理后煤矸石中速效钾和有效磷的含量。

[0057] 将细菌接入LB液体培养基中，扩大培养至对数期，此时细菌代谢速率最快，并接入提前配制好的解磷液体培养基中，放置于恒温摇床中充分混匀(30℃、160转)，然后加入煤矸石，共同培养至第四天、第五天测定其解磷能力数值。

[0058] 所用煤矸石来自中煤陕西榆林大海则煤业有限公司煤矸石堆场，主要成分为：SiO2 59.66％，Al2O3 22.78％，CaO 5.09％，Fe2O3 3.95％，K2O 2.87％，Na2O 1.85％，MgO 
1.23％，N 0.26％，C 17.00％，H 1.34％，S1.07％，P2O5 0.108％，以及灰分83.88％。

[0059] 测定时，将Y‑33菌株加入煤矸石中，Y‑33菌株与煤矸石的用量5ml菌液和2g煤矸石，体系的酸度为9，温度为45℃下，解离五天时间，测定Y‑33菌株处理后煤矸石中速效钾、有效磷和水解氮含量，结果如表1所示。

[0060] 表1 Y‑33菌株解离煤矸石的试验前后结果

[0061] 项目(mg/kg) 处理前 处理后有效磷 1.93 7.00
速效钾 28.41 568.94
水解氮 68 330

[0062] 对比例

[0063] 采用两种商业用菌作为对比，即巨大芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌，均为市场采购的商业菌。两种商业菌按照上述方法进行处理，在相同的条件下对煤矸石进行解离，测定处理后煤矸石中速效钾和有效磷的含量，结果如表2所示。

[0064] 表2巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌结果对比

[0065]

[0066]

[0067] 从表1可以看出，本发明制备的Y‑33菌株处理煤矸石后，煤矸石中的有效磷含量提升3.63倍，速效钾提升19.59倍，水解氮提升4.71倍，说明本发明筛选的Y‑33菌株对煤矸石中的速效钾、有效磷和水解氮均有解离作用，且对速效钾的解离有更好的选择性。

[0068] 从表2可以看出，巨大芽孢杆菌解离后，煤矸石中的有效磷含量提升3.86倍，速效钾提升12.15倍；胶冻样芽孢杆菌解离后，煤矸石中的有效磷含量提升3.15倍，速效钾提升12.72倍；虽然本发明筛选的Y‑33对煤矸石中的有效磷的解离程度与巨大芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌基本相当，但是Y‑33对煤矸石中的速效钾的解离程度高于巨大芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌对速效钾的解离程度。说明本发明筛选的Y‑33菌株对煤矸石中速效钾的解离效果更佳。

[0069] 实施例3

[0070] 将实施例1筛选出的Y‑33菌株，接入LB液体培养基中，扩大培养至对数期，此时细菌代谢速率最快，并接入提前配制好的解磷液体培养基中，放置于恒温摇床中充分混匀(30℃，160r/min)，并加入粒径为20目的煤矸石，共同培养至第四天、第五天测定其解钾能力数值。

[0071] 所用煤矸石来自中煤陕西榆林大海则煤业有限公司煤矸石堆场，主要成分为：SiO2 59.66％，Al2O3 22.78％，CaO 5.09％，Fe2O3 3.95％，K2O 2.87％，Na2O 1.85％，MgO 
1.23％，N 0.26％，C 17.00％，H 1.34％，S1.07％，以及灰分83.88％。

[0072] LB液体培养基：蛋白胨5g、氯化钠5g、牛肉膏1g、酵母膏2g、15～20g琼脂和蒸馏水1000mL，pH值7.4。

[0073] 测定时，将Y‑33菌株加入煤矸石中，按照5ml菌液和2g煤矸石的用量混合，体系的酸度分别调节至4、5、6、7、8、9和10，温度35℃下解离5天。分别测定解离第四天和解离第五天处理后煤矸石中速效钾的含量，结果如图5和图6所示。

[0074] 本实施例中，以两种商业用菌作为对比，即巨大芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌，均为市场采购的商业菌。两种商业菌按照上述方法进行处理，在相同的条件下对煤矸石进行解离，测定处理后煤矸石中速效钾的含量，结果如图5和图6所示。

[0075] 参见图5和图6的对比结果可知，Y‑33菌株在pH为9时，解离出的速效钾的含量最高，表明菌株具有较高的耐碱性，适用于碱性较高的解离体系中，且在强碱环境下，菌株Y‑33降解效果和解离速率比两种商业用菌效果和速率均更好。

[0076] 实施例4

[0077] 将实施例1筛选出的Y‑33菌株，接入LB液体培养基中，扩大培养至对数期，此时细菌代谢速率最快，并接入提前配制好的解磷液体培养基中，放置于恒温摇床中充分混匀(30℃，160r/min)，培养至第四天、第五天测定其解钾能力数值。

[0078] 所用煤矸石来自中煤陕西榆林大海则煤业有限公司煤矸石堆场，主要成分为：SiO2 59.66％，Al2O3 22.78％，CaO 5.09％，Fe2O3 3.95％，K2O 2.87％，Na2O 1.85％，MgO 
1.23％，N 0.26％，C 17.00％，H 1.34％，S1.07％，以及灰分83.88％。

[0079] LB液体培养基：蛋白胨5g、氯化钠5g、牛肉膏1g、酵母膏2g、15～20g琼脂和蒸馏水1000mL，pH值7.4。

[0080] 测定时，将Y‑33菌株加入煤矸石中，按照5ml菌液和2g煤矸石的用量混合，体系的酸度为9，温度分别10℃、20℃、30℃、40℃和50℃下，解离五天。分别测定第四天和第五天处理后煤矸石中速效钾的含量，结果如图7和图8所示。

[0081] 本实施例中，以两种商业用菌作为对比，即巨大芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌，均为市场采购的商业菌。两种商业菌按照上述方法进行处理，在相同的条件下对煤矸石进行解离，测定处理后煤矸石中速效钾的含量，结果如图7和图8所示。

[0082] 参见图7和图8，可以知道，当温度在50℃时，菌株Y‑33解离出的速效钾的含量最高，且远高于商业巨大芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌的解离效果，表明温度越高，Y‑33解钾效果越好，因此，说明Y‑33为嗜热菌，能应用于温度高的解离环境中。

[0083] 以上是本发明优选的实施方式，但是不能以此作为对本发明保护范围的限定，任何在本发明技术基础上所做出的等同替换和修饰，均应落在本发明的保护范围之内。