一种运动芽孢杆菌及其应用 |
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| 申请号 | CN202110203822.X | 申请日 | 2021-02-23 | 公开(公告)号 | CN112760270B | 公开(公告)日 | 2022-06-14 |
| 申请人 | 贵州大学; | 发明人 | 谢承卫; 王应兰; 李小军; 董丽敏; 盛定红; 杜鑫; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种运动芽孢杆菌及其应用。所述运动芽孢杆菌命名为运动芽孢杆菌GZU‑Bac01(Bacillus mobilis GZU‑Bac01)，于2020年12月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2020863。本发明的运动芽孢杆菌GZU‑Bac01具有能够解离释放被 固化 的 营养元素 ，如：氮、磷、 钾 、 钙 等，解离效果好，成本低廉，绿色环保，采用将 微 生物 细菌(运动芽孢杆菌GZU‑Bac01)解离 煤 矸石来制备微生物 肥料 的方法，不仅能将煤矸石中的难溶和/或不溶的营养成分转化为可溶性成分，还能够在将其施用于 土壤 中后，能够释放土壤中的已固化的氮、磷、钾、钙等，使之转化为 植物 直接吸收利用的营养元素，同时GZU‑Bac01也能有效地释放其它的含磷矿物中的难溶性磷和/或不溶性磷。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种运动芽孢杆菌（ Bacillus mobilis ） ，其特征在于：所述运动芽孢杆菌命名为运动芽孢杆菌GZU‑Bac01，于2020年12月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2020863。 |
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| 说明书全文 | 一种运动芽孢杆菌及其应用技术领域[0001] 本发明涉及一种菌株及其应用，特别是一种运动芽孢杆菌及其应用。 背景技术[0002] 在过去几十年里，中国工业快速发展，煤炭产业发展速度也大幅提升，在给中国经济带来巨大效益的同时，也给社会和环境带来了较大的危害。在煤炭开采和洗选过程中产生了大量的煤矸石，随着煤炭产业的不断发展，煤矸石已经成为当今世界的十大工业固体废弃物之一。 [0003] 大量的煤矸石堆积不仅占用了大量宝贵的土地资源，也给煤矿产区以及周围的环境带来了危害，因此煤矸石的资源化利用显得极为重要。目前煤矸石主要应用有：利用其含碳量较大、热值较高的特点，可以作为发电和供热的原料；利用煤矸石来制备砖、混凝土、水泥等建筑材料；利用煤矸石来生产分子筛等化工产品等，但煤矸石的利用率依然不高，依然存在煤矸石大量堆积的现象。 发明内容[0006] 本发明的技术方案：一种运动芽孢杆菌，所述运动芽孢杆菌命名为运动芽孢杆菌GZU‑Bac01(Bacillus mobilis GZU‑Bac01)，于2020年12月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2020863。 [0007] 前述的运动芽孢杆菌中，所述运动芽孢杆菌GZU‑Bac01在解离固化氮、磷、钾和钙的应用。 [0008] 前述的运动芽孢杆菌中，所述运动芽孢杆菌GZU‑Bac01在解离矿物或土壤中氮、磷、钾和钙的应用。 [0009] 前述的运动芽孢杆菌中，所述运动芽孢杆菌GZU‑Bac01在解离煤矸石中氮、磷、钾和钙的应用。 [0010] 一种解离固化氮、磷、钾和钙的制品，所述制品的活性成分包括或是运动芽孢杆菌GZU‑Bac01。 [0011] 一种解离矿物或土壤中氮、磷、钾和钙的制品，所述制品的活性成分包括或是运动芽孢杆菌GZU‑Bac01。 [0012] 一种解离煤矸石中氮、磷、钾和钙的制品，所述制品的活性成分包括运动芽孢杆菌GZU‑Bac01。 [0013] 一种解离煤矸石中氮、磷、钾和钙的制品，所述制品的活性成分是运动芽孢杆菌GZU‑Bac01。 [0014] 前述的解离煤矸石中氮、磷、钾和钙的制品中，还包括用于制备菌剂的常规成分。 [0015] 一种解离煤矸石中氮、磷、钾和钙的制品的制备方法，采用所述的运动芽孢杆菌GZU‑Bac01作为制备所述制品的活性成分或活性成分之一。 [0016] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： [0017] 1、由于煤矸石中含有氮、磷、钾、钙等元素以及15％‑25％的有机质等，可以用来制备肥料，能有效增加煤矸石的利用率，缓解煤矸石大量堆积给环境带来的压力。解磷菌是一类具有溶解难溶性无机磷酸盐或矿化有机磷酸盐能力的微生物细菌。由于磷能促进植物生长，因而，解磷菌能促进农业发展，并对环境保护也有重要作用。 [0018] 本发明的运动芽孢杆菌GZU‑Bac01(Bacillus mobilis GZU‑Bac01)是一株优异的解磷菌，可以有效地解离煤矸石中的不溶性和/或难溶性的磷、钾、硅、钙、氮等成分，将其变成有效磷、速效钾、交换性钙、水解氮等植物能吸收利用的营养成分。 [0019] 实验结果表明，运动芽孢杆菌GZU‑Bac01(Bacillus mobilis GZU‑Bac01)对煤矸石的解离效果优于传统解磷菌株巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。 [0020] 从土壤中分离筛选解磷微生物，并利用解磷微生物来解离释放煤矸石中的植物所需要的营养成分，是一种煤矸石资源化利用的新方法，这种方法也可用于对其它含磷矿物的处理。 [0021] 2、本发明从矿区附近土壤中分离、纯化、培育、筛选出的运动芽孢杆菌GZU‑Bac01(Bacillus mobilis GZU‑Bac01)，该菌株是一株高效解磷菌，能够有效地将煤矸石中的难溶性和/或不溶性的氮、磷、钾、钙等植物生长不能直接吸收利用的营养元素转化为水解氮、有效磷、速效钾、交换性钙等作为植物能够吸收的营养物质成分的菌株，且采用运动芽孢杆菌GZU‑Bac01(Bacillus mobilis GZU‑Bac01)对煤矸石的解离效果明显优于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。 [0022] 3、本发明采用微生物细菌解离煤矸石，工艺简单，成本低，绿色环保。 [0023] 4、利用微生物细菌(运动芽孢杆菌GZU‑Bac01)解离煤矸石，是煤矸石资源化利用的方法之一，该方法成本低、环保、绿色、简单，能够一定程度地增加煤矸石的利用率，缓解煤矸石给社会、环境、生态带来的压力，且采用将微生物细菌(运动芽孢杆菌GZU‑Bac01)解离煤矸石来制备微生物肥料的方法，不仅能将煤矸石中的难溶和/或不溶的营养成分转化为可溶性成分，还能够在将其施用于土壤中后，能够释放土壤中的已固化的氮、磷、钾、钙等，使之转化为植物直接吸收利用的营养元素，同时GZU‑Bac01也能有效地释放其它的含磷矿物中的难溶性磷和/或不溶性磷。 [0024] 5、本发明运动芽孢杆菌GZU‑Bac01(Bacillus mobilis GZU‑Bac01)能有效地使煤矸石中的难溶性磷和/或不溶性磷转变为有效磷，同时GZU‑Bac01也能有效地释放其它的含磷矿物中的难溶性磷和/或不溶性磷，因此使用GZU‑Bac01制备煤矸石微生物肥料时，也可以适当掺杂其它的含磷矿物，增加制备微生物肥料的磷源，使煤矸石和其它的含磷矿物都能得到资源化利用。 [0026] 图1是本发明运动芽孢杆菌GZU‑Bac01菌株生长曲线； [0027] 图2是本发明运动芽孢杆菌GZU‑Bac01菌株菌落外观图； [0028] 图3是本发明运动芽孢杆菌GZU‑Bac01菌体形态图； [0029] 图4是本发明运动芽孢杆菌GZU‑Bac01菌株基于部分16S rRNA基因序列建立的系统进化树。 具体实施方式[0030] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。 [0031] 实施例： [0032] 1.功能菌株GZU‑Bac01菌株的分离与筛选 [0033] 1)样品的采集 [0034] (1)样品采自于矿区附近土壤中； [0035] (2)将采集的样品破碎、筛分，收集过60目的样品； [0037] 2)功能菌株的筛选 [0038] (1)准确称取1g土壤样品于已经过灭菌处理的250mL的锥形瓶中，加入99mL无菌水； [0039] (2)在180r/min，30℃左右的恒温摇床中振荡30min； [0040] (3)振荡30min以后，取上清液逐级稀释至10‑3，10‑4，10‑5，10‑6，10‑7。 [0041] (4)每种浓度分别取100uL涂布于3个难溶性无机磷固体培养基上； [0042] (5)将平板放于35℃恒温培养箱中培养3～4天； [0043] (6)将外观特征不同的细菌分别划线接种于难溶性无机磷固体培养基上； [0044] (7)待菌株长出后，再将其划线接种于全营养培养基上； [0045] (8)通过菌落外观形态观察以及细菌显微形态观察，观察菌株的纯化情况，没有达到纯化要求，则进行多次重复划线培养，直到获得单一菌株； [0046] (9)将纯化的菌株，进行革兰氏染色； [0047] (10)对初筛得到的已纯化的菌株进行培养，用其来解离煤矸石，通过测定煤矸石解离前后有效磷含量变化情况，确认菌株的解磷效果。 [0048] 2.功能菌株的生长曲线的绘制 [0050] 2)接种。取上述种子液的10mL接种于装有200mL的液体LB培养基中，混匀后分别取5mL混合液分别装于上有标记的24支无菌试管中。 [0051] 3)培养。将已接种的试管置35℃，180r/min的恒温震荡培养箱中进行培养。 [0052] 4)测量。用未接种的LB液体培养基做空白，在600nm波长下与待测样进行光电比浊。 [0053] 测定结果如图1，从图中可知，0‑7h为延滞期，7‑22h为对数期，22h‑35h为稳定期，35h以后为衰亡期。 [0054] 3.功能菌株的鉴定 [0055] 1)菌落外观形态 [0056] 如图2，从图中可知该菌株在LB固体培养基上呈现乳白色，不透明圆形，表面湿润，边缘整齐，有凸起，无光泽，单菌落大小为1‑2mm。 [0057] 2)细菌显微形态 [0058] 经过革兰氏染色，细菌显微形态如图3，从图中可知该菌株为革兰氏阳性芽孢杆菌。 [0059] 3)菌株鉴定 [0060] (1)细菌DNA的提取 [0061] 挑取已纯化菌株的单菌落接种至LB液体培养基中进行培养，得到纯菌种发酵液后，采用细菌基因组提取试剂盒(离心柱型，天根生化科技北京有限公司)提取细菌DNA，以其作为模版进行聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)，使用Taq DNA聚合物扩增16S r RNA，用2F(5′‑AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGA‑3′)，1492R(5′‑TACGGCTACCTTGTTACGACTTAGC‑3′)的通用引物进行PCR扩增，PCR扩增反应体系和条件如表1所示。 [0062] 表1.PCR扩增反应体系和扩增反应条件 [0063] [0064] [0065] 称取1.2g琼脂糖于250mL锥形瓶中，加入1×TAE缓冲液100mL，微波加热至完全溶解，配制成1.2％琼脂糖凝胶，加入20μLPCR扩增产物，加7μL 2000pb DNA Marker，在100‑120V电泳40‑45min，观察凝胶成像结果。 [0066] (2)同源性比对 [0067] 将增产物经凝胶回收，由测序公司测序，测序结果在NCBI上利用Standard Nucleotide Blast进行比对，比对结果见表2，并利用MEGA5.05等软件基于邻接法(Neighbor Joining Method)构建系统发育树(图4)。 [0068] 从图4中可知，GZU‑Bac01细菌属于芽孢杆菌属细菌，根据GZU‑Bac0116S rRNA基因测序BLAST结果(表2)，GZU‑Bac01细菌与Bacillus mobilis strain 0711P9‑1(MACF01000036)的亲缘性最高，达100％，因此将GZU‑Bac01鉴定为运动芽孢杆菌Bacillus mobilis strain。 [0069] 表2菌株GZU‑Bac0116S rRNA基因测序BLAST结果 [0070] [0071] [0072] (3)生理生化实验 [0073] 生化实验参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第8版)和《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等，1999)进行。 [0074] 4.菌株对煤矸石的解离能力的测定 [0075] 1)所用煤矸石主要成份为：C 13.77％，SiO234.41％，Al2O3 14.23％，Fe2O3 14.04％,TiO2 3.76％，CaO 5.75％，MgO 3.22％，K2O 1.73％，Na2O 0.69％，P2O5 1.92％，S 1.08％，H 1.44％，N 1.12％，灰分79.8％。 [0076] 2)影响微生物对煤矸石解离效果的四个主要因素为：体系pH值，煤矸石粒径，解离时间，接菌量。以煤矸石为细菌生成的唯一碳源，探究GZU‑Bac01、巨大芽孢杆菌解离煤矸石的单因素实验，根据单因素实验结果，选取影响较大的因素设计正交实验寻找GZU‑Bac01、巨大芽孢杆菌解离煤矸石最佳条件。 [0077] 3)针对成分为1)煤矸石，用运动芽孢杆菌GZU‑Bac01、巨大芽孢杆菌进行解离实验。 [0078] 4)解离实验过程如下：取指定目数的煤矸石，运动芽孢杆菌GZU‑Bac01、巨大芽孢10 10 杆菌菌液浓度控制在：1.15×10 ‑3.05×10 cfu/mL，两株细菌与煤矸石的用量比例为2: 1，不断搅拌煤矸石样品并喷撒菌液，搅拌均匀后，温度控制在33‑35℃，每间隔1‑2小时翻动一次，解离煤矸石数天。 [0079] 5)测定解离数天后煤矸石中各指标含量，结果如表3。从表3中可以看出，运动芽孢杆菌GZU‑Bac01解离煤矸石的总体效果优于巨大芽孢杆菌，主要指标有效磷、速效钾等指标均优于巨大芽孢杆菌。 [0080] 表3正交设计实验结果 [0081] [0082] [0083] |
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