[0001] 本发明具体涉及一株耐盐芽孢杆菌147及其应用。

[0002] 公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的一些理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

[0003] 近年来，随着土地盐碱化面积的不断扩大，植株生长和产量受到了严重影响。目前，急需解决如何在盐碱化的土地上更好种植农作物的方法，而发掘具有改良土壤特性的微生物菌株，改善土壤盐碱化，促进植株生长具有重要的作用。

[0004] 植物根际促生细菌(Plant growth‑promotingrhizobacteria，PGPR)是一类定殖于植物根际的对植物生长起促进作用的细菌，具有加速营养物质的吸收利用、防治植物病害和应对非生物胁迫的能力。目前已鉴定出多种PGPR菌株，其中的芽孢杆菌因抗逆能力强而备受关注。蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)JYZ‑SD2在含氯化钠0％～6％的平板上均能生长；枯草芽孢杆菌(B.subtilis)BR5和巨大芽孢杆菌(B.megaterium)BN7的氯化钠耐受能力达到了18％，并在盐渍土壤盆栽实验中表现出良好的促生效果；地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)SSA61甚至可在盐浓度高达25％的条件下生长繁殖。研究芽孢杆菌对盐胁迫的耐受机制及其促进植物耐盐生长的机理，对盐碱地的改良及开发利用具有重要意义。目前，关于耐盐芽孢杆菌具有生防和促生长的相关报道还比较少见。

[0005] 针对现有技术的不足，本发明旨在将耐盐芽孢杆菌147的耐盐性以及对水稻恶苗病和黄瓜白粉病的防治效果，为其在后续的生物农药开发利用中做好基础。

[0006] 具体的，本发明采用以下技术方案：

[0007] 在本发明的第一个方面，提供一株耐盐芽孢杆菌147，该菌的分类命名为耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)，于2023年9月5日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：CGMCC 28360，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

[0008] 所述耐盐芽孢杆菌147的菌落特征及菌体形态如下：菌落呈乳黄色，规则圆形，表面凸起，光滑粘稠状。

[0009] 所述耐盐芽孢杆菌147的生理生化特征包括：其在8％Nacl的平板上能够生长，对其生理生化性质进行测定，表明其具有固氮能力，分泌嗜铁素，具有淀粉酶功能，具有产ACC脱氨酶能力。V‑P、明胶、脂酶和接触酶试验呈阳性反应，甲基红和H2S试验呈阴性反应。

[0010] 所述耐盐芽孢杆菌147的功能定性及定量测定：耐盐芽孢杆菌147发酵液浸种处理的发芽率要比清水处理的高25％，平均根长和茎长分别提高了58％、55％，鲜重提高了50％，胚芽鞘粗提高了20％。(均达到极显著差异，p<0.01)。

[0011] 在本发明的第二个方面，提供一种微生物混合物，其特点是至少包含本发明的菌株，所述微生物混合物可以包含其他生防菌或促进植物生长的菌株并与本发明的菌株共生的微生物。

[0012] 在本发明的第三个方面，提供一种包含本发明菌株或本发明微生物混合物的产品，该产品可以是菌剂、菌肥或组合物等。

[0013] 优选的，所述产品包括载体；所述载体可以为固体载体或液体载体。所述固体载体或液体载体均为常规的载体材料，其中，固体载体可以选自粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石、玉米粉、豆粉、聚乙烯醇和/或聚二醇；液体载体可以为植物油、矿物油或水。

[0014] 优选的，所述产品为粉末形式、溶液形式、悬浮剂形式、片剂形式、颗粒形式或其他形式。

[0015] 进一步优选的，所述粉末形式可以为冻干粉末形式；所述片剂形式为含有所述冻干粉末和任选营养素(例如维生素、矿物盐等)的片剂形式。

[0016] 所述产品的活性成分为耐盐芽孢杆菌147，该活性成分可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。

[0017] 在本发明的第四个方面，提供一种包含耐盐芽孢杆菌147发酵液或者发酵物或者代谢产物等。

[0018] 在本发明的第五个方面，提供一种所述耐盐芽孢杆菌147发酵方法，将所述耐盐芽孢杆菌147接种至发酵培养基中进行发酵培养即得。

[0019] 优选的，所述发酵培养条件为：26～30℃，150～200rmp/min，发酵2～3天。

[0020] 进一步优选的，所述发酵培养条件为：28℃，200rmp/min，发酵3天。

[0021] 在本发明的第六个方面，提供一种本发明的菌株、本发明的微生物混合物或者本发明的包含本发明菌株或本发明微生物混合物的产品或本发明发酵液或者发酵物或者代谢产物在防治病害或促进植物生长的应用。

[0022] 所述病害为水稻恶苗病和黄瓜白粉病。鉴于施用环境(植物的根际土壤环境、植物叶片环境等)的复杂性，经过发明人大量的试验验证和分析，本发明的耐盐芽孢杆菌147尤其对水稻的恶苗病和黄瓜的白粉病具有优异的防治效果。

[0023] 经过发明人对大量植物种子的试验验证和分析，所述植物生长尤其包括促进小麦种子的萌发及促生长。

[0024] 在本发明的第七个方面，提供一种防治水稻恶苗病或黄瓜白粉病的方法，该方法包括向植物水稻或黄瓜的生长环境中施加上述耐盐芽孢杆菌147、上述微生物混合物、上述产品、上述发酵液或者发酵物或者代谢产物。

[0025] 优选的，所述生长环境包括但不限于植物的根际土壤和叶片等。

[0026] 在本发明的第八个方面，提供一种促进小麦种子萌发以及生长的方法，该方法包括使需要生长的小麦的种子或小麦根际周围环境与本发明的菌株‑耐盐芽孢杆菌147接触的步骤。

[0027] 优选的，所述根际周围环境为小麦根际土壤。

[0028] 与本发明人知晓的相关技术相比，本发明其中的一个技术方案具有如下有益效果：

[0029] 本发明的菌株经16sRNA鉴定是一株耐盐芽孢杆菌，经离体生测实验和盆栽活体生测实验表明，其具有广谱的杀真菌防效，经活体盆栽实验表明，其对于黄瓜白粉病和水稻恶苗病具有优异的生防效果，对其进行相关生理生化指标测定，其具有蛋白酶，脂肪酶活性，还具有固氮和铁载体功能，该菌株具有促进小麦种子萌发及生长的作用，因此，作为微生物菌肥杀菌剂应用于农业生产上具有较好的潜力。附图说明

[0030] 构成本发明一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

[0031] 图1是耐盐芽孢杆菌147菌落形态图。

[0032] 图2是对黄瓜白粉病的防治。

[0033] 图3是对小麦种子的萌发及促生长作用。

[0034] 应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

[0035] 需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

[0036] 为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

[0037] 实施例1本发明耐盐芽孢杆菌147的筛选

[0038] (1)筛选过程

[0039] 称取黄瓜根际土壤约1克，放入装有10ml无菌水的锥形瓶中，充分震荡，制成10‑1菌‑3 ‑3悬液，按照连续稀释分离法，进一步制成10 的菌悬液，用移液枪吸取0.1ml 10 菌悬液，注入平板培养基上，用无菌玻璃棒将菌悬液均匀涂抹于整个培养基上，然后将培养皿倒置于
28℃培养箱中，培养2～3天，待培养皿上长出适量菌落后，将单菌落接种于斜面培养基中，进行分离培养。

[0040] (2)菌落特征及菌体形态

[0041] 菌落呈乳黄色，规则圆形，表面凸起，光滑粘稠状。

[0042] (3)生理生化特征

[0043] 其在8％Nacl的平板上能够生长，对其生理生化性质进行测定，表明其具有固氮能力，分泌嗜铁素，具有淀粉酶功能，具有产ACC脱氨酶能力。V‑P、明胶、脂酶和接触酶试验呈阳性反应，甲基红和H2S试验呈阴性反应。

[0044] (4)16S rDNA序列分析

[0045] 本发明菌株的16S rDNA基因序列，见核苷酸序列表所示。将所测16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列比对。

[0046] 结合菌落形态，生理生化特征和16SrDNA序列分析，将本发明的菌株147鉴定为耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)。

[0047] 下列序列为SDNY‑147的16S rDNA，如SEQ ID NO：1所示：TGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTCCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTNGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCA

[0048] 实施例2耐盐芽孢杆菌147发酵液的制备

[0049] 将保存在斜面上的耐盐芽孢杆菌147在活化培养基(配方：葡萄糖2％，蛋白胨1％，酵母粉1％，氯化钠0.5％，余量为水)中进行活化，活化条件为：菌种转接到斜面，28℃培养1天。活化后，接种一接种环至发酵培养基(配方：葡萄糖2％，蛋白胨1％，酵母粉1％，氯化钠0.5％，余量为水)中进行发酵，发酵条件：28℃，200rmp/min，发酵3天。获得耐盐芽孢杆菌
147发酵液。

[0050] 实施例3

[0051] 一种微生物混合物，其特点是包含实施例1中的耐盐芽孢杆菌147，所述微生物混合物还包含其他生防菌或促进植物生长的菌株并与耐盐芽孢杆菌147共生的微生物。其中所述生防菌包括对水稻或者黄瓜具有生防作用的菌株；促进植物生长的菌株包括促进小麦种子萌发及生长的其他微生物。

[0052] 实施例4

[0053] 一种包含实施例1中的耐盐芽孢杆菌147或实施例2中的微生物混合物的菌剂，菌剂中包括载体和活性成分‑耐盐芽孢杆菌147，所述载体可以为固体载体或液体载体。所述固体载体或液体载体均为常规的载体材料，其中，固体载体可以选自粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石、玉米粉、豆粉、聚乙烯醇和/或聚二醇；液体载体可以为植物油、矿物油或水。菌剂的形式为冻干粉末形式。

[0054] 实施例5对水稻恶苗病的防治

[0055] 水稻恶苗病病原菌的制备：将已经培养好的菌丝块置于PDB中，28℃，180rpm培养7天备用。水稻种子挑选大小一致、健康饱满的，经70％酒精消毒10min后，用无菌水冲洗干净，置于无菌的培养皿内，28℃浸种24h，然后冲洗干净将水倒掉，进行催芽处理24h左右，尽量挑选出芽情况一致的水稻种子进行播种，每盆大概10粒种子，25℃温室内进行培养，待长出两叶一心时对水稻叶鞘部位进行伤口处理，将实施例2中的耐盐芽孢杆菌147发酵液均匀喷洒于水稻叶片上，对照组不作处理，待叶片晾干后，将恶苗病病菌菌悬液喷洒于水稻叶片，每处理3次重复，接种10天后，调查水稻恶苗病的发病率。盆栽测定结果显示，耐盐芽孢杆菌147发酵液施用10天后，水稻恶苗病的病情指数为10.5，药剂防效为67.8％，具有较好的防治效果。

[0056] 实施例6对黄瓜白粉病的防治

[0057] 以黄瓜白粉病为指示菌，采用活体生测法，测定耐盐芽孢杆菌147发酵液对黄瓜白粉病的防效。在温室条件下，挑选饱满的黄瓜种子播种到小花盆里，保湿，置于25℃室温下光照培养。待黄瓜幼苗长出2片真叶时，挑选长势一致的黄瓜苗，将耐盐芽孢杆菌147发酵液均匀喷洒于其叶片上，待药液晾干后接种孢子浓度为10万个/mL左右的白粉病孢子悬浮液，用接种喷雾器在黄瓜苗上均匀喷雾接种，然后把接种白粉病的黄瓜苗移至恒温室灯光下(24℃左右)，培养期间每天保温、保湿，于7d后按黄瓜白粉病的常规分级标准及方法计算病情指数和防治效果，每处理3次重复。以不喷药剂作为空白对照。盆栽测定结果显示，147号菌发酵液施用7d后，白粉病病情指数3.7，药剂防效94.7％，具有优异的防治效果。如图2。

[0058] 实施例7对小麦种子的萌发及促生长作用

[0059] 分别取2ml实施例2中获得的耐盐芽孢杆菌147发酵液进行离心，10000rpm、5min，用无菌水调节至菌悬液OD值为0.5，小麦种子用70v/v％的酒精消毒10min后，用无菌水冲洗数遍，挑选大致相同的种子各15粒分别加入含有无菌水，菌悬液的培养皿中28℃进行浸种，过夜，然后用无菌水冲洗浸泡的种子4遍，然后随机挑选4颗种子置于含无菌水湿润的滤纸培养皿中，每个处理3个重复，置于28℃培养箱中培养，每隔一天向滤纸中加入适量无菌水保持滤纸湿润，4天后进行根系和茎叶长度的测量。

[0060] 结果显示，耐盐芽孢杆菌147发酵液浸种处理的发芽率要比清水处理的高25％，平均根长和茎长分别提高了58％、55％，鲜重提高了50％，胚芽鞘粗提高了20％，如图3。(均达到极显著差异，p<0.01)。

[0061] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。