一种贝莱斯芽孢杆菌及其应用 |
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| 申请号 | CN202410084638.1 | 申请日 | 2024-01-19 | 公开(公告)号 | CN117887631A | 公开(公告)日 | 2024-04-16 |
| 申请人 | 宁波市农业科学研究院; | 发明人 | 郝芳敏; 董文杰; 臧全宇; 马二磊; 丁伟红; 王毓洪; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供一种贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）Bc3‑1，所述贝莱斯芽孢杆菌Bc3‑1于2023年2月14日保藏于中国 微 生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26546。本发明的贝莱斯芽孢杆菌Bc3‑1可用于甜瓜的 生物防治 ，尤其是对尖孢镰刀菌甜瓜专化型病菌、黑点根腐病菌、蔓枯病菌和亚洲镰刀菌等病菌具有拮抗作用。另外，所述贝莱斯芽孢杆菌还可以用于促进甜瓜的生长。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）Bc3‑1，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌Bc3‑1于2023年2月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No . 26546。 |
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| 说明书全文 | 一种贝莱斯芽孢杆菌及其应用技术领域背景技术[0002] 甜瓜是在世界范围内广泛栽培的一年生蔓生植物，具有很高的食用价值和营养价值，深受世界各地消费者的欢迎。但在甜瓜种植的过程中会遭受多种病害的侵染，例如尖孢镰刀菌甜瓜专化型（Fusarium oxysporumf. sp.melonis）引起的甜瓜枯萎病、黑点根腐病菌（Monosporascus cannonballus）引起的黑点根腐病、蔓枯病菌（Stagonosporopsis cucurbitacearum）引起的蔓枯病以及亚洲镰刀菌（Fusarium asiaticum）引起的果腐病等病害，严重影响甜瓜的产量和经济价值。 [0003] 贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）是一种革兰氏阳性细菌，对多种作物的病原真菌具有抑菌活性，例如，引起花生白绢病的小菌核属（Sclerotium rolfsii），引起水稻稻瘟病的稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae），引起柑橘青霉病的青霉（Penicillum crustosum），引起桃树根腐病腐皮镰刀菌（Fusarium solani）等多种植物病原菌。此外，贝莱斯芽孢杆菌对茄子、番茄、青菜、小麦、芝麻、香蕉、桃、玉米等植物具有潜在的促生长作用。目前，利用生物防治甜瓜病害具有有安全、绿色、高效等优点，贝莱斯芽孢杆菌在甜瓜上的防病促生应用还比较少，因此筛选对甜瓜不同病原菌同时有效的贝莱斯芽孢杆菌具有重要的理论和实践意义。 发明内容[0004] 为了解决上述技术问题，本发明提供了一种新型的贝莱斯芽孢杆菌及其应用。 [0005] 本发明提供一种贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）Bc3‑1，所述贝莱斯芽孢杆菌Bc3‑1于2023年2月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No .26546。 [0006] 作为一种实施案例，16S rDNA片段PCR扩增所使用的引物为：27F：5’‑AGAGTTTGATCCTGGCTCAG‑3’； 1492R：5’‑GGTTACCTTGTTACGACTT‑3’。 [0007] 本发明提供如上所述的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）Bc3‑1的应用，利用所述贝莱斯芽孢杆菌Bc3‑1进行甜瓜的生物防治或者促进甜瓜的生长。 [0008] 作为一种实施案例，利用所述贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）Bc3‑1抑制尖孢镰刀菌甜瓜专化型（Fusarium oxysporum）、蔓枯病菌（Stagonosporopsis cucurbitacearum）、黑点根腐病菌（Monosporascus cannonballus）或亚洲镰刀菌（Fusarium asiaticum）的一种或多种。 [0009] 作为一种实施案例，使用时，将包含所述贝莱斯芽孢杆菌Bc3‑1的悬浮菌液沿着甜瓜幼苗的根部灌入。 [0011] 本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。 附图说明[0013] 图1是本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株Bc3‑1在NA培养基上的菌落形态。 [0014] 图2是本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株Bc3‑1基于16S‑rRNA构建的系统进化树。 [0015] 图3是本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株Bc3‑1对甜瓜的不同病原菌进行平板拮抗试验的效果图。 [0016] 图4是本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株Bc3‑1对甜瓜幼苗的促生试验结果；其中，A是试验田中实物的促生效果图，B为10棵甜瓜幼苗的实物的促生效果图，C是茎粗、茎长、子叶长宽、最大真叶长宽和鲜重的促生效果分析柱状图。 [0017] 图5是本发明菌株Bc3‑1对甜瓜枯萎病生防试验的实物效果图。 具体实施方式[0018] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。 [0019] 本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌Bc3‑1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No .26546，保藏时间为2023年2月14日。 [0020] 实施例1贝莱斯芽孢杆菌Bc3‑1的分离和鉴定(1)分离 贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）Bc3‑1是从宁波市高新农业技术实验园区的连续多年种植甜瓜大棚的土壤里分离得到的，具体做法为： 取甜瓜大棚的土壤1 g放到1.5 mL的无菌水中，混匀，然后稀释涂平板，挑取单菌落在NB培养基中，温度28℃、转速150 rpm 条件下进行摇培，再次对单菌落进行划线纯化。 [0022] (2)分子鉴定对贝莱斯芽孢杆菌Bc3‑1的分子鉴定过程包括：采用50 μL的PCR反应体系进行16S rDNA的扩增、测序及系统发育进化分析。 [0023] 拮抗细菌的基因组DNA用全式金细菌基因组试剂盒提取。扩增菌株的16S rDNA，采用细菌通用引物(27F：5’‑AGAGTTTGATCCTGGCTCAG‑3’；1492R：5’‑GGTTACCTTGTTACGACTT‑3’)进行扩增，扩增的PCR产物采用1％的琼脂糖凝胶电泳法检测，对阳性PCR产物进行纯化、克隆和测序。 [0024] 鉴定结果分析如下：贝莱斯芽孢杆菌Bc3‑1在NA培养基上培养，菌落呈乳白色，边缘不规则。以菌株Bc3‑1的基因组DNA为模板，用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，得到1514 bp的扩增产物，经连接、转化、测序，得到贝莱斯芽孢杆菌Bc3‑1的16S rDNA序列，具体参见附件的序列表。 [0025] 将测序结果在NCBI上进行BLAST比对，结果表明其与贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）WRN014（GenBankAcc .CP041361.1）的同源性最高，为100％。 [0026] 利用MEGA7对测序获得的序列和其他相近的序列进行系统发育树的构建，如图2所示，系统发育树结果表明菌株Bc3‑1与贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）的菌株聚为一支，所以认为Bc3‑1属于贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。 [0027] 实施例2 防病拮抗效果试验采用平板对峙的方法进行防病拮抗菌株的筛选，在PDA培养基上活化尖孢镰刀菌甜瓜专化型菌、蔓枯病菌、黑点根腐病菌和亚洲镰刀菌等病原菌，用直5 mm的打孔器在新鲜的菌落边缘打孔，挑取新鲜菌丝块接种在距新的PDA平板中心，用接种环挑取少量新鲜贝莱斯芽孢杆菌Bc3‑1菌液于PDA培养基的两端端划线，划线处距PDA端部距离为1 cm，封口膜封好后置于25℃培养箱中黑暗培养，10 d之后统计试验结果，每个菌株3个皿。对照组只接病原菌，不接贝莱斯芽孢杆菌Bc3‑1。试验结果如图4所示。 [0028] 如图3，可以看到：在对峙培养10 d后，贝莱斯芽孢杆菌Bc3‑1对尖孢镰刀菌甜瓜专化型（Fusarium oxysporum）、蔓枯病菌（Stagonosporopsis cucurbitacearum）、黑点根腐病菌（Monosporascus cannonballus）和亚洲镰刀菌（Fusarium asiaticum）等病原菌的生长均有抑制作用，在对峙培养过程中，培养皿中均出现了明显的拮抗带，后期对峙的病原菌也无法再生长。 [0029] 实验结果证明贝莱斯芽孢杆菌Bc3‑1菌株对甜瓜多种病原菌抑制作用明显有效，具有良好的防治效果。 [0030] 实施例4 促生试验在温室大棚中，利用盆栽试验进行拮抗细菌对甜瓜幼苗的促生试验，在甜瓜种子 8 播种第3 d、7 d和第10 d后，用拮抗细菌配置的10cfu/mL悬浮菌液对甜瓜幼苗进行灌根： 用移液器将悬浮菌液沿甜瓜幼苗根部灌入，每棵幼苗用1 mL菌液处理，共计150棵，同时用NB培养基处理的甜瓜幼苗作为对照。17 d后，完整拔出甜瓜幼苗，每个处理取30棵幼苗，只保留地上部分，测量幼苗的茎粗、茎长、子叶长宽、每株幼苗中最大一片真叶的长宽及地上部分鲜重，统计并分析数据。得到的结果如图4所示。 [0031] 结合图4的实物图和柱状图可知，用贝莱斯芽孢杆菌Bc3‑1菌悬液处理的甜瓜幼苗，17 d后，其在茎粗、鲜重、子叶长宽及最大一片真叶的长宽方面都极显著高于CK组，表明贝莱斯芽孢杆菌Bc3‑1对甜瓜幼苗有促生作用。 [0032] 实施例5 甜瓜枯萎病的盆栽生防试验处理组：贝莱斯芽孢杆菌Bc3‑1处理的甜瓜。在甜瓜播种第3 d、7 d和第10 d，用 8 10cfu/mL的Bc3‑1悬浮菌液对甜瓜幼苗进行灌根，每棵幼苗用1 mL菌液处理。每个处理对应1个穴盘，每个穴盘50株，设置3次重复。同时用NB培养基处理的甜瓜幼苗作为CK组。 [0033] 甜瓜枯萎病接种：选用的甜瓜品种为对甜瓜枯萎病感病品种，在两叶一心时，以50株幼苗为1组，重复3次，左边一半不接种，右边一半接种。将幼苗从穴盘中取出，轻度损伤根6 系，洗净根部，在4×10 个/mL的枯萎病菌孢子液中浸根15 min，根系全部浸入，中间摇动2次，不接种的在清水中浸根15 min。再移栽至营养土中，接种后前3 d遮阴，温度保持在25℃，3d缓苗后撤掉遮阳网，在温室正常管理，15 d后调查发病情况，统计分析病情指数和相对防治效果。 [0034] 病情指数＝∑(级数×该级株数)/(总株数×最高级数)×100。 [0035] 相对防治效果(％)＝(对照病情指数‑处理病情指数)/对照病情指数×100％。 [0036] 图5是本发明贝莱斯芽孢杆菌Bc3‑1菌株对甜瓜枯萎病生防试验的实物效果图，从该图可以看出：贝莱斯芽孢杆菌Bc3‑1处理的甜瓜的枯萎病病情明显优于CK组的甜瓜。 [0037] 根据统计分析病情指数和相对防治效果，贝莱斯芽孢杆菌Bc3‑1处理的甜瓜幼苗枯萎病的病情指数为41.6，CK组的病情指数97.6，用贝莱斯芽孢杆菌Bc3‑1处理的相对防治效果为57.4%。 [0038] 由此可见，本发明的贝莱斯芽孢杆菌Bc3‑1对甜瓜枯萎病具有一定的生防作用。 |
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