耐盐芽孢杆菌及其生物有机肥与应用 |
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| 申请号 | CN202410268839.7 | 申请日 | 2024-03-11 | 公开(公告)号 | CN117859769A | 公开(公告)日 | 2024-04-12 |
| 申请人 | 云南省农业科学院农业环境资源研究所; 云南省微生物研究所; | 发明人 | 孔垂思; 杨佩文; 李铭刚; 廖永琴; 赵江源; 普特; 施竹凤; 刘鑫; 施竹丽; 申云鑫; 陈艳; 鲁梦婷; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及耐盐芽孢杆菌及其 生物 有机肥 与应用，保藏编号为：CCTCC NO：M 20232276的耐盐芽孢杆菌（Bacillus halotolerans）以及包含耐盐芽孢杆菌、香菇菌糠、苕子秸秆、赤霉酸和竹叶提取物的生物有机肥可用于防治作物根腐病、提高植株 根际 土壤 有机 碳 含量、提高植株的氮吸收利用率以及提高植株根系脯 氨 酸含量。其中，耐盐芽孢杆菌为天然菌株，更容易在土壤中定植，不会对环境安全产生不利影响，能够促进农业生产可持续发展。 | ||||||
| 权利要求 | 1.保藏编号为：CCTCC NO：M 20232276的耐盐芽孢杆菌在防治作物根腐病、提高植株根际土壤有机碳含量、提高植株的氮吸收利用率以及提高植株根系脯氨酸含量中的应用。 |
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| 说明书全文 | 耐盐芽孢杆菌及其生物有机肥与应用技术领域[0001] 本发明属于生物技术领域，具体的说，涉及耐盐芽孢杆菌及其生物有机肥与应用。 背景技术[0002] 近年来，随着高附加值作物的连年种植和保护地的发展，土传病害逐年加重，如果不及时干预，严重时会导致作物绝收。尤其是土传病害中的真菌性病害，可以导致植物的生长受到严重影响，如细胞腐烂、叶片凋零、花序变形等，甚至死亡。但是在病害的防治中，在防治土传病害时，采用单一，特别是具有针对性的药剂，不仅难以达到理想的防治效果，而且会使病原物产生抗药性。 [0003] 近10年来，随着人们对环境的关注，绿色发展成为农业生产的主流。在土传病害的防治中，要尽可能减少对环境和生态的影响，同时保证取得更好的经济效益。与化学农药相比，生物农药防治则是利用微生物制剂和植物制剂来抑制病原体的生长，逐渐成为当前的热点研究领域。微生物制剂可以通过促进土壤中的微生物多样性，增加土壤肥力和作物品质，提高植物的免疫力和抗性。此外生物有机肥中含有活的微生物，可以促进作物的生长。与化肥相比，生物有机肥具有高碳氮比和肥效全面的特点，其对土壤理化性质具有较好改良效果，可提高土壤微生物活性，以及提高土壤肥力和农作物产量和品质，在环境保护和促进土壤物质循环方面有着重要的意义。 [0004] 此外，目前使用的生物有机肥通常采用经过突变或定向改造的菌株，这些菌株往往在实际应用中会受到环境因素的限制，难以在土壤或植物中定植、生长和发挥应有的作用。因此，基于自然菌株的生物有机肥料研究逐渐成为了本领域的热点。 [0005] 综上所述，对于作物病害的生物防控，需要尽可能减少对环境和生态的影响，同时保证取得更好的经济效益，而生物有机肥作为一种新兴的肥料类型，需要在基于天然菌株的前提下进一步研究和应用，以提高其制备技术和应用效果。 发明内容[0006] 为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供了耐盐芽孢杆菌及其生物有机肥与应用。本发明提供的耐盐芽孢杆菌是一株天然的植物根际菌，相比于基因工程改造菌而言，该菌株具有更好的土壤和植物根际定殖能力，含有该菌的菌剂和生物有机肥在施用后具有防治作物根腐病、提高植株根系脯氨酸含量和根系活力等优势效果。 [0007] 为实现上述目的，本发明提供保藏编号为：CCTCC NO：M 20232276的耐盐芽孢杆菌（Bacillus halotolerans）在防治作物根腐病、提高植株根际土壤有机碳含量、提高植株的氮吸收利用率以及提高植株根系脯氨酸含量中的应用。 [0008] 本发明还提供一种生物有机肥，所述生物有机肥包含如下组分：组分A：包含重量比为7‑11：4‑6:1‑5:0.5‑1的香菇菌糠、苕子秸秆、赤霉酸、竹叶提取物； 组分B：保藏编号为：CCTCC NO：M 20232276的耐盐芽孢杆菌（Bacillus halotolerans），其中，以生物有机肥的总重计，耐盐芽孢杆菌的用量为总的0.1‑1重量％。 [0009] 本发明进一步提供生物有机肥在防治作物根腐病、提高植株根际土壤有机碳含量、提高植株的氮吸收利用率以及提高植株根系脯氨酸含量中的应用。 [0010] 本发明还提供一种防治作物根腐病的方法，方法为：将保藏编号为：CCTCC NO：M 20232276的耐盐芽孢杆菌，和/或，上述的生物有机肥施于土壤中。 [0011] 本发明的有益效果：（1）本发明提供的耐盐芽孢杆菌（Bacillus halotolerans）是一株天然菌株，具有更好的定植能力，相比于基因工程菌株或诱导突变菌株而言，更利于发挥菌株的生防特性，从而能取得优良的病害防治效果。 [0012] （2）本发明提供的生物有机肥可以有效地调节植株的代谢，并提高植株根系中脯氨酸含量和根系活力，从而可以有效地解决植株生长中病害发生严重或者植株抗性下降等问题，且可提高植株根际土壤有机碳含量。 [0013] （3）本发明提供的生物有机肥具有原料来源广、成本低廉、绿色环保等特点。同时，该肥料的制备方法也很简单，存储稳定性高。通过对肥料中原料种类和用量的甄选，使得加入耐盐芽孢杆菌时的活菌数达到较高水平。 [0015] 图1是本发明中耐盐芽孢杆菌（Bacillus halotolerans）的菌落形态图；图2是本发明中菌株YNK‑FB0022的系统发育树。 [0016] 生物保藏本发明提供的耐盐芽孢杆菌（Bacillus halotolerans），分类命名为：Bacillus halotoleransYNK‑FB0022，已于2023年11月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 20232276。 具体实施方式[0017] 在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。 [0018] 本发明中，耐盐芽孢杆菌YNK‑FB0022和耐盐芽孢杆菌CCTCC NO：M 20232276是同一菌株，其二者意义相同，其名称（编号）可以互换使用。 [0019] 本发明的耐盐芽孢杆菌YNK‑FB0022已在期刊微生物学通报公开，论文主题名称为：三株酚酸降解菌的筛选与鉴定及其生物活性（https://doi.org/10.13344/j.microbiol.china.230726）。 [0020] 本发明的发明人在研究的过程中分离获得一株耐盐芽孢杆菌（Bacillus halotolerans），命名为YNK‑FB0022，于2023年11月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20232276。经过进一步研究，将该耐盐芽孢杆菌施用于土壤中时，能够有效防治作物根腐病，提高植株根际土壤有机碳含量、提高植株的氮吸收利用率以及提高植株根系脯氨酸含量。 [0021] 基于此，本发明第一方面提供保藏编号为：CCTCC NO：M 20232276的耐盐芽孢杆菌（Bacillus halotolerans）在防治作物根腐病、提高植株根际土壤有机碳含量、提高植株的氮吸收利用率以及提高植株根系脯氨酸含量中的应用。 [0022] 本发明的发明人在研究中论证了，将本发明提供的耐盐芽孢杆菌单独或与某些有机肥物料一同施用于土壤中时能够有效促防治作物根腐病，提高植株根际土壤有机碳含量，提高植株的氮吸收利用率以及提高植株根系脯氨酸含量和根系活力，从而促进植株生长以及提高植株的系统抗性。 [0023] 基于此，本发明第二方面提供一种生物有机肥，生物有机肥包含：组分A：包含重量比为7‑11：4‑6:1‑5:0.5‑1的香菇菌糠、苕子秸秆、赤霉酸、竹叶提取物； 组分B：包含组分A总重0.1‑1%的保藏编号为：CCTCC NO：M 20232276的耐盐芽孢杆菌（Bacillus halotolerans）。 [0024] 将香菇菌糠、苕子秸秆、赤霉酸和竹叶提取物等混合制成的生物有机肥施用于土壤中时，可有效防治作物根腐病，提高植株根际土壤有机碳含量，提高植株的氮吸收利用率以及提高植株根系脯氨酸含量和根系活力，降低化学农药和肥料的使用量。经过发明人进一步研究发现，在上述成分制备的生物有机肥的基础上加入本发明提供的耐盐芽孢杆菌CCTCC NO：M 20232276，还能够进一步提高其效果。 [0025] 本发明中，对于用作有机肥的原料（如香菇菌糠、苕子秸秆、赤霉酸和竹叶提取物等）没有特别限制，其可以是本领域任意能够用于液态肥制备的相关产品，既可以是商购获得的相关产品，也可以是按照现有技术自行制备的相关产品。 [0026] 根据本发明的优选实施方式，其中，所述香菇菌糠中水分含量为10‑15重量％；所述香菇菌糠中，以干物质计，粗蛋白含量为10‑15重量％，粗纤维含量为8‑12重量％，粗脂肪含量为0.1‑0.5重量%，无氮浸出物55‑60重量％，钙含量为2‑5重量％；和/或，所述苕子秸秆中，水分含量为20‑30%，以干物质计，纤维素含量为55‑65重量％，粗蛋白含量为5‑10重量％；和/或，所述竹叶提取物中，以干物质计，竹叶黄酮含量为10‑15%。 [0027] 优选的，以生物有机肥总重量计，耐盐芽孢杆菌的用量为0.1‑1重量％。优选为0.3‑0.8重量%。更优选为0.5‑0.8重量%。 [0028] 更优选地，所述生物有机肥中耐盐芽孢杆菌的含量为不低于1×109cfu/mL。优选9 12 9 12 10 为1×10 ‑5×10 cfu/mL。更优选为2×10 ‑5×10 cfu/mL。进一步优选为1×10 ‑2× 12 10 cfu/mL。当在生物有机肥中以固体生物有机肥的形式添加所述耐盐芽孢杆菌时，按照 1mL最终获得的生物有机肥即为1g的比例换算添加后生物有机肥中的耐盐芽孢杆菌含量。 [0029] 本发明第三方面提供第一方面所述的耐盐芽孢杆菌、第二方面所述的生物有机肥在防治植物病害、提高植株根际土壤有机碳含量、提高植株的氮吸收利用率以及提高植株根系脯氨酸含量和根系活力中的应用。 [0030] 其中，所述植株为洋桔梗、番茄、秋葵、当归。 [0031] 其中，所述植物病害为洋桔梗根腐病、番茄根腐病、秋葵根腐病、当归根腐病。 [0032] 本发明中，防治病害是指降低病害的发病率，以及，调节土壤养分结构（例如提高土壤有机碳含量以及植株的氮吸收利用率），提高植株系统抗性（例如提高植株根系脯氨酸含量和根系活力等）。 [0033] 本发明第四方面提供一种防治作物根腐病的方法，所述方法包括将第一方面所述的耐盐芽孢杆菌，和/或，第二方面所述的生物有机肥施用于土壤中。 [0034] 也即，上述方法包括以下方式：（1）将耐盐芽孢杆菌或生物有机肥单独施用于土壤中； （2）将耐盐芽孢杆菌和生物有机肥一起施用于土壤中。 [0036] 本发明中对于耐盐芽孢杆菌以及生物有机肥的具体用量没有特别限制，只要能够起到降低病害的发病率，以及提高植株根系系统抗性的作用即可。 [0037] 根据本发明的一种优选实施方式，其中，对于上述方式（1）和（2），所述耐盐芽孢杆9 菌、生物有机肥的施用量以耐盐芽孢杆菌的用量不低于1×10cfu/株/次为准。优选为1× 9 13 9 11 9 10‑1×10 cfu/株/次。更优选为3×10‑3×10 cfu/株/次。例如可以为3×10cfu/株/次、 9 9 9 9 10 4×10cfu/株/次、5×10cfu/株/次、6×10cfu/株/次、8×10cfu/株/次、1×10 cfu/株/ 10 10 11 11 次、5×10 cfu/株/次、8×10 cfu/株/次、1×10 cfu/株/次、2×10 cfu/株/次、3× 11 10 cfu/株/次，或者也可以为上述任意两个数值的任意中间值。耐盐芽孢杆菌的用量为按照有机肥或生物有机肥的施用量以及其中所含耐盐芽孢杆菌数量计算获得，当在生物有机肥中以固体生物有机肥的形式添加所述耐盐芽孢杆菌时，按照1mL最终获得的生物有机肥即为1g的比例换算添加后生物有机肥中的耐盐芽孢杆菌含量。 [0038] 优选地，所述耐盐芽孢杆菌、生物有机肥的施用频率为种植前15‑20天作为底肥施用1次。 [0039] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。 [0040] 实施例一 菌株的分离、筛选及保藏本实施例用于说明本发明提供的耐盐芽孢杆菌YNK‑FB0022的分离、筛选及保藏。 [0041] 1、菌株的分离菌株分离和纯化过程中采用NA培养基，配制方法如下：蛋白胨10.00 g，牛肉粉 3.00 g，氯化钠5.00g，琼脂15.00 g，pH值7.30±0.12，121 ℃蒸汽灭菌20 min备用，采用稀释涂布平板法和平板划线法从采集自无量山国家自然保护区的华山松根际土壤样品中分离纯化得到一株细菌，命名为YNK‑FB0022。 [0042] 2、菌株的鉴定2.1、细菌形态特征及生理生化特征鉴定 参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对菌株YNK‑FS0019进行生理生化测定，描述菌落形态特性。 [0043] 菌落&细胞形态：图1示出了菌株YNK‑FB0022在NA培养基上的菌落形态，从图中可以看出，该菌株菌落近圆形，不透明表面光滑，呈乳白色。 [0045] 2.2、分子鉴定采用Chelex提取法提取菌株YNK‑FB0022的总DNA作为模板，采用27F（5’‑ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG‑3’）作为上游引物，1492R（5’‑TACGGCTACCTTGTTACGACTT‑3’）作为下游引物，采用表1中的反应体系和条件进行16S rRNA扩增。 [0046] 表1 PCR体系和条件扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，（采用广州美基生物科技有限公司生产的胶回收纯化试剂盒）纯化回收后，送至北京擎科生物科技有限公司进行测序，测序结果如（GenBank 登录号OR523290）所示。测序结果经在NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和EZBiocloud数据库(https://www.ezbiocloud.net/)比对分析。采用系统发育学分析方法，选用同源性较高的模式菌株16S rRNA序列作为参比对象，用Clustal X 1.8软件进行多序列比对，计算供试菌株与参比菌株序列的相似性。系统发育分析时排除碱基缺失位点，采用邻接法（Neighbor‑joininganalysis）用MEGA 7.0构建供试菌株与参比菌株之间的系统发育树。其中，Bootstrap值设定为1000，其余均为默认值。 [0047] 图2示出了绘制的菌株YNK‑FB0022的系统发育树，从中可以看出，YNK‑FB0022与耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans) LPVF01000003同源性最高。结合菌株YNK‑FB0022的分子检测结果以及细菌形态特征及生理生化特征检测结果，鉴定该菌株为耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)。 [0048] 3、菌株的保藏已于2023年11月20日将耐盐芽孢杆菌YNK‑FB0022（Bacillus halotolerans）保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为：Bacillus halotoleransYNK‑FB0022，保藏单位地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 20232276。 [0049] 实施例二生物有机肥的制备本实施例用于说明本发明提供的耐盐芽孢杆菌YNK‑FB0022生物有机肥的制备过程。 [0050] 包括如下步骤：（1）将上述的耐盐芽孢杆菌在固体培养基中进行固体培养获得试管种； （2）制备液体种子培养基，并在其中接种试管种进行液体培养制得液体种子； （3）配制液体发酵培养基，并在其中接种液体种子进行发酵。 [0051] 步骤(1)中，所述耐盐芽孢杆菌采用斜面接种的方式进行接种，所述固体培养在温度为25‑30℃培养40‑50h；所述固体培养基包括：葡萄糖10‑12g/L，琼脂15‑20g/L，牛肉浸膏3‑5g/L，酵母浸膏1‑3g/L，蛋白胨10‑15g/L，pH＝6.5‑7.5。 [0052] 步骤(2)中，试管种接种到液体种子培养基中，所述液体培养在温度为25‑30℃、转速为200‑250r/min的条件下处理45‑50h；所述液体种子培养基包括：蛋白胨10‑15g/L，牛肉浸膏3‑5g/L，氯化钠10‑12g/L，pH＝6.5‑7.5。 [0053] 该步骤中，液体种子培养基优选在120‑125℃下灭菌20‑30min，冷却后在100mL液2 体种子培养基中接入0.5‑1.5cm 的试管种，并在28‑30℃下在转速为220‑250r/min的摇床上培养45‑50h得液体种子。 [0054] 步骤(3)中，液体种子在液体发酵培养基中按照体积比为0.05‑0.1:1的接种量接种，并在温度为25‑30℃、转速为200‑250r/min的条件下处理45‑50h；所述液体发酵培养基包括：蔗糖20‑23g/L，蛋白胨10‑15g/L，酵母浸膏5‑8g/L，磷酸二氢钾3‑5g/L，硫酸铵5‑8g/L，碳酸钙2‑4g/L，pH＝6.5‑7.5。 [0055] 该步骤中，液体发酵培养基优选在120‑125℃灭菌20‑30min，冷却后接种液体种子，并优选在28‑30℃下于转速为220‑250r/min的摇床上培养45‑50h制得发酵液。 [0056] 上述制备步骤还包括：培养结束后采用适量新鲜NB培养基将获得的培养液进行稀释，获得活菌数约为2 10 ×10 cfu/mL的耐盐芽孢杆菌液体菌剂。将液体菌剂干燥处理获得干粉制剂，活菌数约为2 10 ×10 cfu/g。 [0057] 实施例三生物有机肥的制备本实施例用于说明本发明提供的生物有机肥的制备过程。 [0058] 生物有机肥的配方详见表2，其中香菇菌糠、苕子秸秆、赤霉酸、竹叶提取物的物料成分检测结果详见表1(其中水含量以物料总重量为基准计算，其余成分以物料中干物质为基准计算)。粗蛋白含量采用凯式定氮法测定，粗纤维含量采用酸水解‑蒽酮比色法测定，粗脂肪含量采用索式提取法测定，无氮提取物含量采用近红外分析法测定，钙含量采用火焰原子吸收光谱法测定。生物有机肥由实施例2制备得到。香菇多糖购自陕西忆瑞农生物科技有限公司，赤霉酸购自上海富氏达生物科技有限公司，竹叶提取物购自江苏思腾生物科技有限公司，收集苕子的秸秆切断混合之后发酵腐熟3‑5个月即得苕子秸秆。生物有机肥的具体配制方法：按照表2中的比例称取原料，1 L/kg加水，混合均匀即获得生物有机肥。 [0059] 表2生物有机肥物料成分表3 生物有机肥配方 实施例四耐盐芽孢杆菌、含有该菌的生物有机肥对植株的施用效果 本实施例用于说明本发明提供的耐盐芽孢杆菌YNK‑FB0022和生物有机肥对植物的施用效果。 [0060] （1）本实施例采用的生物有机肥由实施例3制备得到，按照表3中的用量，将实施例3制备得到的生物有机肥施用于植株根际土壤中，然后在其他条件均保持一致的情况下同时进行培养。具体施肥方式：在作物种植前15‑20天，将生物有机肥作为底肥施用。用量为使 9 得耐盐芽孢杆菌的用量不低于1×10cfu/株/次为准；耐盐芽孢杆菌或生物有机肥的施用频率为种植前15‑20天作为底肥施用1次。 [0061] （2）采用实施例2制备得到的菌剂，按实施例4中（1）的方法施用于植株根际土壤中，记为D7。 [0062] （3）对照组为不做任何处理，化肥组为常规施肥，其中尿素、过磷酸钙和硫酸钾自行配制，N、P、K的重量比为16.7:9.2:21.6。 [0063] 施肥后，于采收期调查病害发病情况，记录并计算防治效果，采集植株根际土壤以及采集植株根系。具体测量各组作物根际土壤有机碳含量，测定植株的氮吸收利用率，以及测定植株根系脯氨酸含量和根系活力，并测定病害的防控效果。 [0064] 根腐病病害调查方法：0级：无症状 1级：根部出现少量病斑0‑10%。 [0065] 3级：根部出现部分病斑10‑25%。 [0066] 5级：根部完全侵染。 [0067] 7级：植株死亡。 [0068] 计算发病率和病情指数。 [0069] 发病率=发病株数/调查总株数*100病情指数=（∑（各级病株*该病级数）/调查总株数*最高级数）*100 植株根际土壤有机碳含量的测定，采用有机碳（g/kg）含量采用重铬酸钾氧化‑分光光度法测定； 植株根系脯氨酸（μg/g）含量和根系活力（mg/g/h）均使用试剂盒进行测定，试剂盒购自苏州格锐思生物技术有限公司，使用方法参照说明书。 [0070] 植株的氮吸收利用率（NRE）的测定方法：分别为测定试验处理组（GN）和对照处理组（GO）作物根系吸氮量，并记录各处理的施肥量（NN），采用凯氏定氮法测定，并采用以下公式计算植株的氮吸收利用率：NRE（%）=（GN‑G）O /NN×100。 [0071] 从表4、5、6、7中的数据可以看出，施用本发明提供的生物有机肥的情况下，对作物病害的防控作用以及对植株根际土壤有机碳含量、植株根系脯氨酸含量、根系活力以及植株的氮素吸收利用率的提高效果强于对照。 [0072] 表4生物有机肥对作物根腐病防控试验测试条件及结果表5 生物有机肥施用对作物根际土壤有机碳含量的影响 表6生物有机肥施用对作物根系脯氨酸含量和根系活力的影响 表7生物有机肥施用对植株的氮吸收利用率的影响 最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其做出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。 |
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