一种组成型表达铁固氮酶的耐铵光合固氮菌及其构建与应用 |
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| 申请号 | CN202211220933.2 | 申请日 | 2022-10-08 | 公开(公告)号 | CN117844839A | 公开(公告)日 | 2024-04-09 |
| 申请人 | 中国科学院微生物研究所; | 发明人 | 郑艳宁; 曾艳; 黄璐; 姜明月; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种组成型表达 铁 固氮酶的耐铵光合固氮菌及其构建与应用。本发明公开的组成型表达铁固氮酶的耐铵光合固氮菌，其构建方法包括：敲除受体菌的vnfHDGK基因、anfHDGK或anfHDGK123基因、nifHDK基因，并导入由nifH基因启动子驱动表达的anfHDGK或anfHDGK123基因，得到目的菌。本发明的耐铵光合固氮菌，解除了铵对固氮酶表达的抑制，实现了铁固氮酶的组成型表达，有铵条件下的固氮效率显著高于野生型菌株CGA009。本发明的耐铵基因工程菌满足工业生产需求，具有广阔的商业价值。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种重组菌的制备方法，包括对受体菌进行包括如下1)‑4)的改造，得到重组菌： |
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| 说明书全文 | 一种组成型表达铁固氮酶的耐铵光合固氮菌及其构建与应用技术领域[0001] 本发明涉及基因工程领域中，一种组成型表达铁固氮酶的耐铵光合固氮菌及其构建与应用。 背景技术[0002] 沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)是一种自生光合固氮菌，营化能异养或光能异养生活，能够适应各种环境条件。生物固氮过程在微生物细胞内是一个高度耗能的过程。沼泽红假单胞菌可以直接利用光能来进行ATP的合成，保证了固氮过程的能量供给。此外，还可以利用无机碳源如乙酸盐，或有机碳源如农业废物木质素等产生还原力，来满足大量耗能的固氮反应，使固氮酶可以充分发挥其催化活性。而且对植物没有选择性，具有广泛应用于粮食作物生产中的潜力，以达到减少工业氮肥使用的目的。因此，利用光合固氮菌沼泽红假单胞菌作为底盘菌种，很好地解决了固氮所需的大量ATP和还原力来源的问题，同时，在降解农业废物，维护环境等方面也做出了重要的贡献。 [0003] 由于钼固氮酶和钒固氮酶在应用时，肥料中都需额外添加金属离子，对自然环境和人体健康都有一定的影响，且抑制铁固氮酶的表达。而铁固氮酶的表达不需要外加金属离子，降低了生产成本。利用基因工程手段，对沼泽红假单胞菌的固氮酶进行精简、并通过钼固氮酶基因簇表达铁固氮酶，构建铁固氮酶组成型表达的基因工程菌，解除环境中铵对固氮酶的抑制，大幅度提高了有铵条件下的铁固氮酶表达水平，用作固氮菌肥，满足工业化生产的需要。 发明内容[0004] 本发明所要解决的技术问题是针对现有方法制备固氮菌肥受铵抑制、需要额外添加钼肥、不利人体健康等缺陷，提供了一种基因工程菌的构建方法及其应用。将本发明的基因工程菌应用于固氮菌肥的生产时，不需额外添加钼肥，且在有铵条件下，固氮效率显著高于野生型菌株，满足固氮菌肥的工业生产需求。 [0005] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种重组菌的制备方法，所述方法包括对受体菌进行包括如下1)‑4)的改造，得到重组菌： [0006] 1)敲除所述受体菌的VnfH蛋白质的编码基因、VnfD蛋白质的编码基因、VnfG蛋白质的编码基因和VnfK蛋白质的编码基因，或抑制所述VnfH蛋白质的编码基因、所述VnfD蛋白质的编码基因、所述VnfG蛋白质的编码基因和所述VnfK蛋白质的编码基因的表达，或抑制所述VnfH蛋白质、所述VnfD蛋白质、所述VnfG蛋白质和所述VnfK蛋白质的活性； [0007] 2)包括2A)或2B)： [0008] 2A)敲除所述受体菌的AnfH蛋白质的编码基因、AnfD蛋白质的编码基因、AnfG蛋白质的编码基因、AnfK蛋白质的编码基因，或抑制所述AnfH蛋白质的编码基因、所述AnfD蛋白质的编码基因、所述AnfG蛋白质的编码基因和所述AnfK蛋白质的编码基因的表达，或抑制所述AnfH蛋白质、所述AnfD蛋白质、所述AnfG蛋白质和所述AnfK蛋白质的活性； [0009] 2B)敲除所述受体菌的所述AnfH蛋白质的编码基因、所述AnfD蛋白质的编码基因、所述AnfG蛋白质的编码基因、所述AnfK蛋白质的编码基因、Anf1蛋白质的编码基因、Anf2蛋白质的编码基因和Anf3蛋白质的编码基因，或抑制所述AnfH蛋白质的编码基因、所述AnfD蛋白质的编码基因、所述AnfG蛋白质的编码基因、所述AnfK蛋白质的编码基因、所述Anf1蛋白质的编码基因、所述Anf2蛋白质的编码基因和所述Anf3蛋白质的编码基因的表达，或抑制所述AnfH蛋白质、所述AnfD蛋白质、所述AnfG蛋白质、所述AnfK蛋白质、所述Anf1蛋白质、所述Anf2蛋白质和所述Anf3蛋白质的活性； [0010] 3)敲除所述受体菌的NifH蛋白质的编码基因、NifD蛋白质的编码基因和NifK蛋白质的编码基因，或抑制所述NifH蛋白质的编码基因、所述NifD蛋白质的编码基因和所述NifK蛋白质的编码基因的表达，或抑制所述NifH蛋白质、所述NifD蛋白质和所述NifK蛋白质的活性； [0011] 4)包括4A)或4B)： [0012] 4A)向所述受体菌中导入所述AnfH蛋白质的编码基因、所述AnfD蛋白质的编码基因、所述AnfG蛋白质的编码基因和所述AnfK蛋白质的编码基因，并使所述AnfH蛋白质的编码基因、所述AnfD蛋白质的编码基因、所述AnfG蛋白质的编码基因和所述AnfK蛋白质的编码基因得到表达； [0013] 4B)向所述受体菌中导入所述AnfH蛋白质的编码基因、所述AnfD蛋白质的编码基因、所述AnfG蛋白质的编码基因、所述AnfK蛋白质的编码基因、所述Anf1蛋白质的编码基因、所述Anf2蛋白质的编码基因和所述Anf3蛋白质的编码基因，并使所述AnfH蛋白质的编码基因、所述AnfD蛋白质的编码基因、所述AnfG蛋白质的编码基因、所述AnfK蛋白质的编码基因、所述Anf1蛋白质的编码基因、所述Anf2蛋白质的编码基因和所述Anf3蛋白质的编码基因得到表达。 [0014] 上述方法中，所述受体菌可为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)。 [0015] 具体的，所述沼泽红假单胞菌可为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)CGA676、CGA009、CGA7553、CGA755或CGA7554。 [0017] 所述VnfD蛋白质的序列可如序列表中SEQ ID NO.6所示； [0018] 所述VnfG蛋白质的序列可如序列表中SEQ ID NO.7所示； [0019] 所述VnfK蛋白质的序列可如序列表中SEQ ID NO.8所示； [0020] 所述AnfH蛋白质的序列可如序列表中SEQ ID NO.9所示； [0021] 所述AnfD蛋白质的序列可如序列表中SEQ ID NO.10所示； [0022] 所述AnfG蛋白质的序列可如序列表中SEQ ID NO.11所示； [0023] 所述AnfK蛋白质的序列可如序列表中SEQ ID NO.12所示； [0024] 所述Anf1蛋白质的序列可如序列表中SEQ ID NO.13所示； [0025] 所述Anf2蛋白质的序列可如序列表中SEQ ID NO.14所示； [0026] 所述Anf3蛋白质的序列可如序列表中SEQ ID NO.15所示； [0027] 所述NifH蛋白质的序列可如序列表中SEQ ID NO.16所示； [0028] 所述NifD蛋白质的序列可如序列表中SEQ ID NO.17所示； [0029] 所述NifK蛋白质的序列可如序列表中SEQ ID NO.18所示。 [0030] 上述方法中，所述vnfH蛋白质的编码基因的序列可如序列表中SEQ ID NO.1所示； [0031] 所述vnfD蛋白质的编码基因的序列可如序列表中SEQ ID NO.2的第1‑1419位所示； [0032] 所述vnfG蛋白质的编码基因的序列可如序列表中SEQ ID NO.2的第1416‑1757位所示； [0033] 所述vnfK蛋白质的编码基因的序列可如序列表中SEQ ID NO.2的第1821‑3209位所示； [0034] 所述anfH蛋白质的编码基因的序列可如序列表中SEQ ID NO.3的第1‑828位所示； [0035] 所述anfD蛋白质的编码基因的序列可如序列表中SEQ ID NO.3的第878‑2446位所示； [0036] 所述anfG蛋白质的编码基因的序列可如序列表中SEQ ID NO.3的第2459‑2899位所示； [0037] 所述anfK蛋白质的编码基因的序列可如序列表中SEQ ID NO.3的第2912‑4297位所示； [0038] 所述anf1蛋白质的编码基因的序列可如序列表中SEQ ID NO.3的第4377‑5069位所示； [0039] 所述anf2蛋白质的编码基因的序列可如序列表中SEQ ID NO.3的第5066‑5656位所示； [0040] 所述anf3蛋白质的编码基因的序列可如序列表中SEQ ID NO.3的第5714‑6244位所示； [0041] 所述nifH蛋白质的编码基因的序列可如序列表中SEQ ID NO.4的第1‑897位所示； [0042] 所述nifD蛋白质的编码基因的序列可如序列表中SEQ ID NO.4的第969‑2432位所示； [0043] 所述nifK蛋白质的编码基因的序列可如序列表中SEQ ID NO.4的第2521‑4080位所示。 [0044] 上述方法中，步骤4A)中，所述AnfH蛋白质的编码基因、所述AnfD蛋白质的编码基因、所述AnfG蛋白质的编码基因和所述AnfK蛋白质的编码基因的表达可由所述NifH蛋白质的编码基因的启动子(即PnifH)驱动； [0045] 步骤4B)中，所述AnfH蛋白质的编码基因、所述AnfD蛋白质的编码基因、所述AnfG蛋白质的编码基因、所述AnfK蛋白质的编码基因、所述Anf1蛋白质的编码基因、所述Anf2蛋白质的编码基因和所述Anf3蛋白质的编码基因的表达可由所述NifH蛋白质的编码基因的启动子(即PnifH)驱动。 [0046] 上述方法中，所述NifH蛋白质的编码基因的启动子可如序列表中SEQ ID NO.19所示。 [0047] 上述方法中，步骤3)和4A)可通过将所述受体菌的所述NifH蛋白质的编码基因、所述NifD蛋白质的编码基因和所述NifK蛋白质的编码基因替换为所述AnfH蛋白质的编码基因、所述AnfD蛋白质的编码基因、所述AnfG蛋白质的编码基因和所述AnfK蛋白质的编码基因实现； [0048] 步骤3)和4B)可通过将所述受体菌的所述NifH蛋白质的编码基因、所述NifD蛋白质的编码基因和所述NifK蛋白质的编码基因替换为所述AnfH蛋白质的编码基因、所述AnfD蛋白质的编码基因、所述AnfG蛋白质的编码基因、所述AnfK蛋白质的编码基因、所述Anf1蛋白质的编码基因、所述Anf2蛋白质的编码基因和所述Anf3蛋白质的编码基因实现。 [0049] 进一步，步骤3)和4A)可通过将SEQ ID NO.4所示nifHDK基因替换为SEQ ID NO.3的第1‑4297位所示anfHDGK基因实现； [0050] 步骤3)和4B)可通过将SEQ ID NO.4所示nifHDK基因替换为SEQ ID NO.3所示anfHDGK123基因实现。 [0051] 利用所述的方法得到的重组菌，也属于本发明的保护范围。 [0052] 所述重组菌在制备微生物肥料中的应用，或在制备固氮菌肥中的应用，也属于本发明的保护范围。 [0053] 本发明构建了一种仅表达铁固氮酶的耐铵基因工程菌，该菌株与现有的野生型CGA009相比，解除了铵对固氮酶表达的抑制，实现了铁固氮酶的组成型表达，有铵条件下的固氮效率显著高于野生型菌株CGA009。本发明的耐铵基因工程菌满足工业生产需求，具有广阔的商业价值。 [0054] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。附图说明 [0055] 图1是基因工程菌改造示意图。 [0056] 图2为基因工程菌的表型鉴定结果。A是基因工程菌的表型之产氢示意图；B是基因工程菌的表型之产甲烷示意图。 [0057] 图3是基因工程菌的铁固氮酶酶活检测图。 具体实施方式[0058] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。 [0059] 沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)CGA676菌株，为仅表达钼固氮酶*组成型表达的nifA 突变株，记载在“Mckinlay J B,Harwood C S.，Carbon dioxide fixation as a central redox cofactor recycling mechanism in bacteria[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2010,107(26):11669‑11675.”一文中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。 [0060] 沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)CGA009菌株，为野生型菌株，记载在“Oda,Y.et al.Functional genomic analysis of three nitrogenase isozymes in the photosynthetic bacterium Rhodopseudomonas palustris[J].JOURNAL OF BACTERIOLOGY,Nov.2005,p.7784–7794”一文中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。 [0061] 大肠杆菌(Escherichia coli)S17‑1菌株，用于接合转移，记载在“Simon R,Priefer U,Pühler A.1983.A broad host mobilization system for in vivo genetic engineering:Transposon mutagenesis in Gram‑negative bacteria[J].Bio/Technolgy 1:784–791.”一文中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。 [0062] 载体pJQ‑200SK，为适用于革兰氏阴性菌的自杀质粒，记载在“JürgenQuandt,F.Hynes M.1993.Versatile Suicide Vectors Which Allow Direct Selection for Gene Replacement in Gram‑Negative Bacteria.Gene 127:15‑21.”一文中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。 [0064] 固氮培养基(NFM)：溶剂为水，溶质及其浓度分别为12.5mM磷酸氢二钠(Na2HPO4)，12.5mM磷酸二氢钾(KH2PO4)，1mL/L浓缩碱，0.1mM硫代硫酸钠(Na2S2O3)，2mg/L对氨基苯甲酸(PABA)，20mM醋酸钠。 [0065] 非固氮培养基(PM)：在固氮培养基中加入硫酸铵得到的硫酸铵的质量百分含量为0.1％的培养基。 [0066] 含钼非固氮培养基(PM+Mo)：在非固氮培养基中加入终浓度为10μM的钼酸钠(Na2MoO4)。 [0067] 非固氮固体培养基：在非固氮培养基中加入1.5‑2％的琼脂粉，并将其中的20mM醋酸钠替换为10mM丁二酸钠得到的固体培养基。 [0068] PM抗性培养基：在非固氮固体培养基中加入庆大霉素得到的庆大霉素浓度为100μg/mL的固体培养基。 [0069] PM蔗糖培养基：在非固氮固体培养基中加入蔗糖得到的蔗糖质量百分含量为10％的固体培养基。 [0070] PM抗性加蔗糖培养基：在非固氮固体培养基中加入蔗糖和庆大霉素得到的蔗糖质量百分含量为10％、庆大霉素浓度为100μg/mL的固体培养基。 [0072] LB培养基：溶剂为水，溶质及其浓度分别为0.5g/100mL酵母粉，1g/100mL胰蛋白胨，1g/100mLNaCl。121℃灭菌。根据需要加入20μg/mL庆大霉素。 [0073] LB固体培养基：在LB培养基中加入终浓度为1.5‑2％的琼脂粉。121℃灭菌。 [0074] 浓缩碱：溶剂为水，溶质及其浓度分别为20g/L氨基三乙酸(NTA)，28.9g/L无水硫酸镁(MgSO4)，6.67g/L CaCl2·2H2O，0.198g/L FeSO4·7H2O，100mL/L Metal 44。将NTA分别溶解在600mL水中并用KOH(14.6g KOH)中和，加入其他组分，并按给出的顺序溶解。在制成1L的最终体积之前调节pH值至6.8。当用KOH将pH值从酸性调节到6.8时会形成沉淀(需要大约100mL的1M KOH)，但最终会在搅拌下重新溶解。当pH值接近6.8时，溶液的颜色由深黄色变为稻草绿色。过滤除菌，保存在铝箔包裹的玻璃瓶中。4℃保存至少一年。 [0075] Metal 44：溶剂为水，溶质及其浓度分别为2.5g/L EDTA，10.95g/L ZnSO4·7H2O，5g/LFeSO4·7H2O，1.54g/L MnSO4·H2O，0.392g/L CuSO4·5H2O，0.25g/L Co(NO3)2·6H2O， 0.177g/L Na2B4O7·10H2O。将EDTA添加到800mL蒸馏水中并搅拌，并用10M NaOH调节pH值约 5.0，使EDTA溶解。按给定的顺序添加其他金属化合物(在前一种完全溶解之前不要添加组分)，然后补足体积1L(最终pH值约为2.4，呈澄清的柠檬绿色溶液)。过滤除菌，保存在铝箔包裹的玻璃瓶中。4℃可无限期保存。 [0076] 溶液A：50mM Tris‑HCl，pH8.0。过滤除菌。 [0077] 固氮菌表型和固氮酶活性的气相分析方法为： [0078] 气相色谱条件：使用氢火焰离子化检测器(FID，flame ionization detector)和Porapak N柱(matrix 80/100,6.0ft(1.8m)×1/8in.×2.1mm)检测甲烷、乙炔、乙烯和乙烷，进样器、检测器和柱温箱的温度分别为120℃，60℃，150℃，氩气为载体，流速为25mL/min。使用热导检测器(TCD，Thermal Conductivity Detector)和Molecular Sieve5A色谱柱(matrix 60/80,6.0ft(1.8m)×1/8in.×2.1mm)检测氢气。进样器、检测器和柱温箱的温度分别为85℃，60℃，120℃，氩气为载体，流速为25mL/min。进样量为100μL。 [0079] 实施例1、基因工程菌的构建 [0080] (1)固氮酶结构基因的敲除 [0081] 以沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)CGA676菌株为出发菌株，将其钼、钒、铁固氮酶结构基因进行敲除(图1)，即同时敲除nifHDK、vnfHDGK和anfHDGK，或同时敲除nifHDK、vnfHDGK和anfHDGK123。以删除目的基因序列的上下游各约1000bp作为同源臂，通过同源重组的方法构建在质粒pJQ‑200SK的PstI酶切位点上(引物序列如表1所示)，构建的质粒转入大肠杆菌S17‑1中。沼泽红假单胞菌CGA676菌株中，vnfH、vnfDGK、anfHDGK123、nifHDK的核苷酸序列分别为序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4。 [0082] 具体步骤如下： [0083] 分别以沼泽红假单胞菌CGA676菌株的基因组DNA为模板，利用pJQ‑N‑up‑F与pJQ‑N‑up‑R(引物序列如表1)进行PCR扩增，所得PCR产物为nifHDK基因上游的约1000bp的同源臂，利用pJQ‑N‑down‑F与pJQ‑N‑down‑R(引物序列如表1)进行PCR扩增，所得PCR产物为nifHDK基因下游的约1000bp的同源臂；将所得上下游同源臂，以同源重组的方法构建在质粒pJQ‑200SK的PstI酶切位点上，将得到的序列正确的含有上游同源臂和下游同源臂的重组质粒记为pJQ‑nifHDK；将pJQ‑nifHDK转入大肠杆菌S17‑1中，然后将所得携带1种重组质粒的重组菌株接合转化沼泽红假单胞菌CGA676菌株。依次通过CA固体培养基、PM抗性培养基、PM蔗糖培养基、PM抗性加蔗糖培养基筛选，最后在PM抗性加蔗糖培养基上不长，在PM蔗糖培养基上长的即为可能正确的单克隆。通过PCR鉴定和测序，序列正确的菌落即为构建成功的菌，挑取对应菌落接种于PM培养基中，30℃、光照静置培养，获得nifHDK敲除菌，记为CGA676‑ΔnifHDK，保存甘油管于‑80℃，长期贮存。 [0084] 分别以沼泽红假单胞菌CGA676‑ΔnifHDK菌株的基因组DNA为模板，利用pJQ‑V1‑up‑F与pJQ‑V1‑up‑R(引物序列如表1)进行PCR扩增，所得PCR产物为vnfH基因上游的约1000bp的同源臂，利用pJQ‑V1‑down‑F与pJQ‑V1‑down‑R(引物序列如表1)进行PCR扩增，所得PCR产物为vnfH基因下游的约1000bp的同源臂；将所得上下游同源臂，以同源重组的方法构建在质粒pJQ‑200SK的PstI酶切位点上，将得到的序列正确的含有上游同源臂和下游同源臂的重组质粒记为pJQ‑vnfH；将pJQ‑vnfH转入大肠杆菌S17‑1中，然后将所得携带1种重组质粒的重组菌株接合转化沼泽红假单胞菌CGA676‑ΔnifHDK菌株。依次通过CA固体培养基、PM抗性培养基、PM蔗糖培养基、PM抗性加蔗糖培养基筛选，最后在PM抗性加蔗糖培养基上不长，在PM蔗糖培养基上长的即为可能正确的单克隆。通过PCR鉴定和测序，序列正确的菌落即为构建成功的菌，挑取对应菌落接种于PM培养基中，30℃、光照静置培养，获得vnfH敲除菌，记为CGA676‑ΔnifHDKΔvnfH，保存甘油管于‑80℃，长期贮存。 [0085] 分别以沼泽红假单胞菌CGA676‑ΔnifHDKΔvnfH菌株的基因组DNA为模板，利用pJQ‑V2‑up‑F与pJQ‑V2‑up‑R(引物序列如表1)进行PCR扩增，所得PCR产物为vnfDGK基因上游的约1000bp的同源臂，利用pJQ‑V2‑down‑F与pJQ‑V2‑down‑R(引物序列如表1)进行PCR扩增，所得PCR产物为vnfDGK基因下游的约1000bp的同源臂；将所得上下游同源臂，以同源重组的方法构建在质粒pJQ‑200SK的PstI酶切位点上，将得到的序列正确的含有上游同源臂和下游同源臂的重组质粒记为pJQ‑vnfDGK；将pJQ‑vnfDGK转入大肠杆菌S17‑1中，然后将所得携带1种重组质粒的重组菌株接合转化沼泽红假单胞菌CGA676‑ΔnifHDKΔvnfH菌株。依次通过CA固体培养基、PM抗性培养基、PM蔗糖培养基、PM抗性加蔗糖培养基筛选，最后在PM抗性加蔗糖培养基上不长，在PM蔗糖培养基上长的即为可能正确的单克隆。通过PCR鉴定和测序，序列正确的菌落即为构建成功的菌，挑取对应菌落接种于PM培养基中，30℃、光照静置培养，获得vnfDGK敲除菌，记为CGA676‑ΔnifHDKΔvnfHDGK，保存甘油管于‑80℃，长期贮存。 [0086] 分别以沼泽红假单胞菌CGA676‑ΔnifHDKΔvnfHDGK菌株的基因组DNA为模板，利用pJQ‑A‑up‑F与pJQ‑A‑up‑R(引物序列如表1)进行PCR扩增，所得PCR产物为anfHDGK基因上游的约1000bp的同源臂，利用pJQ‑A‑down‑F与pJQ‑A‑down‑R(引物序列如表1)进行PCR扩增，所得PCR产物为anfHDGK基因下游的约1000bp的同源臂；将所得上下游同源臂，以同源重组的方法构建在质粒pJQ‑200SK的PstI酶切位点上，将得到的序列正确的含有上游同源臂和下游同源臂的重组质粒记为pJQ‑anfHDGK；将pJQ‑anfHDGK转入大肠杆菌S17‑1中，然后将所得携带1种重组质粒的重组菌株接合转化沼泽红假单胞菌CGA676‑ΔnifHDKΔvnfHDGK菌株。依次通过CA固体培养基、PM抗性培养基、PM蔗糖培养基、PM抗性加蔗糖培养基筛选，最后在PM抗性加蔗糖培养基上不长，在PM蔗糖培养基上长的即为可能正确的单克隆。通过PCR鉴定和测序，序列正确的菌落即为构建成功的菌，挑取对应菌落接种于PM培养基中，30℃、光照静置培养，获得anfHDGK敲除菌，记为CGA3023，保存甘油管于‑80℃，长期贮存。 [0087] CGA3023为敲除沼泽红假单胞菌CGA676菌株的vnfH、vnfDGK、anfHDGK、nifHDK基因、保持其他序列不变得到的重组菌。 [0088] vnfH基因的序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，编码SEQ ID NO.5所示的vnfH蛋白质； [0089] vnfDGK基因的序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，编码SEQ ID NO.6所示的vnfD蛋白质、SEQ ID NO.7所示的vnfG蛋白质、SEQ ID NO.8所示的vnfK蛋白质；SEQ ID NO.2的第1‑1419位为vnfD基因的序列，第1416‑1757位为vnfG基因的序列，第1821‑3209位为vnfK基因的序列； [0090] anfHDGK的序列如序列表中SEQ ID NO.3的第1‑4297位所示，编码SEQ ID NO.9所示的anfH蛋白质、SEQ ID NO.10所示的anfD蛋白质、SEQ ID NO.11所示的anfG蛋白质、SEQ ID NO.12所示的anfK蛋白质；SEQ ID NO.3的第1‑828位为anfH基因的序列，SEQ ID NO.3的第878‑2446位为anfD基因的序列，SEQ ID NO.3的第2459‑2899位为anfG基因的序列，SEQ ID NO.3的第2912‑4297位为anfK基因的序列； [0091] nifHDK基因的序列如序列表中SEQ ID NO.4所示，编码SEQ ID NO.16所示的nifH蛋白质、SEQ ID NO.17所示的nifD蛋白质、SEQ ID NO.18所示的nifK蛋白质；SEQ ID NO.4的第1‑897位为nifH基因的序列，SEQ ID NO.4的第969‑2432位为nifD基因的序列，SEQ ID NO.4的第2521‑4080位为nifK基因的序列。 [0092] 分别以沼泽红假单胞菌CGA676‑ΔnifHDKΔvnfHDGK菌株的基因组DNA为模板，利用pJQ‑A123‑up‑F与pJQ‑A123‑up‑R(引物序列如表1)进行PCR扩增，所得PCR产物为anfHDGK123基因上游的约1000bp的同源臂，利用pJQ‑A123‑down‑F与pJQ‑A123‑down‑R(引物序列如表1)进行PCR扩增，所得PCR产物为anfHDGK123基因下游的约1000bp的同源臂；将所得上下游同源臂，以同源重组的方法构建在质粒pJQ‑200SK的PstI酶切位点上，将得到的序列正确的含有上游同源臂和下游同源臂的重组质粒记为pJQ‑anfHDGK123；将pJQ‑anfHDGK123转入大肠杆菌S17‑1中，然后将所得携带1种重组质粒的重组菌株接合转化沼泽红假单胞菌CGA676‑ΔnifHDKΔvnfHDGK菌株。依次通过CA固体培养基、PM抗性培养基、PM蔗糖培养基、PM抗性加蔗糖培养基筛选，最后在PM抗性加蔗糖培养基上不长，在PM蔗糖培养基上长的即为可能正确的单克隆。通过PCR鉴定和测序，序列正确的菌落即为构建成功的菌，挑取对应菌落接种于PM培养基中，30℃、光照静置培养，获得anfHDGK123敲除菌，记为CGA3024，保存甘油管于‑80℃，长期贮存。 [0093] CGA3024为敲除沼泽红假单胞菌CGA676菌株的vnfH、vnfDGK、anfHDGK123、nifHDK基因、保持其他序列不变得到的重组菌。 [0094] anfHDGK123的序列如序列表中SEQ ID NO.3所示，编码SEQ ID NO.9所示的anfH蛋白质、SEQ ID NO.10所示的anfD蛋白质、SEQ ID NO.11所示的anfG蛋白质、SEQ ID NO.12所示的anfK蛋白质、SEQ ID NO.13所示的anf1蛋白质、SEQ ID NO.14所示的anf2蛋白质、SEQ ID NO.15所示的anf3蛋白质。SEQ ID NO.3的第4377‑5069位为anf1基因的序列，SEQ ID NO.3的第5066‑5656位为anf2基因的序列，SEQ ID NO.3的第5714‑6244位为anf3基因的序列。 [0095] 表1 [0096] [0097] [0098] (2)铁固氮酶编码基因的插入 [0099] 对上述沼泽红假单胞菌无固氮酶突变菌CGA3023或CGA3024的基因组分别做进一步改造，将铁固氮酶编码基因插入到原钼固氮酶结构基因处(图1)，即插入anfHDGK(如序列SEQ ID NO.3的第1‑4297位)或anfHDGK123(如序列SEQ ID NO.3)。具体步骤如下： [0100] 分别以沼泽红假单胞菌CGA676菌株的基因组DNA为模板，利用pJQ‑AnfH‑up‑F与pJQ‑AnfH‑up‑R(引物序列如表1)进行PCR扩增，所得PCR产物为nifHDK基因上游的约1000bp的上游同源臂，利用pJQ‑AnfH‑down‑F与pJQ‑AnfH‑down‑R(引物序列如表1)进行PCR扩增，所得PCR产物为nifHDK基因下游的约1000bp的下游同源臂，利用pJQ‑AnfH‑F与pJQ‑AnfH‑R(引物序列如表1)进行PCR扩增，所得PCR产物为anfH基因；将所得anfH基因、上下游同源臂，以同源重组的方法构建在质粒pJQ‑200SK的PstI酶切位点上，将得到的序列正确的重组质粒记为pJQ‑anfH；将pJQ‑anfH转入大肠杆菌S17‑1中，得到重组菌S17‑1/pJQ‑anfH。 [0101] 将重组菌S17‑1/pJQ‑anfH接合转化沼泽红假单胞菌CGA3023菌株。依次通过CA固体培养基、PM抗性培养基、PM蔗糖培养基、PM抗性加蔗糖培养基筛选，最后在PM抗性加蔗糖培养基上不长，在PM蔗糖培养基上长的即为可能正确的单克隆。通过菌落PCR，以基因组上同源臂外侧序列为引物，鉴定插入片段大小正确的菌落，即为基因工程菌，记为CGA3023‑anfH。 [0102] 将重组菌S17‑1/pJQ‑anfH接合转化沼泽红假单胞菌CGA3024菌株。依次通过CA固体培养基、PM抗性培养基、PM蔗糖培养基、PM抗性加蔗糖培养基筛选，最后在PM抗性加蔗糖培养基上不长，在PM蔗糖培养基上长的即为可能正确的单克隆。通过菌落PCR，以基因组上同源臂外侧序列为引物，鉴定插入片段大小正确的菌落，即为基因工程菌，记为CGA3024‑anfH。 [0103] 分别以沼泽红假单胞菌CGA676菌株的基因组DNA为模板，利用pJQ‑AnfD‑up‑F与pJQ‑AnfD‑up‑R(引物序列如表1)进行PCR扩增，所得PCR产物为PnifH‑anfH基因的约1000bp的上游同源臂，利用pJQ‑AnfD‑down‑F与pJQ‑AnfD‑down‑R(引物序列如表1)进行PCR扩增，所得PCR产物为nifHDK基因下游的约1000bp的下游同源臂，利用pJQ‑AnfD‑F与pJQ‑AnfD‑R(引物序列如表1)进行PCR扩增，所得PCR产物为anfD基因；将所得anfD基因、上下游同源臂，以同源重组的方法构建在质粒pJQ‑200SK的PstI酶切位点上，将得到的序列正确的重组质粒记为pJQ‑anfD；将pJQ‑anfD转入大肠杆菌S17‑1中，得到重组菌S17‑1/pJQ‑anfD。 [0104] 将重组菌S17‑1/pJQ‑anfD接合转化沼泽红假单胞菌CGA3023‑anfH菌株。依次通过CA固体培养基、PM抗性培养基、PM蔗糖培养基、PM抗性加蔗糖培养基筛选，最后在PM抗性加蔗糖培养基上不长，在PM蔗糖培养基上长的即为可能正确的单克隆。通过菌落PCR，以基因组上同源臂外侧序列为引物，鉴定插入片段大小正确的菌落，即为基因工程菌，记为CGA3023‑anfHD。 [0105] 将重组菌S17‑1/pJQ‑anfD接合转化沼泽红假单胞菌CGA3024‑anfH菌株。依次通过CA固体培养基、PM抗性培养基、PM蔗糖培养基、PM抗性加蔗糖培养基筛选，最后在PM抗性加蔗糖培养基上不长，在PM蔗糖培养基上长的即为可能正确的单克隆。通过菌落PCR，以基因组上同源臂外侧序列为引物，鉴定插入片段大小正确的菌落，即为基因工程菌，记为CGA3024‑anfHD。 [0106] 分别以沼泽红假单胞菌CGA676菌株的基因组DNA为模板，利用pJQ‑AnfG‑up‑F与pJQ‑AnfG‑up‑R(引物序列如表1)进行PCR扩增，所得PCR产物为anfHD基因的约1000bp的上游同源臂，利用pJQ‑AnfG‑down‑F与pJQ‑AnfG‑down‑R(引物序列如表1)进行PCR扩增，所得PCR产物为nifHDK基因下游的约1000bp的下游同源臂，利用pJQ‑AnfG‑F与pJQ‑AnfG‑R(引物序列如表1)进行PCR扩增，所得PCR产物为anfG基因；将所得anfG基因、上下游同源臂，以同源重组的方法构建在质粒pJQ‑200SK的PstI酶切位点上，将得到的序列正确的重组质粒记为pJQ‑anfG；将pJQ‑anfG转入大肠杆菌S17‑1中，得到重组菌S17‑1/pJQ‑anfG。 [0107] 将重组菌S17‑1/pJQ‑anfG接合转化沼泽红假单胞菌CGA3023‑anfHD菌株。依次通过CA固体培养基、PM抗性培养基、PM蔗糖培养基、PM抗性加蔗糖培养基筛选，最后在PM抗性加蔗糖培养基上不长，在PM蔗糖培养基上长的即为可能正确的单克隆。通过菌落PCR，以基因组上同源臂外侧序列为引物，鉴定插入片段大小正确的菌落，即为基因工程菌，记为CGA3023‑anfHDG。 [0108] 将重组菌S17‑1/pJQ‑anfG接合转化沼泽红假单胞菌CGA3024‑anfHD菌株。依次通过CA固体培养基、PM抗性培养基、PM蔗糖培养基、PM抗性加蔗糖培养基筛选，最后在PM抗性加蔗糖培养基上不长，在PM蔗糖培养基上长的即为可能正确的单克隆。通过菌落PCR，以基因组上同源臂外侧序列为引物，鉴定插入片段大小正确的菌落，即为基因工程菌，记为CGA3024‑anfHDG。 [0109] 分别以沼泽红假单胞菌CGA676菌株的基因组DNA为模板，利用pJQ‑AnfK‑up‑F与pJQ‑AnfK‑up‑R(引物序列如表1)进行PCR扩增，所得PCR产物为anfHDG基因的约1000bp的上游同源臂，利用pJQ‑AnfK‑down‑F与pJQ‑AnfK‑down‑R(引物序列如表1)进行PCR扩增，所得PCR产物为nifHDK基因下游的约1000bp的下游同源臂，利用pJQ‑AnfK‑F与pJQ‑AnfK‑R(引物序列如表1)进行PCR扩增，所得PCR产物为anfK基因；将所得anfK基因、上下游同源臂，以同源重组的方法构建在质粒pJQ‑200SK的PstI酶切位点上，将得到的序列正确的重组质粒记为pJQ‑anfK；将pJQ‑anfD转入大肠杆菌S17‑1中，得到重组菌S17‑1/pJQ‑anfK。 [0110] 将重组菌S17‑1/pJQ‑anfK接合转化沼泽红假单胞菌CGA3023‑anfHDG菌株。依次通过CA固体培养基、PM抗性培养基、PM蔗糖培养基、PM抗性加蔗糖培养基筛选，最后在PM抗性加蔗糖培养基上不长，在PM蔗糖培养基上长的即为可能正确的单克隆。通过菌落PCR，以基因组上同源臂外侧序列为引物，鉴定插入片段大小正确的菌落，即为基因工程菌，记为CGA3025，该菌株中，nifH启动子(PnifH)能够启动anfHDGK基因的表达。 [0111] 将重组菌S17‑1/pJQ‑anfK接合转化沼泽红假单胞菌CGA3024‑anfHDG菌株。依次通过CA固体培养基、PM抗性培养基、PM蔗糖培养基、PM抗性加蔗糖培养基筛选，最后在PM抗性加蔗糖培养基上不长，在PM蔗糖培养基上长的即为可能正确的单克隆。通过菌落PCR，以基因组上同源臂外侧序列为引物，鉴定插入片段大小正确的菌落，即为基因工程菌，记为CGA3026，该菌株中，nifH启动子(PnifH)能够启动anfHDGK基因的表达。 [0112] 分别以沼泽红假单胞菌CGA676菌株的基因组DNA为模板，利用pJQ‑Anf123‑up‑F与pJQ‑Anf123‑up‑R(引物序列如表1)进行PCR扩增，所得PCR产物为nifHDK基因的约1000bp的上游同源臂，利用pJQ‑Anf123‑down‑F与pJQ‑Anf123‑down‑F(引物序列如表1)进行PCR扩增，所得PCR产物为nifHDK基因的约1000bp的下游同源臂，利用pJQ‑Anf123‑F与pJQ‑Anf123‑R(引物序列如表1)进行PCR扩增，所得PCR产物为anf123基因；将所得上下游同源臂、anf123基因，分别以同源重组的方法构建在质粒pJQ‑200SK的PstI酶切位点上，将得到的序列正确的重组质粒记为pJQ‑anf123；将pJQ‑anf123转入大肠杆菌S17‑1中，得到重组菌S17‑1/pJQ‑anf123。 [0113] 将重组菌S17‑1/pJQ‑anf123接合转化沼泽红假单胞菌CGA3026菌株。依次通过CA固体培养基、PM抗性培养基、PM蔗糖培养基、PM抗性加蔗糖培养基筛选，最后在PM抗性加蔗糖培养基上不长，在PM蔗糖培养基上长的即为可能正确的单克隆。通过菌落PCR，以基因组上同源臂外侧序列为引物，鉴定插入片段大小正确的菌落，即为基因工程菌，记为CGA3027，该菌株中，nifH启动子(PnifH)能够启动anfHDGK123基因的表达。 [0114] 实施例2、基因工程菌的表型鉴定 [0115] 以固氮酶敲除菌株CGA3023和野生型菌株沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)CGA009为对照，检测基因工程菌CGA3025、CGA3026、CGA3027的表型，所用培养基为非固氮培养基，培养3天达到平台期后，继续培养2天。已知沼泽红假单胞菌在加钼的培养条件下可以表达钼固氮酶，不加钼的条件下表达铁固氮酶。固氮酶在固定N2的同时可以产生H2，铁固氮酶还能产生CH4，因此可以通过气相色谱检测方法对菌株的表型进行定性鉴定。 [0116] 当厌氧培养的菌液生长达到稳定期后，对其上层气体进行气相色谱检测，分别分析产生的H2和CH4的物质的量。然后，分别吸取1mL菌液，12000rpm，1min，离心收集菌体，用溶液A重悬，通过Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度。计算每株菌单位蛋白浓度下的产气量。每个实验重复3次。 [0117] 通过以上实验发现，野生型菌株CGA009在有铵条件下不能固氮，而基因工程菌CGA3025、CGA3026、CGA3027在有铵条件下均产生了氢气(图2中A)和甲烷(图2中B)，解除了铵对固氮的抑制，实现了铁固氮酶的表达。 [0118] 实施例3、基因工程菌表达的铁固氮酶酶活检测 [0119] 固氮酶的活性可以通过乙炔还原法进行定量检测，其中钼固氮酶可以还原乙炔为乙烯，铁固氮酶可以将乙炔还原为乙烯和乙烷，根据气相色谱检测，对不同固氮酶进行表征。 [0120] 以PM+Mo培养基培养的野生型菌株沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)CGA009和出发菌株CGA676为对照，对PM培养基培养的基因工程菌CGA3023、CGA3025、CGA3026、CGA3027的酶活进行检测，当细胞培养至OD660nm达到0.4‑0.5时，将菌液转移至含有0.5％乙炔的氮气厌氧管中，30℃静置8小时后，定性检测催化产物。然后，分别吸取1mL菌液，12000rpm，1min，离心收集菌体，用100mM NaOH重悬，煮沸15min后，12000rpm离心1min，上清通过Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。计算每株菌单位蛋白浓度下的产气量。每个实验重复3次。 [0121] 通过气相色谱检测发现，本发明构建的基因工程菌CGA3025、CGA3026、CGA3027在非固氮条件下可将乙炔还原为乙烯和乙烷(图3)，即产生了有活性的铁固氮酶。而野生型菌株CGA009在有铵条件下不能固氮，因此，本发明通过基因工程技术手段得到一种仅表达铁固氮酶的耐铵基因工程菌，为将来工业化生产应用提供了良好的基础。 [0122] 以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。 |
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