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一株赤红球菌及其在农业生产中的应用
申请号	CN202311861273.0	申请日	2023-12-29	公开(公告)号	CN117821320A	公开(公告)日	2024-04-05
申请人	广西民族大学;			发明人	丰景; 林子彦; 姜明国; 王锟; 吴佩佩; 宁美凤; 程慧欣;
摘要	本发明公开了一株赤红球菌(Rhodococcus ruber)及其在促进植物生长和抑制病原菌方面的应用，所述赤红球菌(Rhodococcus ruber)GXMZU2400，于2023年06月20日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.27667。GXMZU2400具有固氮、产铁载体、产吲哚乙酸能力，释放的挥发性有机物质(volatile organic compounds，VOCs)有促进植物生长和抑制植物病原真菌的功能。该菌具备促进植物生长、提高植物抗逆性的功能，可实际运用在农业上制备绿色环保的生物肥料。
权利要求	1.赤红球菌(Rhodococcus ruber)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.27667。 2.含有权利要求1所述赤红球菌的微生物制剂。 3.一种挥发性有机化合物肥料，其特征为权利要求1所述赤红球菌或权利要求2所述的赤红球菌的微生物制剂释放的挥发性有机化合物。 4.权利要求1所述赤红球菌和权利要求2所述微生物制剂在促进植物生长的应用。 5.权利要求1所述赤红球菌和权利要求2所述微生物制剂在固氮或产铁载体或产吲哚乙酸中的应用。 6.权利要求3所述挥发性有机化合物肥料在提高植物耐氯化钠能力的应用。 7.权利要求3所述挥发性有机化合物肥料在抑制尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)、新暗色柱节饱菌(Neoscytalidium dimidiatum)、小麦根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)、小麦冠腐病菌(Fusarium pseudograminearum)、黄瓜织球壳菌(Plectosphaerella cucumerina)应用，上述真菌为植物病原真菌。 8.权利要求2所述赤红球菌微生物制剂，其特征为应用途径包括生物肥料添加剂、液态生物肥料、微生物喷施制剂、权利要求3所述的挥发性有机化合物肥料。 9.权利要求3所述挥发性有机化合物肥料的利用，其特征为能在开放环境中释放利用或在密闭空间结合发酵装置富集后释放利用。 10.权利要求8所述赤红球菌微生物制剂应用途径，其特征为应用途径的形式为液体或者固体。
说明书全文	一株赤红球菌及其在农业生产中的应用技术领域 [0001] 本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一株赤红球菌在农业生产的应用，尤其是涉及一株赤红球菌挥发性次生代谢产物在农业生产的应用。背景技术 [0002] 现今由于化肥的过度依赖和使用不当，导致土壤重金属累积、营养失调、酸化、微生物活性降低、化肥残留污染水源等一系列问题接踵而至，现在迫切需要开发更多绿色环保的肥料以减少化肥的使用量。研究证实，许多植物根际的细菌对植物的生长、产量和质量有益，它们被称为植物生长促进细菌(PGPR，plant growth‑promoting rhizobacteria)，适当施肥并结合PGPR接种的技术是减少化肥使用，降低环境恶劣影响的良好策略。比起需要大量耗用石油资源的化肥，由PGPR所构成的菌肥更加环保更符合可持续发展的原则。PGPR不仅仅可以通过过溶磷、解钾、固氮、产生铁载体、产吲哚乙酸(IAA)等方式促进植物生长，其释放挥发性有机化合物(Volatile organic compounds，VOCs)在没有与植物物理接触的情况下也能引发诱导系统抗性和促进植物生长，该现象证明细菌VOCs可作为一种新型气态肥料在农业种植过程中应用。发明内容 [0003] 本发明所要解决的技术问题为：提供一株具有效的能促进植物生长和抑制植物病原菌的赤红球菌。 [0004] 本发明的菌株分离自广西壮族自治区北海市铁山港区互花米草根系土壤，编号为GXMZU2400，经鉴定该菌为赤红球菌(Rhodococcus ruber)。 [0005] 本发明的赤红球菌(Rhodococcus ruber)GXMZU2400具有固氮、产铁载体、产IAA能力。 [0006] 本发明的赤红球菌(Rhodococcus ruber)GXMZU2400可以促进番茄植株生长。 [0007] 本发明的赤红球菌(Rhodococcus ruber)GXMZU2400释放的挥发性有机化合物(Volatile organic compounds，VOCs)可以促进拟南芥生长。 [0008] 本发明的赤红球菌(Rhodococcus ruber)GXMZU2400释放的VOCs可以抑制小麦根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)、板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、小麦冠腐病菌(Fusarium pseudograminearum)、黄瓜织球壳菌(Plectosphaerella cucumerina)生长，上述真菌为植物病原真菌。 [0009] 本发明的赤红球菌(Rhodococcus ruber)GXMZU2400释放的VOCs具体物质为二甲基二硫醚和二甲基三硫。 [0010] 本发明提供一种含赤红球菌(Rhodococcus ruber)GXMZU2400的液态菌肥制作方法：葡萄糖5g/L、酵母膏2g/L、蛋白胨5g/L、玉米浆5g/L、色氨酸0.5g/L、氯化钠10g/L，装液量60％(体积分数)，接种量5％(种子液体)，pH＝6.5，通气量3L/min，转速200r/min，培养温度30℃，培养时间36h，所得培养液可用水稀释20‑50倍制成水肥。 [0011] 本发明提供一种含赤红球菌(Rhodococcus ruber)GXMZU2400的气态菌肥制作方法：葡萄糖5g/L，酵母膏2g/L、蛋白胨5g/L、玉米浆5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、七水合硫酸镁0.6g/L，硫酸锰0.01g/L、七水合硫酸锌0.01g/L、硫酸亚铁0.01g/L、氯化钙0.5g/L、氯化钠 10g/L，装液量40％(种子液体)，接种量1％，pH＝6.5，通气量3L/min，转速100r/min，培养温度30℃，培养时间36h，通过升式发酵罐或沼气池进行发酵后释放发酵气体肥料。 [0012] 保藏说明： [0013] 赤红球菌(Rhodococcus ruber)GXMZU2400，于2023年06月20日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.27667，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。附图说明 [0014] 图1为赤红球菌GXMZU2400菌体形态；其中A为该菌在LB培养基上的形态，B为该菌革兰氏染色后光学显微镜观察图，C为该菌扫描电子显微镜观察图。 [0015] 图2为赤红球菌GXMZU2400的促生功能检测；其中A为固氮能力检测，B为产铁载体能力检测，C为产IAA能力检测。 [0016] 图3为赤红球菌GXMZU2400促进番茄生长数据统计图。 [0017] 图4为赤红球菌GXMZU2400促进番茄生长效果对比图；A为盆栽图，B为番茄植株根部图。 [0018] 图5为赤红球菌GXMZU2400释放VOCs促进拟南芥生长数据统计图。 [0019] 图6为赤红球菌GXMZU2400释放VOCs促进拟南芥生长效果对比图。 [0020] 图7为赤红球菌GXMZU2400菌体VOCs抑菌实验培养皿装置图。 [0021] 图8为赤红球菌GXMZU2400菌体VOCs抑菌效果图。 [0022] 图9为本发明SPME/GCMS检测对照组和赤红球菌GXMZU2400菌体实验组的VOCs对比色谱图。具体实施方式 [0023] 以下为本发明的实验技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。下述实验材料均从商业渠道购买所得，下述实验方法若无特殊说明，均为常规实验方法。 [0024] 本发明涉及的培养基和试剂： [0025] 1、LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，氯化钠10.0g/L，琼脂15.0g/L(若为液体培养基则不加)，pH＝7.3。 [0026] 2、MS培养基(mg/L)：硝酸钾1900.0mg/L，硝酸铵1650.0mg/L，磷酸二氢钾170.0mg/L，硫酸镁370.0mg/L，氯化钙440.0mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，硫酸锰22.30mg/L，硫酸锌8.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2.0mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L，蔗糖30000mg/L，琼脂7000.0mg/L，pH＝5.7±0.1。 [0027] 3、PDA培养基(g/L)：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L，自然pH。 [0028] 阿须贝无氮培养基(g/L)：甘露醇10.0g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，七水硫酸镁0.2g/L，氯化钠0.2g/L，二水硫酸钙0.1g/L，碳酸钙5.0g/L，琼脂15.0g/L，pH＝7.2。 [0029] CAS培养基：铬天青S 60.5mg/L，十六烷基三甲基溴化铵72.9mg/L，六水氯化铁2.645mg/L，二水磷酸二氢钠295.25mg/L，十二水磷酸氢二1213.5mg/L，氯化铵125mg/L，磷酸二氢钾37.5mg/L，氯化钠62.5mg/L，琼脂9000mg/L，pH＝6.8±0.1。 [0030] Salkowskis比色液；氯化铁4.5g溶于1L浓度为10.8mol/L的浓硫酸。 [0031] 实施例一：赤红球菌筛选和鉴定 [0032] 1、菌株分离 [0033] 取广西壮族自治区北海市铁山港区互花米草根系土壤2g，加入18mL无菌水，放置于30℃、200r/min摇床培养1h。取培养后的样品悬液1mL，使用无菌水分别稀释成10‑2、10‑3、10‑4稀释液，各取100μL涂布于LB固体培养基平板，培养1‑4天，挑取单菌落进行扩增培养和纯化，保存于‑20℃的40％甘油管中。 [0034] 经过初步筛选，发明人发现一株具有固氮、产铁载体、产IAA、产促进植物生长和抑菌VOCs能力的菌株，命名为GXMZU2400。 [0035] 2、菌株生理生化鉴定 [0036] 菌株形态：如图1所示，A显示该菌菌落颜色为橙红色，菌落为光滑圆形，周围能看到放射状菌丝；B为该菌革兰氏染色显微镜观察图，该图显示该菌为革兰氏阳性菌；C为该菌扫描电子显微镜观察图，该图显示该菌微观形态有两种，分别为长度在1μm左右的椭圆球状和成丝状的菌体。菌株生理生化鉴定结果见表1。 [0037] 表1赤红球菌生理生化鉴定结果 [0038] [0039] 3、菌株分子鉴定 [0040] 对菌株全基因进行16s RNA序列PCR扩增与测序： [0041] 引物序列： [0042] 27F：5’‑AGAGTTTGATCCTGGCTCAG‑3’。 [0043] 1492R：5’‑TACGACTTAACCCCAATCGC‑3’。 [0044] 所测结果通过Ezbiocloud(www.ezbiocloud.net)网站进行在线比对，结果显示与GXMZU2400相似度最高的菌株为赤红球菌(Rhodococcus ruber)，相似度为99.07％，覆盖率为100％，Genbank登入号为LRRL01000064。 [0045] 通过宏观与微观观察、生理生化、分子鉴定证明菌株GXMZU2400为赤红球菌(Rhodococcus ruber)，该菌于2023年06月20日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.27667，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。 [0046] 实施例二：赤红球菌固氮、产铁载体、产IAA性能展示 [0047] 1、提取GXMZU2400菌体：菌株接种于LB培养基并培养出单菌落。挑取单菌落，使用无菌水重悬菌体，离心机5000r/min，5min，倒掉上清液，重复三次，保证菌体不含培养基。 [0048] 2、检测固氮能力 [0049] 接菌环取GXMZU2400菌体划线于阿须贝无氮培养基中，在30℃培养箱倒置培养5天，该菌株成功生长(如图2A所示)，表示该菌株有固氮功能。 [0050] 3、检测产铁载体能力 [0051] 将GXMZU2400菌体涂于CAS培养基培养基上，在CAS培养基上的菌落周围出现了透明圈(如图2B所示)，表示该菌株有产铁载体功能。 [0052] 4、检测产IAA能力 [0053] 用50mg/L的IAA溶液加超纯水配置浓度为5、10、18、20、22、24μg/ml的标准溶液，并按体积比1∶1与Salksowski比色液混合，室温下避光放置30min，酶标仪测量各浓度0D530的值。将得到的数据以IAA浓度为横坐标，0D530为纵坐标做标准曲线，计算回归方程(如图2C所示)。 [0054] 用接菌环取一菌环菌株接种于中LB液体无色氨酸培养基，将菌液培养至OD600＝1左右，取10μL菌液接种于色氨酸浓度为0.5mg/mL的20mL LB培养基，培养3天后，采用Salkowskis比色法测定优势菌株产IAA能力，实验表明GXMZU2400能产IAA，产量为5.52μg/ml(如图2C所示)。 [0055] 实施例三：赤红球菌促生效果展示 [0056] 1、促进番茄生长 [0057] 供试番茄为贵妃番茄(Lycopersicon esculentum)。挑选大小一致且颗粒饱满的番茄种子，使用75％乙醇消毒3次，每次3min，再使用无菌水清洗3‑4次，每次3min。将灭菌好的种子置于温水中浸泡，放置于30℃培养箱1天，将浸泡好的种子放在水打湿的滤纸上，再覆盖一层湿水滤纸，放置于30℃培养箱进行催芽。将长出芽的番茄种子至于育苗盆中轻微覆土培养，土壤配比为机质土∶蛭石＝2∶1，等待一周左右番茄两片真叶完全展出，挑取生长一致的番茄幼苗移至花盆(15.7cm上口径，12.5cm下口径，16.5cm高度)中，每盆1棵番茄幼苗，土壤配比同上。待番茄幼苗定制成功后对其进行灌根，灌根菌液为OD600＝1的菌液稀释20倍，且含0.5mg/mL色氨酸，以含0.5mg/mL色氨酸无菌水空白对照组，每组3个重复处理，每次每株苗灌根50mL，每7天处理一次，共计4次。如图3所示，25天后进行番茄植株各项指标的测量与统计，经过GXMZU2400菌液处理后，番茄植株的中部茎粗、底部茎粗、鲜重、干重分别显著增加了43.3％、38.9％、181.0％、173.1％，茎高与叶片数也有一定的增加，分别增加了 16.3％、61.3％，菌液处理过的番茄根系也比较发达(如图4所示)。 [0058] 实施例四：赤红球菌释放的VOCs的促生效果展示 [0059] 拟南芥种子经75％酒精消毒3min，3次，使用蒸馏水清洗3min，3‑4次，清洗后的拟南芥种子置于滤纸晾干，晾干的拟南芥种子种植在MS培养基，人工智能气候箱培养3‑4天，将出芽大小一致的拟南芥幼苗转移至二分隔平板MS培养基一侧，每个二分隔平板移栽5株拟南芥幼苗，4‑5天后取定植成功的拟南芥幼苗做后续与细菌共培养。将GXMZU2400菌株接种于LB液体培养基，30℃摇床恒温培养2‑3天，使用无菌水将菌液稀释到OD600＝1±0.1。在二分隔平板LB固体培养基一侧垫直径8mm圆形无菌滤纸片，接种10μL菌液于滤纸片上。拟南芥与细菌共培养的二分隔平板置于人工智能气候箱培养(条件：光照时间：16h，光照强度为8000lux，温度23℃，相对湿度50％)，以接种无菌水的培养基为空白对照，15天后测量与统计拟南芥各项指标，在此期间，菌株与拟南芥没有直接接触，只存在空气交流(如图5所示)。如图6所示，菌株释放的VOCs极显著增加了拟南芥的叶长、叶宽、根系数目、鲜重，分别增加了57.8％、27.1％、160.8％、336.3％。 [0060] 实施例五：赤红球菌释放的VOCs的抑菌效果展示 [0061] 将GXMZU2400菌株接种于LB液体培养基，30℃摇床恒温培养2‑3天，使用无菌水将菌液稀释到OD600＝1±0.1，取100μL稀释液在LB固体培养基上涂布，置于30℃培养箱，培养1天。供试植物病原菌为小麦根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)、板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、小麦冠腐病菌(Fusarium pseudograminearum)、黄瓜织球壳菌(Plectosphaerella cucumerina)。使用灭菌的1mL枪头在培养病原真菌的培养基上打孔制成菌块，用灭菌竹签挑取菌块倒置在PDA培养基中间，放置于室温培养1天。将培养1天后定殖的GXMZU2400菌株涂布培养皿和病原真菌培养皿去掉培养皿盖子后对接共培养，使用封口膜固定(如图7所示)，保证GXMZU2400菌株与病原真菌之间只有空气交流，每个样品3个重复，以100μL无菌水涂布的LB培养基与病原菌对接共培养为对照组，将LB培养基一面为上放置于室温培养10天后测量病原真菌半径，计算抑菌率：(对照组病原菌生长半径‑实验组病原菌生长半径)/实验组病原菌生长半径× 100％。结果表明GXMZU2400释放的VOCs对小麦根腐病菌、板栗疫病菌、尖孢镰刀菌、小麦冠腐病菌、黄瓜织球壳菌皆有抑制效果(如图8所示)，抑制率见表2。 [0062] 表2赤红球菌VOCs对植物病原真菌的抑制率 [0063] [0064] 实施例六：赤红球菌释放的VOCs成分鉴定 [0065] 1、样品制作：使用接菌环挑取一菌环GXMZU2400单菌落菌体培养于LB液体培养基，30℃摇床恒温培养2‑3天，使用无菌水将菌液稀释至0D600＝1左右，滴加100μL稀释菌液涂布于LB固体培养基，30℃培养箱培养天，采用1mL枪头对培养基打孔，得到直径为8mm厚度为 5mm的菌块，每个20mm顶空瓶(安捷伦)装20个菌块，盖子密封于30℃培养箱培继续养5天，对照组顶空瓶装20个同规格无菌LB固体培养基块。 [0066] 2、VOCs采集：采用固相微萃取(Solid phase microextraction/Gas chromatography and Mass spectrometry technology，SPME/GCMS)与气相质谱联用技术分析鉴定菌株VOCs成分。含有样品的顶空瓶放在40℃水浴锅(群安科学仪器有限公司)中平衡20min，固相微萃取探针(青岛贞正分析仪器有限公司)插入顶空瓶，使其探头在40℃下萃取20min完成VOCs样品吸附。将含有VOCs样品的固相微萃取针头插入GCMS(岛津QP2020NX)，运行设定程序，进样口高温释放VOCs样品，每组试验设置三个重复。 [0067] 3、GCMS分析条件：色谱柱为弱极性固定相且对活性化合物有非常优良的惰性的气相色谱法柱(SH‑Rxi‑5Sil MS，岛津)，其膜厚0.25μm，长度30m，内径0.25mm，最高使用温度为350℃。载气为99.999％氦气，柱箱温度为30℃，进样温度为250℃，进样模式为不分流，进样时间为0.5min，开始时间为1min，压力为59.6kPa，总流量为50mL/min，柱流量为1.2mL/min；初始温度为30℃，保持3min，然后以i0℃/min的速率上升至80℃，以5℃/min的速率上升至160℃，以10℃/min的速率上升至250℃，总运行时间为33min；离子源温度为200℃，接口温度为250℃；采集方式为扫描，扫描速度2000，扫描范围35～550m/z。数据采集与分析平台为GCMSsolution 4.50。采用自动整合与识别，并在NIST 17库中自动检索。 [0068] 4、实验结果 [0069] 使用GCMS分别测定了GXMZU2400菌块(含LB固体培养基)样品与对照组(LB固体培养基)所释放的VOCs成分，并得到两组样品的气相色谱图(如图9所示，1为二甲基二硫醚的色谱峰，2为二甲基三硫的色谱峰)。通过GCMSsolution 软件自动积分气相色谱图峰高大于等于30000的物质，在积分到的物质中剔除固相微萃取针头产生的硅氧化合物与峰型异常的化合物，保留在谱数据库中搜索配对率大于80的化合物，两组样品分别进行了三个重复的测定，选取其中三个重复都有出现的化合物认定为该组样品真实释放的VOCs，比对GXMZU2400菌体样品和对照组成分，扣除LB固体培养基的VOCs成分，即得到GXMZU2400菌株所释放的VOCs物质鉴定结果。GXMZU2400释放的VOCs鉴定出了2种有机化合物，分别为二甲基二硫醚和二甲基三硫。 [0070] 实施例七：菌株菌制剂的制备方法和应用 [0071] 1、种子液：胰蛋白胨10g/L酵母提取物5g/L NaCl 10g，培养温度30℃、200r/min，培养至菌液OD600＝1即可使用，约为1‑2天。 [0072] 2、液态肥料：葡萄糖5g/L、酵母膏2g/L、蛋白胨5g/L、玉米浆5g/L、色氨酸0.5g/L、氯化钠10g/L，装液量60％(体积分数)，接种量5％(种子液体)，pH＝6.5，通气量3L/min，转速200r/min，培养温度30℃，培养时间36h，所得培养液可用水稀释20‑50倍制成水肥。 [0073] 3、气态肥料 [0074] (1)使用范围为大棚和温室等相对密封的环境，使用升式发酵罐或沼气池进行发酵后释放发酵气体。 [0075] (2)发酵方法：葡萄糖5g/L，酵母膏2g/L、蛋白胨5g/L、玉米浆5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、七水合硫酸镁0.6g/L，硫酸锰0.01g/L、七水合硫酸锌0.01g/L、硫酸亚铁0.01g/L、氯化钙0.5g/L、氯化钠10g/L，装液量40％(种子液体)，接种量1％，pH＝6.5，通气量3L/min，转速100r/min，培养温度30℃，培养时间36h。

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