[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株慢生根瘤菌新种SBR26、其制剂及应用。

[0002] 在花生种植过程中，过量施用的氮肥造成了较为严重的生态环境破坏和农产品质量安全。花生慢生根瘤菌是一类能够与花生共生形成根瘤并通过固定空气中的氮气为花生提供氮素的一类革兰氏阴性细菌。在根瘤中，花生为根瘤菌提供碳水化合物、水分和矿物质+等元素，根瘤菌通过自身固氮作用为花生提供NH4 。由于根瘤在衰老之后会破裂脱落，将根瘤内的氮素和一些自生根瘤菌释放到土壤中，因此根瘤的共生固氮作用也能够提高土壤肥力。花生慢生根瘤菌与花生的共生固氮可以替代部分氮肥，能够有效缓解过量施氮对环境造成的危害。

[0003] 土壤中施加的氮素会抑制花生慢生根瘤菌与花生的结瘤和根瘤的固氮。氮肥能够抑制花生慢生根瘤菌对花生根部的定殖和侵染，通过激活花生植株内部的生长素和乙烯等激素调控系统、氮反馈调控系统和根瘤数自动调控系统来抑制根瘤形成。耐氮花生慢生根瘤菌可以在中/高氮土壤中与花生结瘤共生，通过固氮作用为花生提供氮源进而降低花生对氮肥的依赖和需求，在氮肥施用量不稳定的情况下保证作物高产并改善作物品质。虽然耐氮花生慢生根瘤菌菌剂在农业生产上有诸多优点，但由于市面上缺少耐氮根瘤菌且已有的根瘤菌固氮节氮能力不稳定，因此，筛选出一种固氮能力强、节氮效果好、具备一定耐受氮抑制能力并且促进花生高产的慢生根瘤菌菌株具有实际价值。

[0004] 本发明提供了一株慢生根瘤菌新种(Bradyrhizobium sp.)SBR26，所述菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.29122。

[0005] 上述慢生根瘤菌新种SBR26能够耐受多种农药、耐氮能力强，结瘤固氮能力强、节氮促高产能力显著。基于此，本发明提供了上述慢生根瘤菌新种SBR26在促进植物结瘤、固氮和/或生长中的应用。

[0006] 本发明提供了一种根瘤菌菌剂，所述菌剂含有上述慢生根瘤菌新种SBR26。此外，所述菌剂还可含有其它常规辅料。

[0007] 上述根瘤菌菌剂的剂型可选自液体菌剂、粉剂或颗粒剂。

[0008] 在一个具体实施方案中，所述菌剂具体为液体菌剂，所述液体菌剂是通过采用TY液体培养基培养上述慢生根瘤菌新种SBR26获得的；所述液体菌剂中慢生根瘤菌新种SBR2610
的浓度为1×10 cfu/mL。

[0009] 本发明提供了上述根瘤菌菌剂在促进植物结瘤、固氮和/或生长中的应用。

[0010] 上述慢生根瘤菌新种SBR26或根瘤菌菌剂可替代部分氮肥，与磷肥和钾肥组成微生物肥料。基于此，本发明提供了上述慢生根瘤菌新种SBR26或根瘤菌菌剂在制备微生物肥料中的应用。

[0011] 本发明提供了一种微生物肥料，所述肥料含有上述慢生根瘤菌新种SBR26或根瘤菌菌剂、磷肥和钾肥。

[0012] 本发明提供了一种根瘤菌种衣剂，所述种衣剂含有上述慢生根瘤菌新种SBR26。所述种衣剂还可含有微量元素、羧甲基纤维素钠和/或农药。所述农药可选自甲霜·恶霉灵、多菌灵、噻虫嗪或吡虫啉。

[0013] 优选地，所述种衣剂中，甲霜·恶霉灵的浓度≤200ppm、多菌灵的浓度≤1667ppm、噻虫嗪的浓度≤60ppm、吡虫啉的浓度≤93ppm。

[0014] 本发明提供了一种种子包衣方法，步骤如下：

[0015] 向上述慢生根瘤菌新种SBR26菌液中添加微量元素母液，混匀，形成混合菌液；然后将混合菌液均匀喷洒在种子表面，阴干；利用羧甲基纤维素钠溶液对阴干的种子再次拌种，进行包衣，阴干。

[0016] 如果需要对种子进行农药包衣，可在种子经过慢生根瘤菌新种SBR26和羧甲基纤维素钠溶液拌种后，利用相应浓度的农药稀释液对种子进行拌种，以实现农药包衣。

[0017] 上述种子包衣过程也可直接采用上述根瘤菌种衣剂直接进行包衣。

[0018] 上述慢生根瘤菌新种SBR26菌液是通过采用TY液体培养基培养上述慢生根瘤菌新10
种SBR26获得的；所述菌液中慢生根瘤菌新种SBR26的浓度为1×10 cfu/mL。

[0019] 上述所述微量元素母液的组成如下：H3BO3 2.86g/L，MnSO4 1.81g/L，CuSO4·5H2O 0.80g/L，ZnSO4 0.22g/L，H2MoO4 0.02g/L，余量为水；其中，所述微量元素的作用是为植物提供营养元素。

[0020] 上述羧甲基纤维素钠溶液选自含有终浓度为10g/L羧甲基纤维素钠的水溶液，即浓度为1％。

[0021] 上述微量元素母液与慢生根瘤菌新种SBR26菌液的体积比选自1:1000。即向所述菌液中添加的微量元素母液的量可选自：每1000mL所述菌液添加1mL所述微量元素母液。

[0022] 上述混合菌液的使用量为150mL/30kg种子。

[0023] 上述羧甲基纤维素钠溶液的使用量为150mL/30kg种子，用于保持慢生根瘤菌新种SBR26的附着和种子表面湿度。

[0024] 在本发明中，所述植物选自豆科植物；优选为花生。

[0025] 本发明的有益效果为：

[0026] 本发明提供的慢生根瘤菌新种SBR26，能够耐受一部分杀菌剂和杀虫剂，同时具有较强的耐氮和结瘤固氮能力，因此具备节氮促高产能力。在减少50％氮肥施用量的田间种植情况下，该菌株能够显著提高作物的固氮和生长性能，不仅减少了氮肥的施用，同时也保证了作物农药的正常实施，最终提高作物产量。附图说明

[0027] 图1为SBR26在TY培养基上的菌落形态图；

[0028] 图2为SBR26菌体革兰氏染色图；

[0029] 图3为SBR26的16S rDNA和atpD进化树；

[0030] 图4为SBR26的recA和nifH进化树；

[0031] 图5为SBR26耐受农药能力测定；

[0032] 图6为温室培养条件下SBR26接种花生的共生情况；

[0033] 图7为在不同浓度KNO3处理下SBR26接种花生的共生情况；

[0034] 图8为2023年大田栽培条件下SBR26接种花生的生长情况。

[0035] 1、试验材料

[0036] (1)本发明所使用的培养基、试剂及其它材料，如下：

[0037] TY培养基：胰蛋白胨5g、酵母粉3g和CaCl2 0.6g，去离子水1000mL，pH 6.8～7.2，琼脂15～20g(固体培养基)，121℃灭菌30min。

[0038] YMA培养基：甘露醇10.0g，K2HPO4 0.25g，KH2PO4 0.25g，MgSO4 0.1g，NaCl 0.1g，酵母提取物3.0g，去离子水1000mL，pH 6.8～7.0，琼脂15～20g(固体培养基)，121℃灭菌20min。

[0039] 血琼脂培养基：蛋白胨18g，酵母粉1g，NaCl 5g，琼脂15～20g(固体培养基)，去离子水1000mL，pH 6.8～7.2。121℃灭菌20min，待培养基冷却至50℃添加5％(5mL/100mL)脱纤维羊血，混匀后倒平板。

[0040] 20×植物低氮营养液：柠檬酸铁0.075g、Ca(NO3)2 0.03g、K2HPO4 0.136g、CaSO4 0.46g、KCl 0.075g、MgSO4·7H2O 0.06g、微量元素母液20mL，去离子水1000mL。

[0041] 微量元素母液：H3BO3 2.86g、H2MoO4 0.02g、ZnSO4 0.22g、CuSO4·5H2O 0.8g、MnSO41.81g，去离子水1000mL。

[0042] 无菌生理盐水：NaCl 0.8g，去离子水100mL，121℃灭菌30min。

[0043] 水琼脂培养基：琼脂粉0.6g，去离子水100mL，121℃灭菌30min。

[0044] 5mM KNO3溶液：KNO3 50.5g，去离子水100mL，121℃灭菌30min。

[0045] 羧甲基纤维素钠溶液(种子表面保护剂)：将1g羧甲基纤维素钠(800～1200mPa·s)溶解于100mL 60℃的去离子水中，搅拌至透明糊状胶液。

[0046] 农药固体培养基：选取山东地区花生种植过程中常用的除草剂、杀菌剂、杀虫剂，按照说明书的最高使用浓度递减设4个浓度梯度，计算出四个梯度的用量/30mL(表1)。灭菌后的TY固体培养基冷却至50℃左右，分别快速加入4个浓度梯度的农药量，迅速摇匀后倒平板，每个浓度梯度设置三个重复平板。

[0047] 表1实验所用农药梯度设置及相应农药含量

[0048]

[0049]

[0050] 田间施用氮磷钾肥料为常规尿素、钙镁磷肥和硫酸钾。

[0051] (2)引物信息

[0052] 本发明所采用的引物，如表2所示：

[0053] 表2

[0054]

[0055] 基因组提取试剂盒、PCR扩增用Taq Mix和ddH2O均来自于康润生物科技有限公司。

[0056] 2、菌种分离与鉴定

[0057] 2020年7月10日于山东省荣成市收集花生根部根瘤。经75％酒精溶液消毒1min，次氯酸钠溶液(次氯酸钠:水＝1:5)消毒7min，无菌水清洗8次，获得表面无菌的根瘤。将无菌根瘤组织液划线于YMA固体培养基上，28℃培养14天。待菌落长出后，挑取单菌落于TY固体培养基上纯化三次并保存于‑80℃冰箱中。将该菌种编号为SBR26。

[0058] 按照“伯杰细菌鉴定手册”(第八版)中描述的方法，对菌株SBR26进行鉴定，具体结果如下：

[0059] (1)形态学和生物学特征

[0060] 将菌株SBR26接种在TY固体培养基上，28℃恒温培养7天，其菌落形态包括：菌落小而不透明，乳白色，圆形，表面水润光滑，如图1所示。革兰氏染色为红色杆状，说明该菌株为革兰氏阴性杆菌。如图2所示。

[0061] (2)基因学特征

[0062] 16S rDNA、atpD、recA、nifH序列测序：

[0063] 提取菌种SBR26的基因组DNA，利用16S rDNA通用引物16S rDNA P1/P6、持家基因atp D的引物atpD255 F/R、持家基因rec A的引物recA41 F/R、共生基因nif H的引物nifH F/R进行PCR扩增。

[0064] 扩增用体系为(50μL)：

[0065] Taq Mix 25μL、ddH2O 22μL、正向引物P1/F 1μL(浓度为10μmol/L)、反向引物P6/R 1μL(浓度为10μmol/L)、DNA模板1μL。

[0066] 扩增反应条件为：

[0067] 95℃5min；94℃1min，60℃/58℃30s，72℃90s，进行30个循环；最后72℃终延伸10min。PCR引物合成和测序均由擎科测序公司完成。

[0068] 测序结果：

[0069] 双端测序序列用DNAMAN软件进行拼接，共获得1350bp的16S rDNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。

[0070] 16S rDNA序列(SEQ ID No:1)：

[0071] CCGGCTGCCTCCTTGCGGTTAGCGCACCGTCTTCAGGTAAAACCAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTGGCGTGCTGATCCACGATTACTAGCGATTCCAACTTCATGGGCTCGAGTTGCAGAGCCCAATCCGAACTGAGACGGCTTTTTGAGATTTGCGAAGGGTCGCCCCTTAGCATCCCATTGTCACCGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGCCCGTAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCGCGGCTTATCACCGGCAGTCTCCTTAGAGTGCTCAACTAAATGGTAGCAACTAAGGACGGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTTCCAGGCTCCGAAGAGAGGGTCACATCTCTGCGACCGGTCCTGGACATGTCAAGGGCTGGTAAGGTTCTGCGCGTTGCGTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAAAGCGTTAGCTGCGCCACTAGTGAGTAAACCCACTAACGGCTGGCATTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGCCTCAGCGTCAGTACCGGGCCAGTGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTGCGAATATCTACGAATTTCACCTCTACACTCGCAGTTCCACTCACCTCTCCCGGACTCAAGATCTTCAGTATCAAAGGCAGTTCTGGAGTTGAGCTCCAGGATTTCACCCCTGACTTAAAAACCCGCCTACGCACCCTTTACGCCCAGTGATTCCGAGCAACGCTAGCCCCCTTCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGAAGTTAGCCGGGGCTTATTCTTGCGGTACCGTCATTATCTTCCCGCACAAAAGAGCTTTACAACCCTAGGGCCTTCATCACTCACGCGGCATGGCTGGATCAGGGTTGCCCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCTGATCATCCTCTCAGACCAGCTACTGATCGTCGCCTTGGTAGGCCATTACCCTACCAACTAGCTAATCAGACGCGGGCCGATCTTTCGGCGATAAATCTTTCCCCGTAAGGGCTTATCCGGTATTAGCACAAGTTTCCCTGTGTTGTTCCGAACCAAAAGGTACGTTCCCACGCGTTACTCACCCGTCTGCCGCTGACGTATTGCTACGCCCGCTCGAC

[0072] 获得541bp的持家基因atp D序列，其核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。

[0073] atp D序列(SEQ ID No:2)：

[0074] TATTTCATCGATCGATGAGCCGGTCCCGTCAAGTCGGAAGGCCTGCGCGCGATCCACCAGGAAGCGCCCACCTACACCGACCAGTCGACCGAAGCTGAAATTCTCGTCACCGGCATCAAGGTCGTCGACCTGCTCGCTCCGTATGCCAAGGGCGGCAAGATCGGCCTGTTCGGCGGCGCCGGCGTCGGCAAGACCGTGCTGATTCAGGAGCTGATCAACAACGTCGCGAAGGCGCACGGCGGTTACTCCGTGTTCGCCGGCGTCGGCGAGCGTACCCGCGAAGGCAACGACCTCTATCACGAGTTCATCGAGTCCAAGGTCAACGCCGATCCGAAGAATCCGGATCCGAGCGTGAAGTCGAAGTGCGCGCTGGTGTTCGGCCAGATGAACGAGCCGCCGGGCGCCCGCGCCCGCGTCGCGCTCACCGGTCTGACCATTGCGGAAGACTTCCGCGACAGGGGCCAGGACGTGCTGTTCTTCGTCGACAACATCTTCCGCTTCACCCAGGCAGGTTGAAAGGGGGGGGCGAAAAAAAACCCCC

[0075] 获得525bp的持家基因rec A序列，其核苷酸序列如SEQ ID No:3所示。

[0076] rec A序列(SEQ ID No:3)：

[0077] TGGGGACGATCGTTCGATGGACATCGAGGCGGTCTCGTCGGGCTCGCTGGGGCTGGACATCGCGCTCGGCATCGGCGGCCTGCCCAAGGGGCGTATCGTCGAGATCTACGGGCCGGAATCGTCGGGCAAGACCACCCTGGCGCTGCATACCGTGGCGGAAGCCCAGAAGAAGGGCGGCATTTGCGCCTTCATCGACGCCGAGCACGCGCTCGACCCGGTCTATGCCCGCAAGCTCGGGGTCAACATCGACGAGCTCTTGATCTCGCAACCCGACACCGGCGAGCAGGCGCTGGAAATCTGCGACACGCTGGTGCGCTCGGGTGCGGTGGATGTGCTGGTGGTCGATTCGGTCGCGGCGCTGGTGCCGAAGGCCGAGCTCGAAGGCGAGATGGGCGATGCACTGCCGGGTCTTCAAGCGCGGTTGATGAGCCAGGCGCTGCGCAAGCTGACCGCCTCGATCAACAAGTCCAACACCATGGTGATCTTCATCAACCAGATCCGCATGAAGACGGCGGTTCATGGAAA[0078] 获得748bp的共生基因nif H序列，其核苷酸序列如SEQ ID No:4所示。

[0079] nif H序列(SEQ ID No:4)：

[0080] GGGTTGTTCGCGACCGCTGGCGGCGTTAGCCGAGATGGGTCAGAAAATCCTGATTGTAGGATGCGATCCGAAGGCAGATTCGACCCGCCTGATTCTGCACGCCAAGGCGCAGGACACGATTTTGAGCCTTGCCGCGAGCGCCGGCAGCGTGGAGGACCTAGAACTGGAAGACGTCATGAAGGTCGGCTACAAGGACATTCGTTGCGTGGAGTCCGGTGGTCCTGAGCCAGGTGTCGGCTGTGCCGGCCGCGGTGTCATCACCTCGATCAATTTTCTGGAAGAGAACGGCGCTTACGAGAACATCGACTATGTCTCGTACGACGTGCTTGGCGACGTTGTTTGCGGCGGCTTTGCGATGCCAATCCGCGAGAATAAGGCGCAGGAAATCTACATCGTGATGTCCGGTGAAATGATGGCGATGTATGCCGCGAACAACATCTCCAAGGGCATCCTAAAATACGCGAACTCTGGCGGCGTGCGGCTGGGCGGTCTGATCTGCAACGAGCGGCAGACTGACAAGGAGCTGGAGCTAGCGGAAGCGTTAGCCAAGAAGCTAGGCACTCAGCTGATCTACTTCGTGCCGCGCGACAACGTGGTGCAGCATGCAGAATTACGCAGGATGACGGTTCTCGAATATGCACCCGATTCCAAGCAGGCTGATCACTATCGCAATCTTGCAACCAAGGTTCACAATAATGGCGGCAAGGGCATCATCCCCACCCCGATCTCCTGATACGTTAAAAAATAT

[0081] 在NCBI网站进行BLAST比对，采用ML法对SBR26及序列相近的菌株建立进化树，结果如图3和图4所示，菌种SBR26的16S rDNA序列能够与所有Bradyrhizobium菌种进行聚类，结合其形态学及生物学特征，将该菌种鉴定为慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium sp.strain SBR26)。持家基因recA建树结果显示SBR26与Bradyrhizobium sp.CCBAU 53338能够聚类在一起。持家基因atpD建树结果显示SBR26与Bradyrhizobium sp.CCBAU 53338具有共同的进化祖先，但进化程度不同。共生基因nifH建树结果显示SBR26与Bradyrhizobium sp.SCAUd29聚类，与Bradyrhizobium sp.CCBAU 53338完全不能聚类在一起。因此，SBR26与相近的Bradyrhizobium sp.CCBAU 53338不同，属于未被命名的一个新种。

[0082] 该菌已于2023年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC  No.29122。所建议的分类命名为：慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumsp.)。

[0083] 3、安全性检测

[0084] 将菌株SBR26接种于血琼脂培养基中，28℃培养14天，观察有无溶血圈。有溶血圈出现代表菌株有溶血活性，对人畜有潜在威胁，则菌株应禁止应用于微生物肥料；若无溶血圈出现代表菌株无溶血活性，为安全菌种，可作为微生物肥料应用菌种。结果显示，该菌株在血琼脂平板上培养14天后，未出现溶血圈，溶血活性为阴性，这表明该菌株为安全菌种，可安全应用于微生物肥料。

[0085] 本发明所采用的其它材料，如无特殊声明，均可通过市售渠道获得。本发明所使用的其它术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

[0086] 实施例1

[0087] 耐农药能力检测：

[0088] 将菌株SBR26接种于TY液体培养基中，37℃、180rpm/min振荡培养4天。使用无菌生理盐水将菌液的OD600nm调节为0.2。将2μL菌液点接于农药固体培养基上，37℃培养7天，观察菌落生长情况。

[0089] 试验结果如表3和图5所示，其中图5展示的是耐受最高浓度农药的菌落生长状态：

[0090] 表3菌株SBR26的耐药性鉴定结果

[0091]

[0092]

[0093]

[0094] 注：+表示菌株正常生长；‑表示菌株未生长。

[0095] 上述结果显示，菌株SBR26对杀虫剂吡虫啉和噻虫嗪的最高耐受浓度分别为93ppm和60ppm，对杀菌剂甲霜·恶霉灵和多菌灵的最高耐受浓度分别为200ppm和1667ppm。该结果说明，在花生种植过程中，菌株SBR26可以与适当浓度的吡虫啉、噻虫嗪、甲霜·恶霉灵或多菌灵组成慢生根瘤菌与农药混配的种衣剂共同使用。

[0096] 实施例2

[0097] 结瘤促生长能力检测：

[0098] 配制植物低氮营养液，按照100mL低氮溶液与1kg蛭石的比例混合，添加适量去离子水使蛭石保持湿润状态，121℃灭菌90min。实验用的花生品种为BS1016，种子消毒流程如下：75％酒精溶液消毒1min，次氯酸钠溶液(次氯酸钠:水＝1:4)消毒10min，无菌水清洗8遍并浸泡10min，无菌种子于水琼脂培养基上黑暗发芽4天。将菌株SBR26和对照菌株TBradyrhizobium zhanjiangense CCBAU 51778 (共生效果正常的模式菌株)接种于TY液体培养基中，28℃、180rpm/min振荡培养5天。使用无菌生理盐水将菌液的OD600nm调节为0.2。采用双层钵法种植花生，该装置上层含有无菌蛭石，下层含有无菌水，上层蛭石靠一条无菌纱布吸收下层的无菌水。将发芽的花生种子种植于蛭石中，接种1mL SBR26菌液、1mL CCBAU T T
51778菌液或无菌生理盐水，分别作为SBR26处理组(SBR26)、CCBAU 51778阳性对照处理组(51778)和阴性对照处理组(CK)，三个处理组均设置10棵花生植株的重复。将花生放置于28℃、12h日光灯光照和12h黑暗的温室中培养。于接种后第40天检测花生共生表型：根瘤数、根瘤鲜重、叶绿素含量和地上干重。

[0099] 试验结果如表4和图6所示：

[0100] (1)SBR26处理和51778阳性对照处理的根瘤数、根瘤鲜重和叶绿素含量显著高于CK阴性对照处理，说明根瘤菌SBR26和51778能与花生结瘤并通过根瘤固氮作用为叶片提供氮源，从而显著提高叶绿素含量；

[0101] (2)SBR26处理的地上干重显著高于CK处理，说明SBR26具备促进花生生长的能力；

[0102] (3)SBR26处理的根瘤数和根瘤鲜重显著高于51778对照处理，说明SBR26的结瘤能力显著高于51778。

[0103] 上述结果说明SBR26具备较强的结瘤能力，也具备提高花生叶绿素含量和促进花生生长的能力。

[0104] 表4温室培养条件下SBR26接种花生的共生表型(P<0.05)

[0105] 处理 根瘤数 根瘤鲜重(g/株) 叶绿素含量 地上干重(g/株)CK 0c 0c 35.25±1.20b 1.42±0.12b
51778 67.33±8.33b 0.10±0.01b 44.73±0.55a 1.86±0.16ab
SBR26 122.40±22.45a 0.21±0.02a 44.55±0.50a 2.44±0.30a

[0106] 实施例3

[0107] 耐氮能力检测：

[0108] 花生BS1016种子的消毒、种植方法见实施例2。SBR26和对照根瘤菌菌株TBradyrhizobium guangxiense CCBAU 51778接种于TY液体培养基中，28℃、180rpm/min振荡培养5天。使用无菌生理盐水将菌液的OD600nm调节为0.2。将发芽的花生种子种植于蛭石T
中，接种1mL SBR26菌液或CCBAU 51778 对照根瘤菌菌液，分别作为SBR26处理组和对照根瘤菌(51778)处理组，每个接种处理组均设置如下三种氮处理方式：添加1mL无菌生理盐水、
1mL 5mM KNO3溶液和2mL 5mM KNO3溶液，分别形成0mM KNO3处理、5mM KNO3处理和10mM KNO3处理，每个氮处理均设置10棵花生植株的重复。将花生放置于28℃、12h日光灯光照和12h黑暗的温室中培养。于接种后第40天检测花生的共生表型。

[0109] 试验结果如表5和图7所示：

[0110] 在5mM和10mM KNO3处理中，经SBR26处理的根瘤数和根瘤鲜重均显著高于对照51778处理，说明SBR26能够在氮抑制花生结瘤的情况下形成根瘤，即SBR26菌株具有较好的耐氮结瘤能力。

[0111] 表5温室培养条件下不同浓度KNO3处理下SBR26接种花生的共生表型(P<0.05)[0112]

[0113] 一、大田应用

[0114] 在大田应用前，作如下准备工作：

[0115] 1)菌株活化及扩大培养：

[0116] 将保藏于‑80℃冰箱的SBR26菌种采用三区划线方式活化于YMA固体培养基上，放于28℃恒温培养箱培养14天。将单菌落接种于TY液体培养基中扩大培养，于28℃、180rpm/10
min振荡培养至菌液浓度达到1×10 cfu/mL。使用前在菌剂中添加微量元素母液(1mL/
1000mL)，混匀。

[0117] 2)花生种子包衣：

[0118] 将菌剂均匀喷洒在种子表面至种子表面湿润，放在阴凉处晾干。阴干的种子用1％的羧甲基纤维素钠溶液拌种(150mL/30kg种子)，以保持菌剂附着和湿度，阴干；

[0119] 3)播前浇水：

[0120] 采用人工或机器播种，播前3天浇水，保证土壤必要的湿度，利于菌株生存和种子发芽。

[0121] 4)花生大田种植，如下所示：

[0122] 试验地点设在山东省莱西市山东省花生研究所基地；选用的花生品种为花育917；播种日期为2022年4月30日(播种地点为西坡地路北)和2023年5月13日(播种地点为西坡地路南)。由于常规纯氮施用量为120kg/ha，因此在试验田减氮50％时纯氮的用量为60kg/ha，据此推导出减氮50％时尿素的施用量为135kg/ha。磷肥(钙镁磷肥)和钾肥(硫酸钾)为常规用量，分别为750kg/ha和240kg/ha。常规施肥水平见文献“王春晓等.不同氮肥用量与有机肥配施对花生衰老和结瘤的影响.花生学报,2023,52(2):1‑7.”。所有肥料全部作为基肥混匀后一次性施入土壤中。

[0123] 按照常规方法翻整土地起垄，垄宽0.85m，垄间距0.4m，将1亩地等分为6个小区。设不接菌对照(CK)和接种SBR26菌株两个处理，每个处理3个小区，所有小区随机分布。所使用的生物菌剂为慢生根瘤菌SBR26。

[0124] 花生种植，按照一垄两行，两粒种子每穴，穴间距0.02m播种花生种子，花生栽培方式按照常规处理进行。于2023年7月31日取样，测定荚果期花生共生表型，主要包括根瘤数、主茎高、侧枝数、荚果数、果针数、侧枝长、果干重和地上干重等指标。于2022年9月27日和2023年9月22日测定每个小区的花生产量。具体为量取花生生长均匀的2m垄长，收取该范围内所有花生果实，自然晾干，测定带壳果实干重，折算每公顷花生产量，计算公式如下：

[0125] 花生亩产＝果干重/(0.85×2)×666.7

[0126] 花生公顷产量＝果干重/(0.85×2)×666.7×15

[0127] 经测试，两个年度采用SBR26接种的花生各项生长指标均高于对照组，下述结果主要展示2023年度的各项指标。

[0128] 试验结果如表6～7和图8所示：

[0129] 表6 2023年应用SBR26菌剂的花生荚果期生长参数

[0130]

[0131]

[0132] 表7应用SBR26菌剂的花生产量

[0133]

[0134] 结果显示，在减少50％氮肥施用的前提下，慢生根瘤菌SBR26可提高荚果期根瘤数、主茎高、侧枝数、荚果数、果针数、侧枝长、果干重和地上干重，将花生产量提高4.42～7.32％。说明SBR26具有重要的减氮促高产的田间应用潜力，可作为开发稳定高效的微生物肥料菌种资源。

[0135] 值得注意的是，当年度花生根瘤数与上一年度地块中氮源残留有着重要关系，如果上一年度的地块中氮源残留较多，那么，在花生种植过程中，过剩的氮肥会抑制花生根瘤的生长和数量，从而使得同一品种的花生在不同的地块中种植时，会在根瘤数上存在较大差别。但这并不影响本发明的实验结果。本发明的目的在于，提供一种能够提高花生固氮能力的菌株，显然，如上述实验结果所示，本发明所提供的SBR26菌株能够提高花生在当年度种植时的根瘤数，影响其各项生长指标，并最终提高花生产量。

[0136] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。