一种可在低温下高效降解秸秆的复合菌剂 |
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| 申请号 | CN202311706217.X | 申请日 | 2023-12-13 | 公开(公告)号 | CN117821295A | 公开(公告)日 | 2024-04-05 |
| 申请人 | 天津科技大学; | 发明人 | 才金玲; 胡秦博; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供了一种可在低温条件下高效降解秸秆的复合菌剂LHWA，由蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus,W118)、洛菲不动杆菌(Acinetobacter lwoffii,L1)、灰黄青霉(Penicillium griseofulvum,A2)和绳状蓝状菌(Talaromyces funiculosus,A6)组成。本发明复合菌剂LHWA可在低温条件下高效原地腐解秸秆、产生有机质，作为 生物 有机肥 基底可显著增加来年作物产量；从而避免秸秆收集、溶解 氧 补充及大型机械作业等生产工序，显著降低人 力 及机械作业的强度和成本。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种可在低温条件下高效降解秸秆的复合菌剂，其特征在于由蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus,W118)、洛菲不动杆菌(Acinetobacter lwoffii,L1)、灰黄青霉(Penicillium griseofulvum,A2)和绳状蓝状菌(Talaromyces funiculosus,A6)组成；其中：绳状蓝状菌A6的保藏编号：CGMCC No.21421，保藏日期：2020年12月29日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。 |
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| 说明书全文 | 一种可在低温下高效降解秸秆的复合菌剂技术领域背景技术[0002] 全世界每年生产超过数千亿吨的农作物秸秆，其中一些被焚烧或丢弃，导致自然资源的严重浪费和环境污染。因此，农业秸秆的有效利用对环境保护和资源再利用非常重要。玉米是世界上重要的农作物，也是常见的纤维素类资源。纤维素、半纤维素和木质素是玉米的主要物质成分，它们结合在一起形成高度刚性的作物网络结构。玉米秸秆的利用范围很广，如堆肥、厌氧消化、制氢、发电和建筑等。然而，由于纤维素是由多个葡萄糖分子通过β‑1,4‑糖苷键连接而成的直链高分子化合物，具有不溶性的刚性结构，分子间与分子内存在大量的氢键，它与木质素和半纤维素形成了复杂的三维网络。纤维素的存在阻碍了纤维素酶与木质纤维素和半纤维素的接触，从而限制了秸秆的生物利用率。由于玉米秸秆本身纤维素含量高，木质纤维素的结构十分稳定，尤其是在我国北方地区和南方作物采收后的低温环境导致秸秆腐解缓慢，不利于秸秆的循环利用，如果直接还田还会破坏耕地的土壤结构和性质，直接影响后续的农业生产。 [0003] 我国东北地区地处中纬度，年平均气温为5℃左右，这种低温环境极大的限制了土壤中微生物的生长，使土壤还田的自然降解受到极大的阻碍，东北地区土壤冻融频繁的特点进一步降低了秸秆的自热降解速度。因此，获得高效降解能力的耐低温微生物是打破高寒地区低温条件制约农作物秸秆资源化利用的有效路径。近年来围绕低温秸秆降解菌的开发领域已有不少研究工作，但能耐如此低温环境的菌剂很少，同时能用于东北地区冬季秸秆直接还田的菌剂更是几乎未见报道。获得高活性、深度耐低温的菌剂是十分必要的。 [0004] 随着化肥的过度施用导致土壤板结的一系列问题。对于有机肥的需求日益增长。秸秆中富含纤维素、半纤维素和木质素等有机物，经过合理处理将是重要的有机肥来源。但传承的生物有机肥生产需要将秸秆收集到一起，经过堆肥等过程将秸秆腐解生产有机肥。 堆肥工艺主要包括条剁式堆肥和反应器堆肥。其中反应器堆肥主要包括：卧式堆肥反应器、槽式堆肥反应器等。反应器可以快速堆肥成功，但反应器的成本高导致实际生产中的使用率较低。条剁式堆肥是目前应用最广泛的堆肥方式，但是堆肥过程是一个好氧发酵过程，在堆肥过程中要充分保证氧含量；如果氧含量不足，会导致氨气等污染气体产生。同时在堆肥过程中产生的大量生物热积累导致温度迅速升温，如果超过65℃会导致烧肥导致堆肥失败。因此，堆肥过程中至少需要2～3次的翻堆。而秸秆的处理量巨大，需要人力和机械成本过高，不利于规模化生产。 发明内容[0005] 鉴于上述问题，本发明提供一种可在低温条件下原地高效降解秸秆、同时生成腐殖质有机肥的复合菌剂。 [0006] 本发明所述可在低温条件下高效降解秸秆的复合菌剂LHWA，由蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus,W118)、洛菲不动杆菌(Acinetobacter lwoffii,L1)、灰黄青霉(Penicillium griseofulvum,A2)和绳状蓝状菌(Talaromyces funiculosus,A6)组成。 [0007] 其中，蜡样芽孢杆菌W118为已在专利CN115537349A中公开的菌株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号：CGMCC No.23973；洛菲不动杆菌L1为已在专利CN117106612A中公开的菌株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号：CGMCC No.24216；灰黄青霉A2为已在专利CN113481103A中公开的菌株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号：CGMCC No.19940； [0008] 绳状蓝状菌A6的保藏编号：CGMCC No.21421，保藏日期：2020年12月29日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。 [0009] 进一步地，所述复合菌剂LHWA中，蜡样芽孢杆菌W118、洛菲不动杆菌L1、灰黄青霉A2和绳状蓝状菌A6的活菌数比例为：1:2:1:1。 [0010] 优选地，所述复合菌剂LHWA中各菌的活菌数按菌落数量如下： [0011] [0012] 进一步地，本发明提供上述复合菌剂LHWA的制备方法，其特征在于：将蜡样芽孢杆菌菌株W118、洛菲不动杆菌L1、灰黄青霉菌株A2、绳状蓝状菌A6分别单独接种至CMC‑Na培养基中，于20～25℃振荡培养数天后离心收集4种菌体；用无菌生理盐水分别按所需浓度重悬4种菌体，得到4种菌悬液；将4种菌悬液按所需比例混合，得到复合菌剂LHWA。 [0013] 进一步地，本发明提供利用上述复合菌剂LHWA原位低温降解秸秆的方法，其特征在于：将复合菌剂LHWA均匀喷洒在秸秆表面，充分洒水保证秸秆的湿度不低于60％，之后在秸秆表面覆膜，于4℃下放置至少15天；其中，所述复合菌剂LHWA中各菌的活菌数均不低于7 1.0×10CFU/mL，所述复合菌剂的使用量为：每吨秸秆对应喷洒0.5～0.7kg菌剂。 [0014] 本发明复合菌剂LHWA可在低温条件下高效原地腐解秸秆、生产腐殖质生物有机肥，从而避免秸秆收集、溶解氧补充及大型机械作业等生产工序，显著降低人力及机械作业的强度和成本。本发明复合菌剂LHWA在4℃低温环境下，经30天液体发酵后，对秸秆的降解效率达到55％；发酵期间测定粗酶液中的纤维素酶、滤纸酶、漆酶以及木质素过氧化物酶的酶活最高分别达到：23.95±0.47U/mL、28.09±0.21U/mL、0.79±0.05U/mL、0.87±0.08U/mL，说明在低温条件下，复合菌剂LHWA各菌株之间能够发挥更好的协同作用，产生的木质纤维素水解酶加快秸秆的分解与转化，降解作用显著强于单一菌株。复合菌剂LHWA可在降解秸秆的同时产生大量生物有机肥，可显著增加来年作物产量。附图说明： [0015] 图1菌株A6的系统进化树。 [0016] 图2复合菌剂LHWA及单菌株4℃液体发酵15天时的酶活性；其中：a为CMC酶活，b为FPA酶活，c为Lac酶活，d为LiP酶活。 [0017] 图3复合菌剂LHWA在4℃下分别发酵7天、15天以及30天的秸秆降解率。 [0018] 图4玉米秸秆经复合菌剂LHWA降解不同时长后的秸秆表面形态电镜扫描图；其中：a为未处理的秸秆，b为降解15天后的秸秆残渣，c为降解30天后的秸秆残渣。 [0019] 图5玉米秸秆经复合菌剂LHWA降解不同时长后的傅里叶红外光谱图；其中：a为未处理的秸秆，b为降解15天后的秸秆残渣，c为降解30天后的秸秆残渣。 [0020] 图6玉米秸秆经复合菌剂LHWA降解不同时长后的X射线衍射图；其中：a为未处理的秸秆，b为降解15天后的秸秆残渣，c为降解30天后的秸秆残渣。 [0021] 本发明所述复合菌剂LHWA由蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus,W118)、洛菲不动杆菌(Acinetobacter lwoffii,L1)、灰黄青霉(Penicillium griseofulvum,A2)和绳状蓝状菌(Talaromyces funiculosus,A6)组成；其中，绳状蓝状菌A6的保藏编号：CGMCC No.21421，保藏日期：2020年12月29日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。 具体实施方式[0022] 下面结合各实施例对本发明技术方案做进一步说明。如无特殊说明，本发明中所使用的材料及方法均为本领域可通过常规途径获取、获知的材料、方法。 [0023] 实施例1 [0024] 菌株的筛选及纯化：将1％(w/v)的取自于不同寒冷生境的土壤样品加入到已灭菌的富集培养基中，在20℃摇床中以120rpm/min的速度，恒温振荡培养3d，此步骤重复两次。‑1 ‑7 吸取富集培养基的上清液1mL，加入灭菌后的蒸馏水进行10 到10 的梯度稀释。选取合适梯度分别涂布于带有刚果红的羧甲基纤维素钠(CMC‑Na)固体培养基上。将涂布平板密封倒置于20℃培养箱中恒温培养。挑取透明圈较大的单菌落置于含有12×1cm的滤纸条的蛋白胨纤维素液体培养基中进行纯化培养。观察滤纸条的崩解程度，将滤纸崩解程度最高的菌株在琼脂平板上进行3～4个划线循环。 [0025] 菌株复筛：以2％的接种量、蛋白胨纤维素培养基作为种子培养基，将前述初筛的滤纸崩解程度较高的菌株接种于培养基中于4℃下恒温静置培养。每2天取适量菌液测定OD600，最终得到编号为A6的具有秸秆降解能力的耐冷菌株。 [0026] 菌株鉴定：提取上述菌株A6的基因组DNA作为模板，进行16SrDNA的PCR扩增及测序。根据测序结果在NCBI的GeneBank数据库里进行Blast同源序列比对分析。结果如图1所示：菌株A6绳状蓝状菌(Talaromyces funiculosus)，在NCBI上的GeneBank登录号为OR910532。 [0027] 上述富集培养基成分：酵母粉1g，蛋白胨5g，NaCl 5g，CaCO3 2g，玉米秸秆10g，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃灭菌20min。 [0028] 上述CMC‑Na固体培养基成分：CMC‑Na 10g，KH2PO4 1.5g，蛋白胨5g，MgSO4·0.2g，NaCl 5g，琼脂粉10g，蒸馏水1000mL，pH＝7.0，121℃灭菌20min。 [0029] 上述蛋白胨纤维素培养基成分：酵母粉1g，蛋白胨5g，NaCl 5g，CaCO32g，玉米秸秆10g，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃灭菌20min。 [0030] 实施例2 [0031] 拮抗测试：取活化的菌种W118、L1、A2和A6，分别在培养基表面划线活化，进行两两拮抗实验(共6组3次重复)，之后于30℃恒温箱培养(细菌培养1～2天、真菌培养3～5天)，观察并记录不同菌株间的拮抗性。 [0032] 将接种于试管斜面的菌株打成菌块，放入装有无菌水和玻璃珠的三角瓶中，将菌块打碎制成菌悬液，将稀释好的菌悬液作为本底菌加入40～50℃的相应无菌培养基中，混匀倒平板。待平板冷却凝固后，用镊子将无菌牛津杯轻轻置于其上，吸取等量的其他菌株菌悬液于牛津杯中，每组试验重复3次，以无菌水代替牛津杯中的菌悬液作为空白对照。在培养箱中培养一段时间后，观察牛津杯周围是否出现抑菌圈，若没有出现抑菌圈说明本底菌与接种菌株无拮抗作用；反之，则说明2种菌之间存在拮抗作用。之后将本底菌的量加大到牛津杯中相应菌株菌悬液体积的1.5，2.0，2.5和3.0倍，重复上述试验，直至选出不出现抑菌圈或者抑菌圈大小可以忽略不计的比例。依据这一比例确定各个菌株的配比。同时，采用菌饼法验证上述试验，精确菌种配比。最终获得的菌种配比关系如表1所示。 [0033] 表1菌株配比关系 [0034] [0035] 实施例3 [0036] 细菌‑真菌复合菌剂LHWA的构建：通过平板对峙并用牛津杯试验加以验证发现4株菌之间不存在拮抗作用，具有良好的兼容性，适合进行各菌株之间的组合。分别制备细菌细胞悬浮液和真菌孢子悬浮液，并将4株秸秆降解菌进行全组合复配。按照各株菌等频率出现和等比例混合原则，构建菌株丰富度为4、6、4、1的复合菌剂。复合菌剂丰富度由低到高的组合如表2，共得到15种组合，每个组合重复3次并依次编号，在4℃条件下培养15天后测定其降解率。 [0037] 表2细菌‑真菌的全组合复配的秸秆降解率 [0038] [0039] [0040] 注：1和0分别表示菌株是、否参与复合菌剂的构建 [0041] 由上表可以看出相较于单菌株的秸秆降解率，复合菌剂的降解率均显著提高，4株菌种复配后的秸秆降解率最高，在4℃下15天后的降解率可达到33.29±0.48％。 [0042] 实施例4 [0043] 玉米秸秆低温降解复合菌剂LHWA的酶活性测定：将蜡样芽孢杆菌菌株W118、洛菲不动杆菌L1、灰黄青霉菌株A2、绳状蓝状菌A6以及复合菌剂LHWA，分别以4％的接种量接种到玉米秸秆培养基中，4℃下120rpm振荡培养15天后取样，发酵液于3000rpm、4℃离心15min后得到粗酶液，测定其纤维素酶(CMC)、滤纸酶(FPA)、漆酶(Lac)、木质素过氧化物酶(LiP)的酶活。 [0044] 上述玉米秸秆培养基成分：玉米秸秆(长度2‑3cm)10g，蛋白胨5g，酵母浸粉1g，NaCl 5g，CaCO3 2g，MgSO4·7H2O 0.05g，FeSO4·7H2O 0.5g，MnSO4·H2O 0.08g，CuSO4·5H2O 0.3g，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃灭菌20min。 [0045] 酶活测定结果如图2所示：15天后复合菌剂LHWA的4种酶活性均显著高于单菌株。在4℃条件下，复合菌剂LHWA的CMC酶活为23.95±0.47U/mL，而表现较高CMC酶活的单菌W118为13.78±0.44U/mL(图2a)；复合菌剂LHWA的FPA酶活为32.05±0.82U/mL，表现出较高的FPA酶活的单菌W118为21.02±1.33U/mL(图2b)；复合菌剂LHWA的Lac酶活为0.79± 0.05U/mL，表现出较高Lac酶活的单菌A2为0.64±0.05U/mL(图2c)；复合菌剂LHWA的LiP酶活为0.87±0.08U/mL，表现出较高LiP酶活的单菌A2为0.52±0.01U/mL(图2d)。各菌株复配后的酶活性都显著提高，体现了菌株之间有较好的协同作用。 [0046] 实施例5 [0047] 低温降解秸秆复合菌剂LHWA的秸秆降解率测定：将复合菌剂LHWA在4℃条件下对玉米秸秆进行发酵降解，于7天、15天和30天时测定降解率，发酵结束后，向秸秆发酵液加入3mL 2mol/L HCl，使其与培养基中的碳酸钙充分反应10分钟。将发酵液用4层已提前烘干的纱布过滤，蒸馏水冲洗滤渣表面，保证水稻秸秆干物质不受损失。将滤渣同纱布一起放入80℃烘箱烘干至恒重，记为M2。水稻秸秆初始质量记为M1。降解率根据如下公式计算： [0048] 秸秆降解率(％)＝(M1‑M2)/M1×100％。 [0049] 结果如图3所示：复合菌剂LHWA在7天、15天和30天后的秸秆降解率分别为25.04±0.08％、37.00±0.10％、55.52±0.58％。在低温条件下，复合菌剂LHWA产生的木质纤维素水解酶可以显著加快秸秆的分解，加速底物的分解和转化。木质纤维素测定采用Van Soest洗涤法测定纤维素、半纤维素和木质素含量。复合菌剂LHWA在4℃下对玉米秸秆发酵降解30天后，纤维素、半纤维素和木质素的降解率分别达到43.97％、38.31％和28.98％，如下表3所示。 [0050] 表3纤维素、半纤维素和木质素含量变化 [0051] [0052] 实施例6 [0053] 秸秆降解过程中表面形态的电镜扫描观察：分别取少量不同降解程度秸秆样品(包括未降解秸秆和分别降解15天、30天的秸秆残渣)进行表面形态及结构的电镜扫描。扫描观察时将样品用导电双面胶带固定在样品观测台上，在真空环境下进行镀金，在材料表面上形成导电膜后，通过扫描电子显微镜进行观察。观察结果如图4所示：未处理的秸秆经过机械破碎，表面上有少量的裂痕，但是其结构紧密表面光滑，纤维束排列整齐(图4a)；经过15天的降解后，秸秆外部开裂形成大的裂缝，但其内部骨架结构依旧较为完整(图4b)；经过30天的降解后，秸秆表面纤维束网状结构被明显破坏，表层呈不规则的碎片状，表面出现的大量孔洞深入内部，说明持续发酵降解已经彻底破坏了秸秆原有结构，使得秸秆原有的致密结构变得明显疏松和中空化，其整体比表面积和孔隙度显著增加(图4c)，该结构变化也有利于秸秆残渣的进一步降解。 [0054] 实施例7 [0055] 秸秆降解过程中的傅里叶红外光谱分析：分别取少量不同降解程度秸秆样品(包括未降解秸秆和分别降解15天、30天的秸秆残渣)进行如下处理：样品清洗烘干后粉碎，过40目筛；用天平称取秸秆粉末1.5mg，并与150mg充分干燥后的KBr粉末均匀混合，挤压成薄‑1 ‑1 ‑1 片状。傅里叶红外光谱扫描选择的波长范围为400cm 到4000cm ，扫描频率为2cm ，扫描次数为32次，KBr图谱作为背景色。 [0056] 结果如图5所示：在850～870cm‑1处木质纤维素中的C‑H处平面振动和拉伸，在腐解‑1开始15天后开始出现并逐渐增强；1050cm 处碳水化合物中的C‑O伸缩振动表明纤维素、半‑1 纤维素、糖类及其它碳水化合物正在分解；在2924cm 处‑CH2基团的C‑H反对称伸缩振动表明碳水化合物在逐渐分解，从而使羟基和亚甲基基团不断减少，表明腐解秸秆的脂肪族化‑1 合物含量下降；3428cm 处羟基和N‑H的伸缩振动，秸秆残渣的波峰透射率明显下降，主要是由于秸秆中的脂肪族化合物减少。 [0057] 实施例8 [0058] 秸秆降解过程中的X射线衍射分析：分别取少量不同降解程度秸秆样品(包括未降解秸秆和分别降解15天、30天的秸秆残渣)进行如下处理：样品清洗烘干后粉碎，过40目筛，对过筛后的秸秆残渣进行X射线衍射分析。X射线衍射扫描范围为5°到45°，步长0.02°。以未处理的玉米秸秆的结晶度作为对照。秸秆残渣的结晶度(CrI,％)由以下公式得出： [0059] CrI(％)＝(I002‑Iam)/I002 [0060] 式中，Iam为在2θ＝18.0°处的背景散射强度，I002为在2θ＝22.5°处的峰值强度。 [0061] 从图6中可以看出，玉米秸秆未处理的结晶度为42.90％；经过15天的降解秸秆残渣的结晶度为49.73％；经过30天的降解秸秆残渣的结晶度为52.34％。秸秆经过复合菌剂LHWA处理后结晶度不断增加，原因在于复合菌剂LHWA去除了更多的半纤维素、木质素和二氧化硅，同时纤维素中无定形区由于结构松散也遭到破坏,使得结晶区在秸秆中的相对比例上升。同时秸秆上的含氧官能团‑OH和‑COOH被用于产生自由基，从而破坏纤维素与半纤维素之间的氢键，有利于纤维素的进一步降解。 [0062] 实施例9 [0063] 秸秆原位降解及有机质产量测定：试验地点为黑龙江省东部地区的室外田间，时间为冬季11月份，将玉米采收后剩余的秸秆直接原田粉碎成5～10cm的小段，将复合菌剂7 LHWA(菌剂中各菌的活菌数均不低于1.0×10 CFU/mL)以0.5～0.7kg/吨均匀喷洒在秸秆上，充分洒水保证秸秆的湿度在60％以上，覆膜。来年春季多次随机取样测定秸秆降解率和有机质生成量。 [0064] 测定结果表明，截至第二年春季，复合菌剂LHWA对秸秆的降解率达到53％；秸秆腐解产物中的有机质含量57.4％、总养分8.6％、总N1.9％、P2O53.6％，K2O3.0％、有效活菌数为0.5亿/g。指标高于国家生物有机肥执行标准NY 884‑2021。表明经复合菌剂LHWA降解秸秆获得的产物富含有机质，可以作为生物有机肥基底。 [0065] 实施例10 [0066] 还田试验：试验地点为黑龙江省东部地区的室外田间，时间为冬季11月份，将玉米采收后剩余的秸秆直接原田粉碎成5～10cm的小段，将复合菌剂LHWA(菌剂中各菌的活菌数均不低于0.5亿/g)以0.4～1.0kg/亩均匀喷洒在秸秆上；将秸秆深翻(约25cm)，充分洒水保证土壤湿度在60％以上作为实验组(RM)。另外，以未添加菌剂的秸秆直接深翻(约25cm)还田的处理作为对照组(CK)，第二年春季5月初测定秸秆降解率，同时在第二年在作物(玉米)生长关键期测定土壤养分和作物产量。 [0067] 第二年春季5月初的秸秆降解率测定结果表明，经复合菌剂LHWA处理后的秸秆降解率达到51％，未经菌剂处理的秸秆降解率仅为11％。土壤养分和作物产量的测试分析结果如表4所示：添加菌剂的实验组(RM)较之对照(CK)显著提高了盐碱地土壤有机质、碱解氮、速效磷和速效钾的含量；对应地，实验组(RM)的玉米亩产量也明显高于对照(CK)，达到457kg/亩。 [0068] 表4添加菌剂对秸秆直接还田土壤养分含量的影响 [0069] [0070] |
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