特基拉芽孢杆菌、菌剂、植物促生长剂、生物肥料与应用 |
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| 申请号 | CN202410069727.9 | 申请日 | 2024-01-18 | 公开(公告)号 | CN117586925B | 公开(公告)日 | 2024-04-12 |
| 申请人 | 哈尔滨长升吉时农业发展有限公司; | 发明人 | 金羽; 董长升; 周国卿; 姜宝玉; 刘丽霞; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供了一种特基拉芽孢杆菌、菌剂、 植物 促生长剂、 生物 肥料 与应用，属于 微生物 技术领域。所述特基拉芽孢杆菌为特基拉芽孢杆菌CSJS‑1，分类命名为特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2023年07月05日，保藏编号为CGMCC No.27150。本发明的特基拉芽孢杆菌CSJS‑1不仅具有固氮、耐盐耐 碱 和产植物生长素的能 力 ，还能显著促进盐碱地 水 稻生长。试验证实，该菌株能提高生长在盐碱地中的水稻的株高、茎粗、地上干重、地下干重和全株干重，是一株耐盐碱的 植物促生菌 株。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一株特基拉芽孢杆菌，其特征在于，所述特基拉芽孢杆菌为特基拉芽孢杆菌CSJS‑1，分类命名为特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2023年07月 |
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| 说明书全文 | 特基拉芽孢杆菌、菌剂、植物促生长剂、生物肥料与应用技术领域背景技术[0002] 水稻作为主要的粮食作物之一，除了应用于主食外，还有很多其他用途。因此，水稻的产量与国家粮食安全密不可分。但从随着育种技术的进步，水稻单产已经达到较高水平，粮食产量仅靠提高单产来突破难度越来越大。 [0003] 盐碱地是一系列受盐碱作用，包括各种盐土、碱土及其他不同程度盐化合碱化土壤的统称。盐碱地就是土地含盐量较高，不适合种植常见的农作物或绝大部分植物。因此，虽然盐碱地作为一种重要的土地资源，但据统计绝大部分的盐碱地尚未得到开发利用，有着巨大的农业生产潜力。因此，利用盐碱地扩大水稻种植面积，已成为确保粮食安全和产量的重要举措之一。 [0004] 然而，盐碱胁迫会通过影响水稻的多个生理过程降低其产量及品质。针对盐碱地水稻生产的迫切需求，通过功能微生物改善盐碱胁迫下作物生长微环境、促进作物生长的研究也有相关报道，但不同微生物分泌大分子有机物、小分子酸、生长激素等物质不同，对盐碱地作物的促生作用有很大的区别，有的甚至会影响作物的生长。由于微生物改良是盐碱地生物修复的重要组成部分，因此，筛选能够适应盐碱环境并且能够改善土壤质地、促进水稻生长的菌株，是利用盐碱地提高水稻产量的关键。 发明内容[0005] 本发明的目的在于提供一种特基拉芽孢杆菌、菌剂、植物促生长剂、生物肥料与应用，该特基拉芽孢杆菌不仅具有固氮、耐盐耐碱和产植物生长素的能力，还能够显著促进盐碱地水稻生长。 [0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案： [0007] 本发明提供了一株特基拉芽孢杆菌，所述特基拉芽孢杆菌为特基拉芽孢杆菌CSJS‑1，分类命名为特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为 2023年07月05日，保藏编号为CGMCC No.27150。 [0008] 在本发明中，本发明的特基拉芽孢杆菌来源于黑龙江省大庆市林甸县盐碱地水稻田。所述特基拉芽孢杆菌CSJS‑1为长杆状、产芽孢的革兰氏阳性菌，菌落呈白色，光滑，凸起状。 [0009] 本发明还提供了一种菌剂，所述菌剂包括上述的特基拉芽孢杆菌或由上述特基拉芽孢杆菌制备得到。 [0010] 本发明还提供了一种植物促生长剂，所述植物促生长剂含有上述的特基拉芽孢杆菌或由上述的特基拉芽孢杆菌制备得到。 [0011] 本发明还提供了一种生物肥料，所述生物肥料含有上述的特基拉芽孢杆菌或由上述的特基拉芽孢杆菌制备得到。 [0012] 在本发明中，上述菌剂、植物促生长剂或生物肥料可由特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis CSJS‑1经发酵培养得到。本发明的上述菌剂、植物促生长剂或生物肥料的制备方法优选的包括以下步骤： [0013] 将所述特基拉芽孢杆菌在液体培养基中培养，离心取沉淀，用无菌水重悬沉淀，得到菌液，菌液与无菌水混合即得。 [0014] 在本发明中，将所述特基拉芽孢杆菌在液体培养基中培养，所述液体培养基可为LB液体培养基，所述LB液体培养基的成分组成见表1。所述培养的温度为28 32℃，所述培养~的时间为46 50h。在本发明中，培养后进行离心取沉淀，本发明对离心的方式没有具体限~ 定，采用本领域公知的离心方法进行即可。在本发明中，用无菌水重悬沉淀，得到菌液，菌液与无菌水混合即得。所述菌液的OD600优选为1.2~1.6。当菌液与无菌水混合时，所述菌液与无菌水的体积比优选为1：9 11，进一步优选为1:9.5 10.5，更进一步优选为1:10。 ~ ~ [0015] 在本发明中，经试验表明，所述特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis CSJS‑1具有高效的固氮、产吲哚乙酸的能力，还具有耐盐碱的能力，对盐碱地中的植物具有显著地促进其生长的能力。 [0016] 基于上述功能，本发明提供以下应用： [0017] 本发明还提供了一种上述特基拉芽孢杆菌、菌剂、植物促生长剂或生物肥料在固氮中的应用。 [0018] 本发明还提供了一种上述特基拉芽孢杆菌、菌剂、植物促生长剂或生物肥料在产植物生长素中的应用。 [0019] 本发明还提供了一种上述特基拉芽孢杆菌、菌剂、植物促生长剂或生物肥料在促进植物生长中的应用。 [0020] 在本发明中，所述植物生长素优选的包括吲哚乙酸，其中特基拉芽孢杆菌‑1 Bacillus tequilensis CSJS‑1产生吲哚乙酸的产量可达27.02mg·L 。所述植物优选的包括盐碱胁迫下的植物。所述植物优选的包括水稻。 [0021] 在以上所述的应用中，是将特基拉芽孢杆菌、菌剂、植物促生长剂或生物肥料喷洒在植物土壤中。 [0022] 在本发明中，所述植物土壤包括盐碱地土壤。 [0023] 与现有技术相比，本发明技术方案的有益效果为： [0024] 本发明提供了一种特基拉芽孢杆菌、菌剂、植物促生长剂、生物肥料与应用，本发明从盐碱地水稻根际分离筛选得到的特基拉芽孢杆菌，该菌株不仅具有固氮、耐盐耐碱和产植物生长素的能力，还能够显著促进盐碱地水稻生长。经试验证实，该菌株能够提高生长在盐碱地中的水稻的株高、茎粗、水稻地上干重、水稻地下干重和水稻全株干重，是一株耐盐碱的植物促生菌株。 [0025] 生物保藏信息： [0026] 本发明所述特基拉芽孢杆菌CSJS‑1，分类命名为特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis，于2023年07月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.27150。 附图说明 [0027] 图1中a为特基拉芽孢杆菌CSJS‑1的菌落图，b为贝莱斯芽孢杆菌RGPB‑1的菌落图，c为特基拉芽孢杆菌CSJS‑1的显微形态图，d为贝莱斯芽孢杆菌RGPB‑1的显微形态图； [0028] 图2中a为特基拉芽孢杆菌CSJS‑1的系统发育树，b为贝莱斯芽孢杆菌RGPB‑1的系统发育树； [0029] 图3为特基拉芽孢杆菌CSJS‑1的固氮能力检测结果图； [0030] 图4为特基拉芽孢杆菌CSJS‑1产IAA能力检测结果。 具体实施方式[0031] 下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。 [0032] 实施例1 [0033] 1、耐盐碱根际促生菌的分离、筛选与鉴定 [0034] 1.1试验材料 [0035] 主要试剂与培养基：试验所用试剂均购于天津科密欧化学试剂有限公司。 [0036] 试验中用到的培养基配方见表1。 [0037] 表1培养基配方 [0038] [0039] 供试土壤与有机基质：试验所用盐碱土一部分为模拟盐碱土（模拟轻度盐碱土、模拟中度盐碱土），另一部分为实际盐碱土。模拟盐碱土土壤取自东北农业大学盆栽场，通过加入碳酸钠调节土壤盐含量制备得到模拟盐碱土（含盐量：轻度0.1%，中度0.15%）；实际盐碱土取自黑龙江省大庆市肇源县，基本理化性质见表2。 [0040] 表2供试土壤的基本理化性质 [0041] [0042] 供试水稻：水稻品种为五优稻4号（Oryza sativa L.） [0043] 1.2、耐盐碱根际促生菌的分离、筛选 [0044] 根际土壤取自黑龙江省大庆市林甸县盐碱地水稻田，选取生长情况基本一致且生长健壮、无病虫害的水稻，整根挖出，完整采集根系，装入无菌采样袋中低温保存运输。称取10g土样混于装有100mL无菌水的锥形瓶中，在摇床上振荡30min，静置5min后进行梯度稀释，将100µL不同梯度土壤悬液浇注于分别含有0%、0.05%、0.1%、0.15%及0.2% Na2CO3的LB及PDA平板上培养，挑取长势较好的细菌及真菌菌落进行分离纯化。 [0045] 1.3、菌株显微形态及生理生化特征 [0047] 采用平板涂布法，待涂布后培养基长出单菌落后，进一步挑取单菌落多次划线进行纯化。将分离的菌株进行一系列促生能力测定，最终筛选出2株促生能力较强的细菌菌株命名为：特基拉芽孢杆菌CSJS‑1和贝莱斯芽孢杆菌RGPB‑1。其菌落形态、光学显微镜下的细胞及芽孢形态见图1。 [0048] 图1结果表明，特基拉芽孢杆菌CSJS‑1为长杆状、产芽孢的革兰氏阳性菌，菌落呈白色，光滑，凸起状；贝莱斯芽孢杆菌RGPB‑1为短杆状、产芽孢的革兰氏阳性菌，菌落呈白色、圆形，边缘不规整。 [0049] 特基拉芽孢杆菌CSJS‑1的生理生化特性如下：接触酶（+）、明胶液化（－）、吲哚试验（+）、甲基红（－）、V‑P试验（－）、葡萄糖水解（+）、淀粉水解（－）、产氨试验（+）、硝酸盐还原试验（+）、柠檬酸盐试验（+）、纤维素分解试验（+）、亚硝酸还原试验（－）；贝莱斯芽孢杆菌RGPB‑1的生理生化特性如下：接触酶（+）、明胶液化（+）、吲哚试验（+）、甲基红（+）、V‑P试验（－）、葡萄糖水解（+）、淀粉水解（+）、产氨试验（+）、硝酸盐还原试验（+）、柠檬酸盐试验（－）、纤维素分解试验（－）、亚硝酸还原试验（－）；其中，（+）表示阳性；（－）表示阴性。 [0050] 1.4、分子生物学鉴定 [0051] 将筛选到的2株促生菌送至上海美吉生物公司进行测序。利用BLAST软件对测序结果进行对比分析，即在GenBank中将2株菌PCR扩增后的16S rDNA序列与已知序列进行对比分析，结合其生理生化鉴定，并利用MEGA构建系统发育树。构建系统发育树结果如图2所示。 [0052] 图2结果表明，细菌特基拉芽孢杆菌CSJS‑1与贝莱斯芽孢杆菌RGPB‑1同属于芽孢杆菌属Bacillus sp.。 [0053] 2、耐盐碱根际促生菌的促生特性分析 [0054] 2.1、固氮特性 [0055] 将纯化分离出的菌株特基拉芽孢杆菌CSJS‑1点接种于Ashby固体培养基上，于28℃下倒置培养3d，观察菌株生长情况。 [0056] 如图3所示，菌株特基拉芽孢杆菌CSJS‑1在平板上生长旺盛，说明菌株具有良好的固氮能力。通过乙炔还原法测定特基拉芽孢杆菌CSJS‑1固氮酶活性达C2H4 52.5nmol/(h·mL)。 [0057] 2.2、产吲哚乙酸（IAA）特性 [0058] 将筛选出的菌种特基拉芽孢杆菌CSJS‑1接种于含有100mg·L‑1 L‑色氨酸5mL LB‑1液体培养基中，置于恒温摇床中30℃、150r·min 震荡培养48h，然后将培养液离心，取25mL上清液，加入2mL Salkowski显色液，测定530nm下的OD值，在标准曲线上计算出的IAA产量，对照组（CK）为未接菌培养基上清液。 [0059] 图4结果表明，特基拉芽孢杆菌CSJS‑1通过吲哚‑3‑丙酮酸途径将色氨酸转变为IAA，而在无机酸存在下，合成的吲哚乙酸又能与FeCl3作用，生成红色的螯合物。为了更好地体现菌株的产IAA能力，又对特基拉芽孢杆菌CSJS‑1其进行了产IAA定量检测，特基拉芽‑1孢杆菌CSJS‑1产生IAA产量可达27.02mg·L 。 [0060] 3、耐盐碱根际促生菌的生长特性分析 [0061] 3.1、菌株耐盐性 [0062] 将筛选到的促生菌特基拉芽孢杆菌CSJS‑1与贝莱斯芽孢杆菌RGPB‑1分别接种于含质量体积百分数为0.05%、0.1%、0.15%、0.2%及0.25% Na2CO3的LB培养基平板上，观察株菌的生长情况。结果见表3。 [0063] 表3 2株促生菌在不同盐浓度培养基上的生长情况 [0064] [0065] 注：表中“+”表示菌株正常生长，“‑”表示无法生长。 [0066] 表3结果表明，在盐浓度为0.05%、0.10%及0.15%的培养基中，特基拉芽孢杆菌CSJS‑1与贝莱斯芽孢杆菌RGPB‑1均具有一定的耐盐能力。 [0067] 3.2、菌株耐碱性 [0068] 将筛选到的促生菌特基拉芽孢杆菌CSJS‑1与贝莱斯芽孢杆菌RGPB‑1分别接种于pH为8、9、10、11及12的LB培养基平板上，观察株菌的生长情况。结果见表4。 [0069] 表4 2株促生菌在不同pH培养基上的生长情况 [0070] [0071] 注：表中“+”表示菌株正常生长，“‑”表示无法生长。 [0072] 表4结果表明，特基拉芽孢杆菌CSJS‑1与贝莱斯芽孢杆菌RGPB‑1在pH为8、9、10的培养基中均能正常生长，表明上述2株菌株均具有一定的耐碱能力。 [0073] 4、特基拉芽孢杆菌CSJS‑1对水稻秧苗的作用 [0074] 将特基拉芽孢杆菌CSJS‑1接种于LB液体培养基中，30℃摇床培养48h，离心弃上清，沉淀用无菌水重悬后，使菌液的OD600为1.4，取50mL菌液，用无菌水配成500mL菌悬液，将菌悬液喷洒于含模拟中度盐碱土标准水稻育秧盘（30cm×60cm）中，分别在水稻播种前、秧苗1叶1心、2叶1心期施用，共施用3次，每次施用时，即在30cm×60cm标准水稻育秧盘喷洒菌悬液500mL，同时对照组用500mL无菌水喷洒标准水稻育秧盘。取30天水稻秧苗，测定其生长指标，结果见表5。 [0075] 表5特基拉芽孢杆菌CSJS‑1对水稻秧苗生长指标的影响 [0076] [0077] 注：同列数据后不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 [0078] 表5结果表明，施用菌株CSJS‑1的处理组水稻秧苗各项指标显著优于处理组，其壮苗指数较对照组提高1.4倍，因此特基拉芽孢杆菌CSJS‑1促进了盐碱地的水稻秧苗生长。 [0079] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。 |
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