假单胞菌新菌株CD1及其生长促进剂和应用 |
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| 申请号 | CN202311758216.X | 申请日 | 2023-12-20 | 公开(公告)号 | CN117431193B | 公开(公告)日 | 2024-03-29 |
| 申请人 | 南京农业大学三亚研究院; | 发明人 | 董彩霞; 朱芝宜; 李培根; 梅新兰; 江高飞; 麻艳威; 徐阳春; 沈其荣; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及 微 生物 技术领域，特别涉及假单胞菌新菌株CD1及其生长促进剂和应用，本发明筛选出的菌株CD1经鉴定，其分类为假单胞菌，能有效促进梨树生长并具有良好的解磷能 力 ，经过 试剂 优选和优化发现褐藻寡糖能有效促进假单胞菌CD1的生长，经过对梨树的种植实验发现：在梨苗根部 灌溉 假单胞菌CD1与褐藻寡糖复配液后，能显著提升梨苗的生长效果；田间实验也发现，灌溉假单胞菌CD1与褐藻寡糖复配液后，能显著提升梨果实的大小和品质，比单独使用假单胞菌株CD1要更好。由此说明褐藻寡糖能做为假单胞菌CD1的生长促进剂，能协同作用于梨树，可以联合制备成梨树绿色增效 肥料 ，减少梨树对化肥的依赖。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种促进梨生长的假单胞菌属（Pseudomonas sp .）菌株 CD1，其保藏编号为CCTCC NO：M20231300。 |
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| 说明书全文 | 假单胞菌新菌株CD1及其生长促进剂和应用技术领域背景技术[0002] 在农业生产领域，传统的作物管理和培育策略普遍依赖于大量化学肥料的应用。这种做法虽在短期内有效提升作物产量与品质，但从长期角度观察，其导致了土壤退化、水体富营养化、生态系统失衡等一系列环境和健康问题，同时对农业生物多样性构成了严重威胁。此外，这些传统方法也面临着不断增加的经济成本及资源可持续性问题。 [0003] 鉴于上述挑战，科学人员和农业专家开始寻找更为可持续和环境友好的替代方案。在这方面，根际微生物对植物生长和果实品质提升中发挥重要作用。根际促生微生物主要通过产生生长素和合成铁载体等方式直接影响植物的根系发育和养分吸收，促进植物生长，在提高作物果实品质方面也显示出巨大潜力。特定的微生物菌株能通过增加果实中的糖分、维生素和抗氧化剂含量改善果实的营养价值、风味和品质。 [0004] 褐藻寡糖（AOS）作为一种海藻提取物，因其较低的分子量、小的黏性以及易于吸收和较强的生物活性，能有效促进植物生长、抗非生物胁迫、提高果实的采后品质和货架期，因而被广泛应用于农作物中，但是目前并没有其具有可促进微生物生长的相关报道。 [0005] 因此外源添加根际促生菌剂已被证明是促进植物生长和提高果实品质的有效方法。基于此，申请人提出：筛选具有特定功能的微生物，通过复配促生菌与褐藻寡糖来调整土壤生态系统。这一方法旨在通过褐藻寡糖提升微生物功能优化作物生长条件，并提升果实的品质，为农业生产提供一种环境友好且持续可行的解决方案。 发明内容[0006] 鉴于上述内容，有必要从现有技术中筛选出适合梨树生长的功能菌，丰富种质资源库，同时，还发现了褐藻寡糖可促进功能菌生长，有效改善功能菌单一作用时效果不稳定的现象，为功能菌株起到胁迫保护功能，为促进梨树生长，改善果实品质，创制新一代梨树绿色增效肥料。 [0007] 为达到上述目的，本发明筛选出了一株新菌株：假单胞菌属(Pseudomonas sp .)菌株CD1，其分类命名为：Pseudomonas sp. CD1，中文分类命名为：假单胞菌属 CD1，保藏编号为CCTCC NO：M20231300 ；该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国. 武汉. 武汉大学，保藏日期为 2023年07月17日。 [0008] 本发明还包括包含所述假单胞菌属(Pseudomonas sp .)菌株CD1的菌剂。 [0009] 本发明还包括所述假单胞菌属(Pseudomonas sp .)菌株CD1或所述菌剂在促进梨生长上的应用。 [0010] 本发明还包括所述假单胞菌属(Pseudomonas sp .)菌株CD1生长的促进剂，所述促进剂为褐藻寡糖。 [0011] 进一步的，所述褐藻寡糖的浓度为0.3‑1.8g/L。 [0012] 本发明还包括包含所述假单胞菌属(Pseudomonas sp .)菌株CD1的复配体系，所述复配体系中还包含褐藻寡糖。 [0013] 本发明还包括一种应用所述假单胞菌属(Pseudomonas sp .)菌株CD1促进梨树生长的种植方法，其特征在于，所述种植方法为：将假单胞菌属(Pseudomonas sp .)菌株CD1接种到梨树植株中。 [0014] 具体的步骤为如下步骤（1）‑步骤（2）。 [0015] （1）挑取假单胞菌属(Pseudomonas sp .)菌株CD1单菌落，接种到TSB液体培养基中，置于恒温摇床中，25‑30℃、170‑200 rpm培养10h～15h获得种子液，按照种子液和TSB液体培养基的体积比为1:100，将种子液接种于TSB液体培养基，置于恒温摇床中，25‑30 ℃、170‑200 rpm大批量培养8 h～12h得到假单胞菌属(Pseudomonas sp .)菌株CD1发酵液。 [0016] （2）将假单胞菌属(Pseudomonas sp .)菌株CD1发酵液通过平板计数的方式计算发酵液中的有效活菌数，然后将发酵液进行离心，弃去上清液，用无菌水将发酵液稀释成活7 菌浓度为10CFU/mL的发酵稀释液，浇灌于种植有梨的根部土壤中。 [0017] 本发明还包括一种应用所述促进剂对梨树进行提质增效种植的方法，所述方法为：将假单胞菌属(Pseudomonas sp .)菌株CD1接种到梨树根际中，之后再浇灌或喷施褐藻寡糖稀释液；所述褐藻寡糖稀释液由褐藻寡糖和无菌水按照体积比为1:1000配制而得；所述假单胞菌(Pseudomonas sp .)菌株CD1的保藏编号为CCTCC NO：M20231300。 [0018] 具体的步骤为如下步骤（1）‑步骤（3）。 [0019] （1）挑取所述假单胞菌属(Pseudomonas sp .)菌株CD1单菌落，接种到TSB液体培养基中，置于恒温摇床中，25‑30℃、170‑200 rpm培养10h～15h获得种子液，按照种子液和TSB液体培养基的体积比为1:100，将种子液接种于TSB液体培养基，置于恒温摇床中，25‑30 ℃、170‑200 rpm大批量培养8 h～12h得到假单胞菌属(Pseudomonas sp .)菌株CD1发酵液。 [0020] （2）将假单胞菌属(Pseudomonas sp .)菌株CD1发酵液通过平板计数的方式计算发酵液中的有效活菌数，然后将发酵液进行离心，弃去上清液，用无菌水将发酵液稀释成活7 菌浓度为10CFU/mL的发酵稀释液，浇灌于种植有梨的根部土壤中。 [0021] （3）将质量浓度为30%的褐藻寡糖和无菌水按照体积比1:1000稀释后，将稀释液浇灌或喷施于步骤（2）接种之后的梨树土壤中即可。 [0022] 本发明具有如下有益效果：1、本发明的申请人在梨树根际土壤中发现了多株对梨树有良好促生效果的微生物，在多株微生物中优选出最优菌株CD1，经鉴定，该菌株分类为假单胞菌属，能有效促进梨树生长，此外还具有良好的解磷能力，经过试剂优选和优化，发明人第一次发现褐藻寡糖能有效促进假单胞菌属菌株CD1的生长，由此说明褐藻寡糖能做为假单胞菌属菌株CD1的生长促进剂，经过梨苗的种植实验，还发现，如果在梨苗根部灌溉了假单胞菌CD1与褐藻寡糖复配液后，能显著提升梨苗的生长效果，比单独使用假单胞菌属菌株CD1要更好。经过梨树的田间灌根实验，还发现，如果在梨树根部灌溉了假单胞菌CD1与褐藻寡糖复配液后，能显著提升梨果实的大小和品质，比单独使用假单胞菌属菌株CD1要更好，由此说明，本申请的褐藻寡糖能有效促进假单胞菌属菌株CD1的生长，能协同作用于梨树，可以联合制备成梨树绿色增效肥料，减少梨树对化肥的依赖。 [0023] 2、目前还没有相关研究将褐藻寡糖与功能细菌结合应用于植物生长，本申请从梨树根际定向筛选功能细菌，探究褐藻寡糖对功能细菌的体外生长的影响，通过发挥功能细菌与褐藻寡糖的协同刺激作用，改善单一作用时效果不稳定的现象，同时为功能菌株起到胁迫保护功能，进而促进梨树生长，使梨的果实更大，有效改善果实品质，创制新一代梨树绿色增效肥料。附图说明 [0024] 图1为菌株CD1的平皿图。 [0025] 图2为不同菌株对梨苗地上部分干重的影响图。 [0026] 图3为不同菌株对梨苗地下部分干重的影响图。 [0027] 图4为不同菌株对梨苗总干重的影响图。 [0028] 图5为褐藻寡糖和CD1菌株对梨苗地上部分干重的影响图。 [0029] 图6为褐藻寡糖和CD1菌株对梨苗根干重的影响图。 [0030] 图7为褐藻寡糖和CD1菌株对梨苗总干重的影响图。 [0031] 图8为褐藻寡糖和CD1菌株对“丰水梨”果实纵经的影响图。 [0032] 图9为褐藻寡糖和CD1菌株对“丰水梨”果实横径的影响图。 [0033] 图10为褐藻寡糖和CD1菌株对“丰水梨”果实石细胞含量的影响图。 [0034] 图11为褐藻寡糖和CD1菌株对“黄冠梨”果实纵经的影响图。 [0035] 图12为褐藻寡糖和CD1菌株对“黄冠梨”果实横径的影响图。 [0036] 图13为褐藻寡糖和CD1菌株对“黄冠梨”果实石细胞含量的影响图。 具体实施方式[0039] 本实施例使用的益生菌为假单胞菌属(Pseudomonas sp .)菌株CD1，该菌株分类命名为：Pseudomonas sp. CD1，中文分类命名为：假单胞菌属 CD1，保藏编号为CCTCC NO：M20231300 ；该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国. 武汉. 武汉大学，保藏日期为 2023年07月17日。 [0040] 1、形态学鉴定：将CD1菌株接种于TSB培养基上，置于恒温培养箱中进行培养，培养1d后，平皿上菌落直径约为1mm，淡黄色，圆形，培养温度25℃‑30℃。具体如图1所示，可见，该菌符合假单胞菌属(Pseudomonas sp .)的形态学特征，将该菌株分类为假单胞菌属。 [0041] 2、假单胞菌属CD1筛选过程具体包括以下步骤。 [0042] （1）根际促生菌的分离与纯化：从甘肃省景泰县、北京市海淀区、河南省郑州市新乡、江苏省徐州市铜山区、江苏省盐城市大丰区梨园采集梨树根际土壤1 g，与9 mL SM缓冲液混合于50 mL的三角瓶中，30 ℃、170 r/min震荡30 min，取土壤悬浊液，土壤悬浊液与无‑5 ‑7菌水按照体积比1:9加入试管中，依次稀释至10 到10 ，在TSA固体培养基上涂布，并置于 30℃条件下静置培养。每日定时观察菌株生长状况，待到48h后，观察菌株外观形态。通过平板划线纯化法对分离的单菌落进行纯化，根据外观形态鉴别不同菌种，每种菌挑取3个单菌落划线。 [0043] （2）根际促生细菌的筛选：首先测定分离纯化所得1200株梨树根际细菌的产IAA能力，共筛选得到产IAA细菌 135 株。然后测定这135株菌的固氮、解有机磷、解无机磷、溶钾等各项促生能力，最终，统计得到3株四功能菌株（GH1、EE9和GB8），7株三功能菌株（CD1、GH4、GD4、QD11、QE1、NF7和LH2），4株两功能菌株（IF3、ID6、GG2和QE2）（表1）。 [0044] [0045] （3）根际促生菌复筛盆栽试验：杜梨育苗：杜梨种子提前浸泡12h后经表面消毒后于纱布上催芽，挑选萌发的幼芽点播于育苗盘中，待杜梨幼苗长至3片真叶，挑选长势一致的幼苗移栽到装有灭菌基质的花盆中。 [0046] （4）接菌：一周后分别接14株梨树根际促生菌发酵液（终浓度为107 CFU/g土），设置清水对照处理：不接种细菌（CK），培养条件均与其他接菌处理一致。每个处理12个重复，所有植物均生长在自然温度变化范围为25～30℃，湿度为50～70% RH的温室中。移栽30 天后测定其农艺性状。 [0047] 结果如图2‑图4所示。图2‑图4展示了不同菌株对梨苗生长影响的实验结果图； 图2为地上部分干重的影响、图3为根干重的影响、图4为总干重的影响。综合各指标，最终选择促生效果较好的CD1、GH4、ID6、GG2、IF3、GB8进行下一步研究。 菌株种属鉴定结果表明，ID6、IF3、GG2、GB8、GH4均为致病菌，因此，选择CD1进行下一步实验。 [0048]实施例2 [0049] 本实施例研究不同浓度褐藻寡糖对假单胞菌属菌株CD1生长的影响。 [0050] 供试菌株：实施例1筛选出的梨树根际促生假单胞菌属菌株CD1。 [0052] 制备梨树根际促生菌CD1种子液；TSB液体培养基分别加入褐藻寡糖，使各瓶中褐藻寡糖质量浓度分别为0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1g/L，每种处理3个重复，灭菌；接种各菌株种子液；测定各处理下的菌液OD600值，比较不同浓度褐藻寡糖的对菌株生长的影响，得到的结果如表3所示。 [0053] [0054] 由表3可知，在0.3‑1.8g/L的浓度下，随着褐藻寡糖浓度的增加，菌株CD1的OD600值也不断增加，特别是在0‑16h这个生长对数期内最明显，而当褐藻寡糖浓度浓度达到2.1g/L时，其促生长效果与1.8g/L浓度的促生长效果相差不大，说明随着褐藻寡糖浓度升高，培养液中的培养物成分浓度过高，也会影响菌株的细胞渗透性，活性会有一定的降低，因此，将褐藻寡糖做为CD1的促进剂而言，浓度在0.3‑1.8g/L的条件下最为合适。实施例3 [0055] 根据实施例2的试验开展促生假单胞菌属菌株CD1与褐藻寡糖复配盆栽试验。 [0056] 供试菌株：实施例3筛选出的梨树根际促生假单胞菌属菌株CD1。 [0057] 供试作物：杜梨。 [0058] 杜梨育苗：杜梨种子提前浸泡12h后经表面消毒后于纱布上催芽，挑选萌发的幼芽点播于育苗盘中，待杜梨幼苗长至3片真叶，挑选长势一致的幼苗移栽到装有灭菌基质的花盆中。 [0059] 接菌：一周后分别接假单胞菌属菌株CD1发酵液（终浓度为107 CFU/g土），褐藻寡糖1:1000稀释液（AOS），假单胞菌属菌株CD1发酵液+褐藻寡糖（AOS+CD1）1:1000稀释液，设置清水对照处理：不接种细菌（CK），培养条件均与其他接菌处理一致。每个处理12个重复，所有植物均生长在自然温度变化范围为25～30℃，湿度为50～70% RH的温室中。移栽30 天后测定其农艺性状。 [0060] 结果如图5‑图7所示：图5‑图7为褐藻寡糖（AOS）和CD1菌株对梨苗生长的影响其中，图5为地上部分干重的影响、图6为根干重的影响、图7为总干重的影响。从图中可见，经不同处理后，AOS+CD1组与单独的AOS组和单独的CD1组相比，植株的地上部分干重、根干重、总干重提升显著。实施例4 [0061] 根据实施例3的试验设计促生假单胞菌属CD1与褐藻寡糖（AOS）复配施用的田间实验。 [0062] 以“丰水”梨为试验材料。 [0063] 设置清水对照（CK），单接种假单胞菌属CD1处理、褐藻寡糖1:1000稀释液处理（AOS），假单胞菌属CD1与褐藻寡糖稀释液复配接种处理（AOS+CD1）。每个处理设5个重复，于8月中旬采收（当地正常采收期）测定果实大小与品质。 [0064] 结果如图8‑图10所示：图8‑图9为褐藻寡糖（AOS）和CD1菌株对“丰水”梨果实大小的影响。其中，图8为果实纵经的影响、图9为果实横径的影响、图10为果实石细胞含量的影响。 [0065] 由图8‑图10所示，与CK相比，单接AOS、CD1及AOS+CD1复配处理的“丰水”梨果实纵经得到了显著提高，分别提高了17.72%、15.87%、23.54%（图8）。单接AOS、CD1及AOS+CD1复配处理的“丰水”梨果横径均显著高于CK，分别提高了10.3%、8.87%、11.30%（图9）。其中，AOS+CD1复配处理效果最好。由图10所示，与CK相比，AOS、CD1及AOS+CD1处理后果实石细胞含量分别显著降低了 36.02%、64.75%、63.60%，且CD1及AOS+CD1复配处理下梨果实石细胞含量显著低于单独施用AOS处理。实施例5 [0066] 根据实施例3的试验设计促生假单胞菌属CD1与褐藻寡糖复配施用田间实验。 [0067] 以“黄冠”梨为试验材料。 [0068] 设置对照（CK）、假单胞菌属CD1与褐藻寡糖稀释液复配接种处理（AOS+CD1）、微肥处理（MF）、以及假单胞菌属CD1、褐藻寡糖稀释液和微肥的复合处理（AOS+CD1+MF）。每个处理设10个重复，于9月中旬采收（当地正常采收期）测定果实大小与品质。 [0069] 结果如图11‑图13所示：图11‑图13 为褐藻寡糖和CD1菌株对“黄冠”梨果实大小的影响。其中，图11为果实纵经的影响、图12为果实横径的影响、图13为果实石细胞含量的影响。 [0070] 从图中可见，各处理均在一定程度上提高果实大小。由图11‑图12所示，与CK相比，施用MF、AOS+CD1、AOS+CD1+MF均显著提高果实纵横径，其中纵径分别提高了9.3%、4.4%、9.3%（图11），横径分别提高了12.6%、11.9%、13.3%（图12），其中复配处理AOS+CD1+MF提升效果最优。由图13所示，与CK相比，施用MF、AOS+CD1、AOS+CD1+MF均显著降低果实石细胞含量 35.8%、55.2%、63.4%。其中，AOS+CD1和AOS+CD1+MF处理下果肉石细胞含量降幅最大，与CK达到显著差异。 [0071] 综上所述，经试验验证，褐藻寡糖能有效促进假单胞菌属Pseudomonas（CD1）的生长，是一种不可多得的针对假单胞菌属Pseudomonas（CD1）的促生剂，经过验证褐藻寡糖与假单胞菌属Pseudomonas（CD1）复配使用具有协同增效的效果，能有效提升梨苗的生长、在田间实验时，能显著提升梨树品质，使梨的果实更大。 [0072] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。 |
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