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一种假单胞菌NH-1及其培养方法和应用

申请号 CN202410306773.6 申请日 2024-03-18 公开(公告)号 CN118028173A 公开(公告)日 2024-05-14
申请人 集美大学; 发明人 江兴龙; 刘勇;
摘要 本 发明 公开一种假单胞菌NH‑1及其培养方法和应用。本发明分离得到一株可在异养好 氧 条件下对 水 产养殖 废水 中 氨 氮起到高效降解作用的功能菌株,根据菌落形态和16S rDNA基因测序分析及系统发育分析,鉴定该菌株属于假单胞菌(Pseudomonas sp.)的不同株系,并将其命名为假单胞菌NH‑1,于2023年12月11日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 20232429。本发明的假单胞菌NH‑1可在异养好氧环境下降解养殖 水体 中的氨氮,对 水生动物 无毒害作用,可实现氨氧化细菌在异养条件下快速 硝化作用 改善养殖水体环境。
权利要求

1.一种假单胞菌,其特征在于,所述假单胞菌为假单胞菌NH‑1(Pseudomonas sp.NH‑
1),保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 20232429。
2.如权利要求1所述的假单胞菌的生物学纯培养物。
3.如权利要求1所述的假单胞菌或权利要求2所述的假单胞菌的生物学纯培养物在养殖体中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于:所述应用为在异养好条件下降低养殖水体中氮浓度。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于:所述假单胞菌NH‑1的接种量仅为1%。
6.如权利要求1所述假单胞菌NH‑1或权利要求2所述的假单胞菌的生物学纯培养物在制备降解养殖水体中氨氮的微生态制剂的应用。
7.权利要求1所述假单胞菌NH‑1的培养方法,其特征在于:将所述假单胞菌NH‑1置于LB液体培养基中,在28℃、180r/min条件下,连续培养24h。
8.一种菌剂,其特征在于,所述菌剂包括权利要求1所述的假单胞菌或权利要求2所述的假单胞菌的生物学纯培养物。

说明书全文

一种假单胞菌NH‑1及其培养方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种假单胞菌NH‑1及其培养方法和应用。

背景技术

[0002] 氮为体富营养化的主要诱发因子,严控水中氨氮含量对预防水产养殖病害和水体富营养化尤为重要。随着工农业生产的发展,大量未经处理的废水直接进入水体,导致各水体中氨氮的含量不断增加,水体富营养化越来越严重。目前,去除养殖水体中有害氨氮的方法以物理法、化学法和生物法为主。物理法和化学法相比采用生物法治理投入较大,而且容易污染。因此,在相对密闭的水环境中如何高效及时的转化或去除氨氮,成为水产养殖+中极待解决的重要问题。生物脱氮第一步是异养菌通过氨化作用将有机氮分解为NH4 ‑N,在+ ‑ ‑ ‑
基础上利用氨化细菌将NH4‑N氧化为NO2‑N或NO3‑N,最终利用反硝化细菌将NO2‑N或‑
NO3 ‑N还原为气态产物(包括N2、N2O、NO)。其中,氨氧化细菌的硝化作用是养殖水体或尾水‑ ‑ ‑
脱氮的关键环节之一。硝化作用通常包括NH3到NO2 (氨氧化)和NO2 到NO3 (亚硝酸氧化)两步氧化过程。生物除氮法的优点主要有成本低、工作量小,效率高,适用范围广等。多项研究表明,在水体污染治理中,生物除氮具有良好的应用效果。
[0003] 目前传统生物脱氮技术主要基于自养氨氧化细菌,自养菌的缺陷在于其生长极为缓慢降解效果不佳。近年来,耐高温的异养氨氧化细菌脱氮技术在堆肥处理中表现出良好的应用前景,但关于水产养殖用异养氨氧化细菌的研发与应用极少。异养氨氧化细菌的生命活动受到外部条件影响较小,生长速率快,且细胞产量也大,可以在较低含氧量、pH更广的条件下存活,活性高。特别是当自养氨氧化细菌活性受到限制或停止时,异养氨氧化菌在氮素循环中起主要作用,在氨氧化作用的过程中占据主要地位。因此,亟需开发一种对水生经济动物无害的水产养殖用异养氨氧化细菌。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于克服现有技术的不足之处,提供了一种假单胞菌NH‑1及其培养方法和应用,解决了上述背景技术中的问题。
[0005] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是:提供了一种假单胞菌,其为假单胞菌NH‑1(Pseudomonas sp.NH‑1),保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 20232429。
[0006] 上述假单胞菌的生物学纯培养物。
[0007] 上述假单胞菌或假单胞菌的生物学纯培养物在养殖水体中的应用。
[0008] 优选地,所述应用为在异养好氧条件下降低养殖水体中氨氮浓度。
[0009] 优选地,所述假单胞菌NH‑1的接种量仅为1%。
[0010] 上述假单胞菌或假单胞菌的生物学纯培养物在制备降解养殖水体中氨氮的微生态制剂的应用。
[0011] 上述假单胞菌NH‑1的培养方法,将所述假单胞菌NH‑1置于LB液体培养基中,在28℃、180r/min条件下,连续培养24h。
[0012] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是:提供一种菌剂,所述菌剂包括上述假单胞菌或上述假单胞菌的生物学纯培养物。
[0013] 本发明提供了一种可在异养条件下对水产养殖废水中氨氮起到降解作用的假单胞菌NH‑1,该菌株属于好氧异养菌,可高效降解养殖水体中的氨氮,对水生动物无毒害作用,具有应用条件广、降解效果好、效率高、不产生二次污染等优点,可应用于改善养殖水体环境。
[0014] 本申请的假单胞菌NH‑1与现有技术(专利号为CN201010568442.8、CN202311069433.8、CN202110814486.2、CN202310991600.8和CN202310609010.4等)所公开的菌株的主要区别与优势在于:
[0015] 1.本申请假单胞菌NH‑1的降氮速度明显快于现有菌株的速度,可实现较少接种量在短时间快速去除氨氮的效果,并且氨氮降解率更加显著。
[0016] 2.本申请假单胞菌NH‑1具有异养氨氧化能,在较低C/N条件下条件对氨氮的降解效果更加显著。
[0017] 3.本申请假单胞菌NH‑1分离于水生经济动物养殖环境内,应用于养殖水体中对水生动物无毒害作用,可广泛适用于更多种类的水生经济动物养殖场景。
[0018] 保藏说明
[0019] 保藏地址:中国武汉武汉大学
[0020] 保藏日期:2023年12月11日
[0021] 菌种名称:假单胞菌
[0022] 拉丁名:Pseudomonas sp.
[0023] 菌株编号:NH‑1
[0024] 保藏机构:中国典型培养物保藏中心
[0025] 保藏机构简称:CCTCC
[0026] 保藏中心登记入册编号:CCTCC NO:M 20232429附图说明
[0027] 图1为基于假单胞菌NH‑1 16S rDNA的系统发育进化树。
[0028] 图2为假单胞菌NH‑1的生长曲线。

具体实施方式

[0029] 为了更好地理解本发明,下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明,但本领域技术人员了解,下述实施例不是对本发明保护范围的限制,任何在本发明基础上做出的改变和变化,都在本发明的保护范围之内。
[0030] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
[0031] 下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
[0032] 实施例1假单胞菌NH‑1的分离筛选
[0033] S1.取样:本实验菌株样品为池塘活性污泥,从福建某鳗鲡养殖场池塘采集。采集的污泥及时放入4℃箱保存备用。
[0034] S2.富集培养:称取10g污泥样品,加入100ml无菌水搅拌均匀使泥水混合。静置5分钟吸取10mL上清液液,放入100mL异养硝化培养基中,在28℃,180r/min条件下富集培养2d。
[0035] 异养硝化培养基:(NH4)2SO4 0.47g,C4H4Na2O4 0.5g,维氏盐溶液50ml,蒸馏水定容至1L,pH 7.4,121℃灭菌30min(固体培养基加入18g琼脂)。
[0036] 维氏盐溶液:K2HPO4 5.0g,MgSO4·7H2O 2.5g,NaCl 2.5g,FeSO4·7H2O 0.1g,MnSO4·4H2O 0.1g,蒸馏水定容1L。
[0037] S3.分离纯化:将富集培养的菌液吸取100μL加入装有900μL无菌水的1.5mL离心管‑1 ‑7 ‑5 ‑6 ‑7中,混匀,依次制成10 ~10 不同稀释倍数梯度的菌悬液。再分别取10 、10 和10 三个稀释倍数的菌悬液200μL于异养硝化固体培养基中,用三玻璃棒均匀涂布。稀释涂布后的异养硝化培养基于28℃恒温摇床中倒置培养至长成肉眼可见的明显菌落,用接种环从培养基中挑选出菌落形态、大小和颜色等不同的单菌落。将挑出的菌落于新的异养硝化固体培养基上划线分离,继续于28℃恒温摇床中倒置培养,多次重复划线分离,直到获得菌落形态一致无杂菌感染即可。并将纯化的单菌落接种于LB斜面固体培养基中4℃冰箱保存。
[0038] LB培养基:NaCl 10g,酵母提取物5g,蛋白胨10g,H2O 1L,pH 7.0~7.4,121℃灭菌30min。
[0039] S4.筛选和保藏:将保存于斜面培养基的单菌落接种于LB液体培养基培养24h制成种子液;将种子液以1%接种于合成废水培养基上,于28℃、180r/min的恒温摇床中培养24h。取适量培养后的培养基液体于白瓷比色板并加入适量格里斯试剂,观察培养基颜色变化,变红表明有亚硝酸盐产生即存在亚硝化作用,挑选变红对应接种的菌株为初筛菌株,将初筛菌株种子液以1%接种于200ml的鳗鲡养殖尾水中,于28℃、180r/min的恒温摇床中培养24h。测定菌悬液OD600,再将菌悬液经28℃、8000r/min高速离心10min,检测各菌株的氨氮降解效率,选取降解最高的菌株作为目标菌株。
[0040] 合成废水培养基:葡萄糖0.62g,(NH4)2SO4 0.25g,KH2PO40.0659g,KNO3 0.722g,MgSO4·7H2O 0.2g,微量元素溶液2mL,蒸馏水定容至1L,pH7.4,121℃灭菌30min。
[0041] 微量元素溶液:(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.096g,H3BO3 0.62g,CaCl20.18g,CuSO4 0.06g,MnCl2·4H2O 0.63g,ZnSO4·7H2O 0.125g,蒸馏水定容至1L。
[0042] 实施例2假单胞菌NH‑1的鉴定
[0043] 纯化后的细菌采用TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver .3.0提取菌株的基因组DNA。以16S  rDNA序列的通用引物27F(5'‑AGAGTTTGATCCTGGCTCAG‑3',如SEQ ID NO:2所示)和1492R(5'‑GGTTACCTTGTTACGACTT‑3',如SEQ ID NO:3所示)为PCR反应引物,使用2×TsingKE Master Mix体系进行PCR扩增。PCR反应体系为:基因组DNA 1μL,2×Tsing KE Master Mix 25μL,27F Primer(10μM)1μL,
1492R Primer(10μM)1μL,dH2O 22μL。PCR反应条件为:预变性94℃10min,30个循环(94℃
30s、55℃30s、72℃1.5min),延伸72℃10min。将获得的PCR产物经纯化后,送样至生物工程(上海)股份有限公司测序。
[0044] 将菌株NH‑1的16S rDNA序列(1438)上传到NCBI数据库并进行BLAST同源序列比对,结果显示与Pseudomonas sp.strain Arc8‑118(MN784298.1)、Pseudomonas toyotomiensis strain T10AT14(JQ317804.1)和Pseudomonas oleovorans strain ATHUBA4008(ON678191.1)等菌株的相似性均高于99%,采用MEGA7构建的系统发育进化树如图1所示。结合上述分析结果,该菌株鉴定为Pseudomonas sp.NH‑1。
[0045] 假单胞菌NH‑1的16S rDNA序列(如SEQ ID NO:1所示):CGGGGGGGCGGGCCTACACATGCAGTCGAGCGGATGAGGAGGAGCTTGCTCCTTGATTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTTCCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCATTAACCTAATACGTTAGTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCGAGCTAGAGTACGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGTTCCTTGAGAACTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGCTGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCAGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTAATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGGGACGGTACCACGGAGATTAAAG
[0046] 实施例3假单胞菌NH‑1的生长曲线
[0047] 挑取纯菌株NH‑1接种于已灭菌的LB液体培养基中,28℃、180r/min培养24h制备种子液。将种子液以1%接种至100ml的LB液体培养基,于28℃、180r/min条件下振荡累计培养48h,并分别在0、1、2、4、6、8、10、12、16、20、24、30、36、42和48h测定OD600。以OD600为纵坐标,培养时间为横坐标,绘制生长曲线。
[0048] 使用LB液体培养基加入1%的种子液培养,定时测定菌悬液的OD600,来反映NH‑1菌株培养过程增值随时间变化特点。如图2所示,0~4h生长缓慢,4~16h进入对数增殖期生长迅速,16~24h增值减速,24h达到最大值进入稳定期。
[0049] 实施例4假单胞菌NH‑1在不同时间段的氨氮降解效果
[0050] 挑取纯菌株NH‑1接种于已灭菌的LB液体培养基中,28℃、180r/min培养24h制备种子液。以鳗鲡养殖尾水作为本底,将NH‑1以1%的接种量接种于1L的鳗鲡养殖尾水,每升养殖尾水加入无水葡萄糖0.22g作为源,pH7.5。于28℃、180r/min条件下振荡培养,并分别在0、1、2、4、6、8、10、12、16、20和24h采样,28℃、8000r/min条件下高速离心,测量上清液中氨氮浓度。
[0051] 如表1所示,在初始氨氮浓度6.472mg/L的条件下,0~4h处于生长迟缓期,氨氮降解率极低,4~12h降解效率快速增加,之后增值减速,24h氨氮降解率达到最大的92.60%。专利CN201010568442.8公布的自养型假单胞菌A.P‑8其氨氮降解17d去除率才达到90%以上;专利CN202310991600.8公布的一株嗜蛋白地芽孢杆菌,其在异养条件下对氨氮实现高效降解也需要3~5d;专利CN202310609010.4公布的两株异养型枯草芽孢杆菌JHD‑Z1和地衣芽孢杆菌JHD‑Z2其单独作用时96h氨氮的去除率仅70%以上。假单胞菌NH‑1相较以上的菌株,在短时间内均具有更高的氨氮降解率。表明NH‑1菌株作为一株异养氨氧化细菌具有高效、快速的亚硝化功能,拥有较好的应用前景。
[0052] 表1假单胞菌NH‑1在不同时间段的氨氮降解速率
[0053] 时间(h) 处理组氨氮浓度(mg/L) 氨氮降解率(%)0 6.472±0.027 0.00
1 6.355±0.031 1.80
2 6.238±0.016 3.61
4 5.888±0.028 9.02
6 5.032±0.052 22.25
8 3.592±0.046 44.50
10 2.347±0.021 63.74
12 1.568±0.018 75.77
16 0.829±0.039 87.19
20 0.634±0.031 90.20
24 0.479±0.025 92.60
[0054] 实施例5假单胞菌NH‑1在不同培养转速下对养殖水质中氨氮降解效果测定[0055] 挑取纯菌株NH‑1接种于已灭菌的LB液体培养基中,28℃、180r/min培养24h制备种子液。以鳗鲡养殖尾水作为本底,将NH‑1菌株以1%的接种量接种于1L的鳗鲡养殖尾水,每升养殖尾水加入无水葡萄糖0.22g作为碳源,pH7.5。设置6个不同转速的处理组:20、60、100、140、180、220r/min,并在28℃条件下于恒温摇床中振荡培养24h后取样,28℃、8000r/min条件下高速离心,测量上清液中氨氮浓度,测定结果见表2。
[0056] 在不同培养转速的作用下NH‑1的氨氮的降解效果是不同的,在初始氨氮浓度6.132mg/L的条件下,转速在20~140r/min时氨氮的降解率随着转速的增加而升高;140r/min时NH‑1氨氮降解率达到最高值的93.28%之后不再升高,反而随转速不断增加有降低的趋势。因此转速140r/min即是NH‑1较理想的培养环境。
[0057] 表2假单胞菌NH‑1在不同培养转速下对养殖水质中氨氮降解效果测定
[0058]转速(r/min) 处理组氨氮浓度(mg/L) 氨氮降解率(%)
20 3.023±0.038 50.70
60 1.843±0.052 69.94
100 0.856±0.016 86.04
140 0.412±0.049 93.28
180 0.542±0.021 91.16
220 0.565±0.044 90.79
[0059] 实施例6假单胞菌NH‑1在不同水温下对养殖水质中氨氮降解效果测定
[0060] 挑取纯菌株NH‑1接种于已灭菌的LB液体培养基中,28℃、180r/min培养24h制备种子液。以鳗鲡养殖尾水作为本底,将NH‑1菌株以1%的接种量接种于1L的鳗鲡养殖尾水,每升养殖尾水加入无水葡萄糖0.22g作为碳源,pH7.5,设置9个不同水温的处理组:10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃,并在180r/min条件下于恒温摇床中振荡培养24h后采样,28℃、8000r/min条件下高速离心,测量上清液中氨氮浓度,测定结果见表3。
[0061] 在初始氨氮浓度6.654mg/L的条件下,NH‑1菌株在水温15~35℃时对氨氮具有较高降解效果,25℃时效果最好氨氮降解率为92.97%,在15℃的低温条件氨氮降解率仍能分别保持在64.73%,当水温在25℃以后上升时NH‑1的氨氮降解能力开始降低,温度达到35℃时氨氮降解率仍然保持在50%以上。表明NH‑1菌株具有广温性,能够在绝大多数水温条件下实现高效的氨氮降解能力。
[0062] 表3假单胞菌NH‑1在不同温度下对养殖水质中氨氮降解效果测定
[0063]温度(℃) 处理组氨氮浓度(mg/L) 氨氮降解率(%)
10 4.146±0.053 37.69
15 2.347±0.046 64.73
20 0.884±0.033 86.71
25 0.468±0.014 92.97
30 1.426±0.027 78.57
35 2.746±0.048 58.73
[0064] 实施例7假单胞菌NH‑1在不同pH下对养殖水质中氨氮降解效果测定
[0065] 挑取纯菌株NH‑1接种于已灭菌的LB液体培养基中,28℃、180r/min培养24h制备种子液。以鳗鲡养殖尾水作为本底,将NH‑1以1%的接种量接种于1L的鳗鲡养殖尾水,每升养殖尾水加入无水葡萄糖0.22g作为碳源,设置5个不同pH的处理组:5、6、7、8、9,并在28℃、180rpm条件下于恒温摇床中振荡培养24h后采样,28℃、8000r/min条件下高速离心,测量上清液中氨氮浓度,测定结果见表4。
[0066] 在不同pH的作用下NH‑1具有不同表现。在初始氨氮浓度6.127mg/L的条件下,NH‑1的氨氮最适pH为8,最高降解率为91.48%,在酸性条件下其氨氮降解效果受到很大程度抑制,pH在7以上的条件时,氨氮的降解效果较好。NH‑1适宜弱性水体,也能适应大多数养殖水体。
[0067] 表4假单胞菌NH‑1在不同温度下对养殖水质中氨氮降解效果测定
[0068]
[0069]
[0070] 实施例8假单胞菌NH‑1在不同碳源下对养殖水质中氨氮降解效果测定
[0071] 挑取纯菌株NH‑1接种于已灭菌的LB液体培养基中,28℃、180r/min培养24h制备种子液。以鳗鲡养殖尾水作为本底,将NH‑1以1%的接种量接种于1L的鳗鲡养殖尾水。以每升培养尾水中添加0.22克无水葡萄糖的含碳量为标准,换算出其他碳源的碳量,这些碳源分别为乙酸钠、麦芽糖、蔗糖、丁二酸钠、葡萄糖和柠檬酸钠,在pH7.5,于28℃、180r/min条件下振荡培养24h采样,28℃、8000r/min条件下高速离心,测量上清液中氨氮浓度。
[0072] 如表5所示,在初始氨氮浓度5.765mg/L的条件下,NH‑1在以葡萄糖和乙酸钠为碳源时对氨氮的降解效果较佳,氨氮降解率分别达到了93.32%和90.60%,麦芽糖和蔗糖双糖利用效果不佳,氨氮降解效果不足30%。表明NH‑1菌株作为一株异养菌株对葡萄糖和乙酸钠等单糖具有良好的利用效果。
[0073] 表5假单胞菌NH‑1在不同碳源下对养殖水质中氨氮降解效果测定
[0074] 碳源 处理组氨氮浓度(mg/L) 氨氮降解率(%)乙酸钠 0.542±0.038 90.60
麦芽糖 4.353±0.079 24.49
蔗糖 4.215±0.042 26.89
丁二酸钠 2.267±0.021 60.68
葡萄糖 0.385±0.016 93.32
柠檬酸钠 2.759±0.025 52.14
[0075] 实施例9假单胞菌NH‑1在不同接种量下对养殖水质中氨氮降解效果测定
[0076] 挑取纯菌株NH‑1接种于已灭菌的LB液体培养基中,28℃、180r/min培养24h制备种子液。以鳗鲡养殖尾水作为本底,将NH‑1分别以0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%的接种量接种于1L的鳗鲡养殖尾水,每升养殖尾水加入无水葡萄糖0.22g作为碳源,pH7.2。于28℃、180r/min条件下振荡培养24h采样,28℃、8000r/min条件下高速离心,测量上清液中氨氮浓度。
[0077] 如表6所示,在初始氨氮浓度5.963mg/L的条件下,接种量为1%时NH‑1菌株的氨氮降解率达到最高值94.10%,当接种量继续升高其氨氮降解率不升反有降低的趋势。专利CN202310609010.4公布的两株枯草芽孢杆菌JHD‑Z1和地衣芽孢杆菌JHD‑Z2的接种量则均需要2%时才能达到氨氮的最高降解效果,专利CN202310991600.8公布的嗜蛋白地芽孢杆菌需要5%的接种量,专利CN202110814486.2公布的一株异养功能菌株更是需要10%的接种量。以上结果表明NH‑1菌株作为一株异养菌株能够在较低的接种量条件下实现更高效氨氮降解功能,拥有较好的应用前景。
[0078] 表6假单胞菌NH‑1在不同接种量下对养殖水质中氨氮降解效果测定
[0079]接种量(%) 处理组氨氮浓度(mg/L) 氨氮降解率(%)
0.5 0.495±0.028 91.70
1.0 0.382±0.051 93.59
1.5 0.574±0.044 90.37
2.0 0.685±0.036 88.51
2.5 0.974±0.043 83.67
3.0 0.926±0.020 84.47
[0080] 实施例10假单胞菌NH‑1在水产养殖应用中的安全性检测
[0081] 挑取纯菌株NH‑1接种于已灭菌的LB液体培养基中,28℃、180r/min于恒温振荡器7
内扩增培养24h制备种子液。以2.63×10cfu/L的接种量至循环水澳洲鳗鲡养殖系统的水处理系统生物滤池单元中,添加无水葡萄糖为补充碳源,循环水澳洲鳗鲡养殖均正常按2%投料率投喂饲料和管理,持续2周。
[0082] 循环水澳洲鳗鲡养殖期间,澳洲鳗鲡健康生长,无发病和死亡。结果表明,假单胞菌NH‑1应用于澳洲鳗鲡养殖的脱氮降磷过程中具备较为稳定的安全性。
[0083] 综上,假单胞菌NH‑1可高效降解养殖水体中的氨氮,对水生动物无毒害作用,具有应用条件广、降解效果好、效率高、不产生二次污染等优点,可应用于改善养殖水体环境。与现有技术相比,假单胞菌NH‑1的降氮速度明显快于现有菌株的速度,可实现短时间快速降解氨氮的效果,并且氨氮降解效果更加显著。且假单胞菌NH‑1属于异养细菌,在添加葡萄糖等碳源的异养条件对氨氮的降解效果显著提升,同时其分离于水生经济动物养殖环境内,应用于养殖水体中对水生动物无毒害作用,可广泛适用于更多种类的水生经济动物养殖场景。
[0084] 虽然以上描述了本发明的具体实施方式,但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解,我们所描述的具体的实施例只是说明性的,而不是用于对本发明的范围的限定,熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化,都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。
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