石油烃降解菌及其菌群和应用专利检索-水废水污水或污泥的处理专利检索查询-专利查询网

石油烃降解菌及其菌群和应用
申请号	CN202410264434.6	申请日	2024-03-08	公开(公告)号	CN117987324A	公开(公告)日	2024-05-07
申请人	中国科学院沈阳应用生态研究所;			发明人	张颖; 李萍; 韩斯琴;
摘要	本发明属于石油污染修复技术领域，具体涉及一种石油烃降解菌群及其应用。石油烃降解菌为枯草芽孢杆菌OB(Bacillus subtilis)，该菌株已于2023年12月08日在中科院微生物研究所菌种保藏中心保藏，保藏编号为CGMCC No.28373。菌群为上述菌株和迪茨氏菌2‑3(Dietzia kunjamensis)；其中，迪茨氏菌2‑3(Dietzia kunjamensis)已于2023年12月08日在中科院微生物研究所菌种保藏中心保藏，保藏编号为CGMCC No.28374。本发明菌群从石油污染的土壤中分离获得，具有高效的石油降解能力，且两种菌种之间具有很好的协同作用。
权利要求	1.一种石油烃降解菌，其特征在于：石油烃降解菌为枯草芽孢杆菌OB(Bacillus subtilis)，该菌株已于2023年12月08日在中科院微生物研究所菌种保藏中心保藏，保藏编号为CGMCC No.28373。 2.一种权利要求1所述的石油烃降解菌的应用，其特征在于：所述菌株在降解石油烃中的应用。 3.一种石油烃降解菌群，其特征在于：权利要求1所述的菌株和迪茨氏菌2‑3(Dietzia kunjamensis)；其中，迪茨氏菌2‑3(Dietzia kunjamensis)已于2023年12月08日在中科院微生物研究所菌种保藏中心保藏，保藏编号为CGMCC No.28374。 4.一种石油烃降解菌剂，其特征在于：石油烃降解菌剂含权利要求1所述的菌株。 5.根据权利要求4所述的石油烃降解菌剂，其特征在于：所述菌剂含权利要求1所述的菌株和/或迪茨氏菌2‑3(Dietzia kunjamensis)；其中，迪茨氏菌2‑3(Dietzia kunjamensis)已于2023年12月08日在中科院微生物研究所菌种保藏中心保藏，保藏编号为CGMCC No.28374。 6.根据权利要求5所述的石油烃降解菌剂，其特征在于：所述石油烃降解菌剂含权利要求1所述的菌株和/或迪茨氏菌2‑3(Dietzia kunjamensis)的发酵培养物、发酵培养物悬液或发酵培养物分离液。 7.根据权利要求6所述的石油烃降解菌剂，其特征在于：所述权利要求1所述的菌株的培养物为将菌株于LB培养基中培养至对数期，即获得其发酵培养物；将发酵培养物分离收集固体经溶剂重悬即为发酵培养物悬液；将发酵培养物分离收集液体即为发酵培养物分离液；所述迪茨氏菌2‑3(Dietzia kunjamensis)为将菌株于TSB培养基中培养至对数期，即获得其发酵培养物；将发酵培养物分离收集固体经溶剂重悬即为发酵培养物悬液；将发酵培养物分离收集液体即为发酵培养物分离液。 8.根据权利要求4‑7任意一项所述的石油烃降解菌剂，其特征在于：所述菌剂为权利要求1所述的菌株和迪茨氏菌2‑3(Dietzia kunjamensis)时，待两菌株分别培养至对数生长期而后混合。 9.一种权利要求4所述的石油烃降解菌剂的应用，其特征在于：所述菌剂在石油烃降解中的应用。
说明书全文	石油烃降解菌及其菌群和应用技术领域 [0001] 本发明属于石油污染修复技术领域，具体涉及一种石油烃降解菌群及其应用。背景技术 [0002] 原油是由饱和烃、芳香烃、胶质和沥青质组成的一个多组分复杂混合物，在开采、提炼、储存和使用过程中，由于控制不当，原油会污染或水体，并随着土壤迁移或水体流动，最终影响人体健康。 [0003] 对于石油烃的降解方法有物理法、化学法和生物法等。相比于物理和化学方法修复技术，生物修复技术是修复石油污染土壤的环境友好型方法。 [0004] 目前，许多研究人员筛选分离出了具有降解原油的菌株，而原油是一个复杂混合物，无法使一株菌降解原油的所有组分，所以，亟需构建菌群来降解石油烃。发明内容 [0005] 本发明目的在于提供一种石油烃降解菌群及其应用。 [0006] 为实现上述目的，本发明采用技术方案为： [0007] 一种石油烃降解菌，石油烃降解菌为枯草芽孢杆菌OB(Bacillus subtilis)，该菌株已于2023年12月08日在中国微生物研究所菌种保藏中心保藏，保藏编号为CGMCC No.28373。 [0008] 一种所述的石油烃降解菌的应用，所述菌株在降解石油烃中的应用。 [0009] 一种石油烃降解菌群，所述的菌株和迪茨氏菌2‑3(Dietzia kunjamensis)；其中，迪茨氏菌2‑3(Dietzia kunjamensis)已于2023年12月08日在中国微生物研究所菌种保藏中心保藏，保藏编号为CGMCC No.28374。 [0010] 一种石油烃降解菌剂，石油烃降解菌剂含所述枯草芽孢杆菌OB(Bacillus subtilis)。 [0011] 所述菌剂含所述枯草芽孢杆菌OB(Bacillus subtilis)和/或迪茨氏菌2‑3(Dietzia kunjamensis)；其中，迪茨氏菌2‑3(Dietzia kunjamensis)已于2023年12月08日在中国微生物研究所菌种保藏中心保藏，保藏编号为CGMCC No.28374。 [0012] 所述石油烃降解菌剂含枯草芽孢杆菌OB(Bacillus subtilis)的菌株和/或迪茨氏菌2‑3(Dietzia kunjamensis)的发酵培养物、发酵培养物悬液或发酵培养物分离液。 [0013] 所述上述所述的菌株的培养物为将菌株于LB培养基中培养至对数期，即获得其发酵培养物；将发酵培养物分离收集固体经溶剂重悬即为发酵培养物悬液；将发酵培养物分离收集液体即为发酵培养物分离液； [0014] 所述迪茨氏菌2‑3(Dietzia kunjamensis)为将菌株于TSB培养基中培养至对数期(OD850值为2时)，即获得其发酵培养物；将发酵培养物分离收集固体经溶剂重悬即为发酵培养物悬液；将发酵培养物分离收集液体即为发酵培养物分离液。 [0015] 所述菌剂为上述枯草芽孢杆菌OB(Bacillus subtilis)和迪茨氏菌2‑3(Dietzia kunjamensis)时，待两菌株分别培养至对数生长期，即，草芽孢杆菌OB(Bacillus subtilis)OD850值为1.5，迪茨氏菌2‑3(Dietzia kunjamensis)OD850值为2时，草芽孢杆菌OB(Bacillus subtilis)与迪茨氏菌2‑3(Dietzia kunjamensis)按照体积比为4:1混合。 [0016] 一种所述的石油烃降解菌剂的应用，所述菌剂在石油烃降解中的应用。本发明与现有技术相比具有以下技术效果： [0017] 本发明得到的石油烃降解菌，通过16S序列分析，这两株菌株被鉴定为Bacillus subtilis(枯草芽孢杆菌)与Dietzia kunjamensis(迪茨氏菌)，并分别命名为OB和2‑3。保藏号分别为CGMCC No.28373和CGMCC No.28374。本发明中所使用的合成微生物组降解石油烃效率高，能利用石油烃作为唯一碳源生长繁殖，降解石油烃。在实验室条件下，石油烃初始含量1g/L，该合成微生物组在37℃、150rpm条件下培养2d，原油、饱和烃以及芳香烃组分降解率能分别达到98.3％、98.9％和97.3％。附图说明 [0018] 图1为本发明实施例提供的菌株OB和菌株2‑3的菌落形态图，其中，a为菌株OB，b为菌株2‑3。 [0019] 图2为本发明实施例提供的菌株OB和菌株2‑3的扫描电镜照片(SEM)其中，a为菌株OB，b为菌株2‑3。 [0020] 图3为本发明实施例提供的菌群在第2天降解总油、饱和烃和芳香烃结果，其中，a为单菌和菌群分别在第2天降解总油的结果，b为为单菌和菌群分别在第2天降解饱和烃和芳香烃的结果。具体实施方式 [0021] 以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。 [0022] 本发明所附图式所绘制的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解和阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，在任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容能涵盖的范围内。 [0023] 实施例1： [0024] 1)菌株筛选 [0025] 本实施例所用枯草芽孢杆菌OB与迪茨氏菌2‑3分别分离自新疆某油田长期受石油污染土壤，使用LB培养基和TSB培养基分别筛选枯草芽孢杆菌OB和迪茨氏菌2‑3[0026] 2)菌株16S鉴定 [0027] (1)基因组提取 [0028] 使用天根生化科技有限公司TIANamp Bacteria DNA Kit细菌基因组DNA提取试剂盒，按照说明书操作步骤提取菌株OB和2‑3的基因组DNA。 [0029] (2)PCR扩增 [0030] 16S通用引物为：27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 1492R：TACGGCTACCTTGTTACGACTT，PCR长度为1500bp左右。 [0031] PCR反应体系： [0032] [0033] PCR反应程序： [0034] 95℃预变性4min，94℃变形30s，55℃复性30s，72℃延伸40s，进行35个循环，72℃延伸7min，4℃直至终止。 [0035] (3)凝胶电泳 [0036] 最后将所得的PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳观察，电泳条件80V30min。将扩增成功的PCR产物送往华大基因科技有限公司测序，测序引物与扩增引物相同。得到菌株TU‑3的16S基因的核苷酸序列，菌株OB和2‑3的16S基因的核苷酸序列如下所示。 [0037] 菌株OB基因序列表 [0038] >OB [0039] CAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGA [0040] CAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAAC [0041] ACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGG [0042] GGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAG [0043] GTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAG [0044] TTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGA [0045] GAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTA [0046] CGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGAC [0047] GGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCT [0048] GTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGAC [0049] GGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCG [0050] GTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGG [0051] GCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAAC [0052] CGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAG [0053] AGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGA [0054] ACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGA [0055] GCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAC [0056] GCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGT [0057] GCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAA [0058] GACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAG [0059] CATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGA [0060] CATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAG [0061] TGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGG [0062] GTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATT [0063] CAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGA [0064] CAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTAT [0065] GACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCG [0066] AAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGAT [0067] CGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGC [0068] GGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCG [0069] CCCGTCACACCACGAGAGTTTGTACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACC [0070] TTTTAGGA [0071] 上述序列由1439碱基(bp)组成。所测得的16S基因序列在美国国立生物信息中心(NCBI)网站上进行BLAST搜索比对，得到相似度较高的菌株，分析结果表明，菌株OB被鉴定为枯草芽孢杆菌。所述菌株OB为枯草芽孢杆菌OB(Bacillus subtilis)，已于2023年7月22日保藏与中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.28373。 [0072] 菌株2‑3基因序列表 [0073] >2‑3 [0074] TGGTTACCTTTGTACGACTTCGTCCCAATCGCCGATCCCACCTTCGAC [0075] GGCTCCCTCCACAAGGGTTAGGCCACCGGCTTCGGGTGTTACCGACT [0076] TTCATGACGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCAC [0077] CGCAGCGTTGCTGATCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCATGGGG [0078] TCGAGTTGCAGACCCCAATCCGAACTGAGACCAGCTTTAAGGGATTC [0079] GCTCCACCTCGCGGTATCGCAGCCCTCTGTACTAGCCATTGTAGCATG [0080] TGTGAAGCCCTAGACATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCA [0081] CCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCAGTCTCTCACGAGTCCCCACCATTA [0082] CGTGCTGGCAACATGAGACAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAAC [0083] CCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTAT [0084] ACAAGCCACAAGGGAAACGACATCTCTGCCGTCGTCCTGTATATGTC [0085] AAGCCTAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCACATGCT [0086] CCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAGCCTTGC [0087] GGCCGTACTCCCCAGGCGGGGCGCTTAATGCGTTAGCTACGGCACGG [0088] AGTCCGTGGAAGGACCCCACACCTAGCGCCCACCGTTTACGGCATGG [0089] ACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGCTCCTCA [0090] GCGTCAGTTACTACCCAGAGACCCGCCTTCGCCACCGGTGTTCCTCCT [0091] GATATCTGCGCATTTCACCGCTACACCAGGAATTCCAGTCTCCCCTGT [0092] AGTACTCAAGTCTGCCCGTATCGCCTGCACGCCCCCGGTTAAGCCGA [0093] GGGATTTCACAGACGACGTGACAAACCGCCTACGAGCTCTTTACGCC [0094] CAGTAATTCCGGACAACGCTCGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCT [0095] GGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTGCAGGTACCGTCACTTGCGCT [0096] TCGTCCCTACTGAAAGGGGTTTACAATCCGAAGACCGT [0097] CATCCCCCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTTCGCCCATTGGCAAT [0098] ATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAATCCC [0099] AGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCGTCGCCTTGG [0100] TAGGCCATTACCCCACCAACAAGCTGATAGGCCGCGGGCTCATCCTG [0101] CACCGAAAAACTTTCCAACCCCCACCATGCGGCAGGAGTTCATATCC [0102] GGTATTAGACCCAGTTTCCCAGGCTTATCCCGAAGTGCAGGGCAGAT [0103] TACCCACGTGTTACTCACCCGTTCGCCACTCGTGTACCCCCGAAGGG [0104] GCCTTACCGTTCGACTTGCATGTGTTAAGCACGCCGCCAGCGTTCGTC [0105] CTGAGCCAGAATTCAAACTCTA [0106] 上述序列由1480碱基(bp)组成。所测得的16S基因序列在美国国立生物信息中心(NCBI)网站上进行BLAST搜索比对，得到相似度较高的菌株，分析结果表明，菌株2‑3被鉴定为迪茨氏菌。所述菌株2‑3为迪茨氏菌(Dietzia kunjamensis)，已于2023年7月22日保藏与中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.28374。 [0107] 实施例2适用于降解石油的合成微生物组制备 [0108] 将上述分离获得单菌株枯草芽孢杆菌和迪茨氏菌2‑3分别进行发酵培养： [0109] 枯草芽孢杆菌OB和迪茨氏菌2‑3发酵培养至对数期，即，草芽孢杆菌OB(Bacillus subtilis)OD850值为1.5，迪茨氏菌2‑3(Dietzia kunjamensis)OD850值为2。 [0110] 将上述获得不同菌株发酵培养液，按照枯草芽孢杆菌OB：迪茨氏菌2‑3＝4:1的体积比混合，混合均匀得到降解原油的合成微生物组。 [0111] 所使用的培养基配制方法如下： [0112] 1)LB培养基(g/L)：蛋白胨10g，酵母浸粉5g，NaCl 10g，蒸馏水l000mL，pH 7.0。 [0113] 2)LB固体培养基(g/L)：LB培养基，2％琼脂。 [0114] 3)TSB培养基(g/L)：胰酪胨17g，大豆木瓜蛋白酶水解物3g，磷酸氢二钾2.5g，氯化钠5g，葡萄糖2.5g。 [0115] 4)TSA培养基(g/L)：胰酪胨15g，大豆木瓜蛋白酶水解物5g，氯化钠5g，琼脂15g。 [0116] 实施例3：菌群对原油和四组分的降解效果验证 [0117] 将上述实施例2分别获得枯草芽孢杆菌OB发酵培养液、迪茨氏菌2‑3发酵培养液、合成微生物组(枯草芽孢杆菌OB OD595：迪茨氏菌2‑3OD595＝4:1(v:v))发酵培养液，以10wt％接种量，分别接至以1g/L石油烃为唯一碳源的无机盐培养基中，所用石油烃为新疆某油田原油，所用烷烃及芳烃均通过石油烃族组分分级方法分离自新疆某油田原油样品中，接种后的无机盐培养基在37℃条件下150rpm摇床培养2d，计算原油、烷烃及芳香烃降解率。计算公式如下： [0118] [0119] 所用含油无机盐培养基成分为(g/L)：10g原油,10g(NH4)2SO4,1.1g KCl,1.1g NaCl,1.97g Na2HPO4,0.22g KH2PO4,0.5g MgSO4.7H2O，和0.5mL微量元素液。微量元素液(g/L)：0.56g FeSO4,0.17g MnSO4,0.25g CuSO4,0.24g CaCl2和0.29g ZnSO4。 [0120] 结果表明，原油初始含量1g/L，该合成微生物组在37℃、150rpm条件下培养2天，原油降解率达到98.3％，显著高于单菌枯草芽孢杆菌OB(74.8％)和单菌迪茨氏菌2‑3(44.1％)；饱和烃降解率达到98.9％，显著高于单菌枯草芽孢杆菌OB(79.8％)和单菌迪茨氏菌2‑3(51.3％)；芳香烃降解率达到97.3％，显著高于单菌枯草芽孢杆菌OB(70.5％)和单菌迪茨氏菌2‑3(40.1％)。 [0121] 上列实施例，对本发明的目的、技术方案等进行了进一步地详细说明，所应说明的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。 [0122] 以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。 [0123] 另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。 [0124] 此外，本发公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所发明的。

意见反馈