[0001] 本发明属于节能环保产业中的中低品位铁矿和伴生矿综合开发利用技术领域，具体涉及一株极端嗜酸的铁硫氧化菌及其在生物浸矿中的应用。

[0002] 铁硫氧化菌广泛存在于酸性矿山或含铁或硫的酸性环境中，其主要特征是可以将二价铁离子氧化为三价铁离子，以及将元素硫及各种形式还原型的无机硫氧化为硫酸盐，同时利用该过程中释放的能量进行生长。铁硫氧化菌不仅在地球元素化学循环中起重要作用，而且还被广泛应用于生物浸矿、生物冶金、受污染环境修复等领域。

[0003] 目前已知的铁硫氧化菌多为化能自养性微生物，典型的铁硫氧化菌株Acidithiobacillus ferrooxidans为专性自养微生物，若是在一定有机物存在的情况下会抑制其生长。除此之外，在耐酸性方面，大多数嗜酸菌能耐受的pH在2‑4左右，不能耐受更极端的酸性条件。

[0004] 本发明的目的是提供一株极端嗜酸的铁硫氧化菌及其在生物浸矿中的应用，是从黄铁矿浸出菌群中分离纯化出的一株铁硫氧化菌，可用于生物浸矿。

[0005] 本发明首先提供一株铁硫氧化菌(Sulfobacillus thermotolerants)hq2株，其保藏编号为CGMCC No.26454，其于2023年1月12日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

[0006] 本发明所提供的铁硫氧化菌hq2株，其16S基因序列为SEQ ID NO:1。

[0007] 本发明所提供的铁硫氧化菌生长pH范围为1.0‑5.0。

[0008] 本发明所提供的铁硫氧化菌生长温度范围为30‑50℃。

[0009] 本发明提供的铁硫氧化菌可用于亚铁离子的氧化或硫元素的氧化。

[0010] 所述的亚铁离子，为污水中的亚铁离子。

[0011] 本发明所提供的铁硫氧化菌hq2株还可用于生物浸矿。

[0012] 本发明还提供一种生物浸矿的方法，是使用所筛选的铁硫氧化菌hq2株来作为生物浸矿菌来进行生物浸矿。

[0013] 本发明所提供的铁硫氧化菌，可以将Fe2+氧化为Fe3+，可以用于各种低品位矿物的浸出，以及其它重金属浸出。附图说明

[0014] 图1：铁硫氧化杆菌在固体平板上的形态照片图，

[0015] 图2：铁硫氧化菌基于16S rRNA序列的系统发育进化树图，

[0016] 图3：铁硫氧化菌电镜照片图，

[0017] 图4：铁硫氧化杆菌温度生长范围测定结果图，

[0018] 图5：铁硫氧化杆菌pH生长范围测定结果图，

[0019] 图6：铁硫氧化杆菌对Biolog GEN III MicroPlate不同碳源利用情况图。

[0020] 图7：铁硫氧化菌在极端条件下对亚铁离子的氧化能力图，其中A：ORP变化趋势，ORP越高表示对亚铁离子氧化效果越好。B：pH变化趋势。C：CFU/mL细菌数量变化。

[0021] 本发明从原始菌群5Biol中筛选出一株新的铁硫氧化杆菌菌株，该菌株可以在0.02％的酵母存在的条件下高效氧化亚铁，从而克服其它铁硫氧化杆菌在有机物存在的情况下会抑制生长的缺陷，并且可以在pH为1的条件下氧化高浓度的亚铁离子，是优良的浸矿微生物及环境微生物，具有广泛的应用价值。

[0022] 下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。

[0023] 实施例1：筛选目的菌株

[0024] 用于筛选目的菌株的5Biol菌群来自中国科学院天津工业生物技术研究所应用微生物生态工程实验室(AMEE)。

[0025] 本实施例中所使用的培养基及试剂信息如下：

[0026] (1)44.2g/L的FeSO4.7H2O母液：用稀硫酸溶液配置为10倍母液，终pH调至1.2后，使用0.22μm的滤膜过滤添加至灭好菌的9K培养基中，添加量10mL/100mL。

[0027] (2)0.02％Yeast母液：用纯水配好浓度为100倍母液后，121℃灭菌备用，添加量1mL/100mL。

[0028] (3)硫粉10/L：称好的硫粉用锡纸包裹，在105℃下干热灭菌24h待用。

[0029] (4)9K培养基具体配方如下：(NH4)2SO4 3g，KCI 0.1g，MgSO4.7H2O 0.5g，K2HPO4 0.5g，Ca(NO3)2 0.01g，调节pH至2.0，定容至1L，121℃灭菌20min。

[0030] (5)9K‑Fe‑Yeast液体培养基：灭好菌的9K培养基，在无菌条件下加入除菌后的FeSO4.7H2O母液，加入灭好菌的Yeast母液。

[0031] (6)9K‑S‑yeast液体培养基：灭好菌的9K培养基，在无菌条件下加入干热灭菌的硫粉，加入灭好菌的Yeast母液。

[0032] (7)9K‑Fe‑S‑Yeast固体培养基：

[0033] A液：9K基本盐培养液250mL+琼脂15.0g，调节pH至7.0；

[0034] B液：9K基本盐培养液750mL，调节pH至2.0；

[0035] 硫粉10/L：称好的硫粉用锡纸包裹，在105℃下干热灭菌24h。

[0036] 将A液和B液在121℃灭菌20min；待A液和B液冷却至80℃时，将其混合，并加入灭好菌的硫粉，倒入培养皿冷却。FeSO4.7H2O经过0.22um滤膜过滤后除菌后，均匀涂在平板上。

[0037] (8)PBS缓冲液：8.0g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4，0.24g KH2PO4定容至1L，调节pH至7.4，灭菌备用。

[0038] 将来自腾冲热泉与河北矿山的土样混合用黄铁矿富集后，获得具浸矿功能的原始5Biol菌群。将该菌群在黄铁矿中连续传代驯化十代后，获得驯化后的5Biol菌群，测序结果表明菌群组成为Acidithiobacullus  thiooxidans占97％，Sulfobacillus 
thermotolerans占3％。随后对驯化后5Biol菌群进行单独添加铁硫，及同时添加铁硫的分化培养，在同时含有铁硫的培养基中Sulfobacillus菌株的比例上升到27％。

[0039] 将在同时含有铁硫的培养基中分化培养后的5Biol菌液通过划线的方式接种到9K‑Fe‑S‑Yeast固体培养基上，在37℃条件下培养20天左右，平板上出现单菌落，挑取单菌落在液体培养基中培养鉴定，获得一株菌株hq2。菌株在固体平板上的形态如图1，其菌落形态呈现圆形，边缘光滑，颜色为深黄色。

[0040] 将筛选的hq2菌株接种于9K‑S‑Yeast液体培养基中，置于37℃摇床，180rpm培养4‑5天。收集指数期菌液10mL，10000rpm离心15min，用PBS清洗菌体后，用PowerSoil DAN Isolationkit(MOBIO)土壤试剂盒进行DNA的提取。提取到的DNA用NanoDrop2000和1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳分析其浓度和完整性，后使用细菌通用引物27F和1492R进行16sRNA基因的扩增，hq2菌株的16S rRNA序列如下：

[0041] TGTTCGTCAAGTTGTTTCAGAACAGCACTTGTTAGATGCCAAGACGTTAGATGAAGCATTAGACCTTGAACGGATAACCAAACCTCAAGAACCCTGAAGCGGTTACGGTGAGGCTGTATGACGTGACCTCAGACGCAAGGCGATCAAATAGCCTAGCGCTCGCCCATATTTTGTTGAATACTGGGCAACTGGCGCTCATCGCGGAGCTCGCGGCCCATTAGCTAGTTGGGGGGGTAACGGCCTCCCAAGGCGACGATGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGAACGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGACGGCCTTCGGGTTGTAAAGCTCTGTCTGTCGGGACGAAGACCGGGACGGGAGTCCCGGGGAGCCGGTACCGACGAAGGAAGCCCCTGCAAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAAGACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGCGTGTAGGCGGTGCGATACGTAGCGGTTTTAAGCCTCCGGCTCACCCGGAGGAGGGCGGCTAAACGGTCGCACTGGAGGGCAGGAGAGGTGCGTGGAATTCCTGGTGGAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCAGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCGCACTGGCCTGACCCTGACGCTGAGGCGCGACAGCGTGGGGAGCAAACGGGATTAGATACCCCGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGATACTAGGTGTCGTGGGGGTCCACCCTGCGGTGCCGGAGCTAACGCACTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGACGCAACGCGCAGAACCTTACCAGGACTGGACAGGCACGTGAGCGCCGCGAAAGCGGCGGGCCCTTCGGGGAGCGTGCTCAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCGTGTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGCACTCACACGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCCGCATGGCCTTGATGTCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCCCGACAACGGGCCGCGACCGCGCGAGCGGGAGCGAATCCTTCAAACGGGATCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATTGCTAGTAATCGCCCATCAGCATGGGGCGGTGAATTCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTGGCCACACCCGAAGCCGGTCGGCCGAACCCGTGAGGGACGGTCCCGTCGACGGTGGGGCGGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCT(SEQ ID NO:1)。

[0042] 16S rRNA基因鉴定结果显示该菌株与Sulfobacillus thermotolerans Kr1菌株的序列相似性最大99％(图2)。将该菌株命名为铁硫氧化菌(Sulfobacillus thermotolerants)hq2株，于2023年1月12日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.26454。

[0043] 实施例2：菌株hq2株的理化性质

[0044] 1、菌株形态特征

[0045] 使用扫描电子显微镜(Hitachi SU8010,Japan)对筛选到的酸性硫杆菌进行形态学观察。菌株在初始pH为2.0的9K‑S‑Yeast液体培养基中于37℃需氧生长，培养至指数生长中期，选取一定量稳定期的细菌培养液，10000rpm，离心15min收集菌体。先用0.25N的稀硫酸洗2遍。再用PBS缓冲液或生理盐水清洗3次以上，去除培养基中的杂质。样品在被观察之前进行细胞固定(2.5％戊二醛浸泡并将细胞悬浮于固定剂中，4℃冰箱固定过夜。缓冲液清洗3次，每次浸泡10min，以便去除戊二醛对后续步骤的影响。离心富集后加入1％锇酸没过细胞即可，将细胞悬浮固定1h。之后用缓冲液清洗3次，每次10min。)、梯度脱水(逐步用30％、50％、75％、95％、100％、100％乙醇梯度脱水，每次15min。)、临界点干燥(利用临界点干燥仪，Leica EM CPD030,Germany，将细胞中的乙醇置换为液态CO2，再经液态CO2的气化过程，将CO2气体排出，得到干燥的样品)、镀膜(利用离子溅射仪，Hitachi E‑1045,Japan，将铂(Pt)均匀覆盖在样品表面，以增加生物样品的导电性)和观察(扫描电子显微镜，Hitachi SU8010,Japan，对筛选到的酸性硫杆菌进行形态学观察)。扫描电子显微镜结果表明，该菌株的大小约为0.6×3.8‑3.0μm，呈短杆状(图3)。

[0046] 2、最适生长温度及pH测定

[0047] 将分离到的菌株以10％比例离心接种，接入9K‑S‑Yeast液体培养基，然后分别置于20℃、30℃、37℃、42℃、50℃、55℃、60℃温度下培养，初始pH为2.0，180r/min振荡培养，每两天测量OD600值以评估细胞生长，得到生长温度范围。

[0048] 使用不同的初始pH 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，在37℃温度下，180r/min振荡培养，每天取样测量OD600以评估细胞生长，得到菌株适宜生长pH范围。

[0049] 试验结果显示，该菌株能够在30℃‑50℃的温度范围内生长，最佳生长温度为37℃和42℃(图4)，且37℃生长时稳定期较长。

[0050] 对于菌株最适生长pH，该菌株能够在pH 1.0‑5.0的范围内生长。最适pH为2.0。当pH从2.0到1.0，再到0.5时菌株生长状态逐渐受到抑制，并在pH为0.5时失去生长能力。当pH到6.0时菌株生长被完全抑制(图5)。

[0051] 3、筛选菌株对不同碳源的利用情况

[0052] 使用Biolog GEN III MicroPlate测试该菌株在不同碳源上生长的能力，该测试板所包含的碳源如表1所示。在检测前，不同碳源或其他化学物质都被预先填充在GEN III MicroPlate中。将培养好的纯培养物，在10000rpm离心15min收获细胞后，用不含碳源的无机盐培养基清洗三遍，后接种于IF‑C接种液中，将浊度调至90–98％，制备为接种液。然后将100μL接种液接种到GEN III MicroPlate的每个孔中。将孔板置于37℃下孵育240小时，随后使用Biolog的GEN IIIOmniLog II combo plus kinetic软件(Biolog，United States)进行数据读取(表1)，及图谱的生成(图6)。在底物利用的情况下，染料还原产生的颜色强度的照片测量值以OmniLog单位(OU)表示。表1中对阳性、阴性及边界值的界定为仪器给出的结果。

[0053] Biolog GEN III Microplate碳源实验结果表明，该菌株对72个碳源中的5个碳源显示为阳性结果，D‑果糖、D‑果糖‑6‑磷酸、葡糖醛酰胺、α‑酮‑戊二酸、乙酰乙酸。对24个碳源显示为边界值(即可能具备利用该物质生长的能力)，D‑麦芽糖、D‑海藻糖、D‑纤维二糖、龙胆二糖、蔗糖、D‑松二糖、水苏糖、α‑D‑乳糖、α‑D‑葡糖、D‑甘露糖、D‑半乳糖、3‑甲酰葡糖、D‑岩藻糖、L‑岩藻糖、L‑鼠李糖、D‑甘露醇、D‑葡糖‑6‑磷酸、L‑组胺、D‑半乳糖醛酸、L‑半乳糖醛酸内酯、D‑葡糖醛酸、柠檬酸、α‑酮‑丁酸、乙酸。

[0054] 表1：Biolog GEN III Microplate中各孔位对应的碳源名称、相应的Biolog值及默认分类。

[0055]

[0056]

[0057]

[0058] 4、筛选菌株对其他物质的利用能力测试

[0059] 在9K基本盐培养液中分别加入表2所示能源物质，将铁硫氧化菌hq2株离心以10％比例接种，每间隔3天取样检测样品在OD600处吸光值，通过监测菌株的生长来评估菌株对不同能源的利用情况(表2)。结果显示，筛选到的铁硫氧化菌hq2株对葡萄糖、蔗糖、甘露糖、海藻糖、苹果酸等基本无利用能力。在没有酵母存在的情况下，不能利用亚铁离子或硫元素进行自养生长，在微量酵母存在的情况下可以氧化铁硫。

[0060] 表2：菌株hq2对其他物质的利用情况表

[0061]

[0062] 实施例3：筛选菌株hq2在极端pH下对不同浓度铁利用情况

[0063] 在实验过程中发现筛选到的菌株在pH为1的条件下依然具有较好的活性，并且在微量有机物的存在下，可以在极低pH和高亚铁离子浓度的条件下高效氧化亚铁离子。这种生理性质，对于其在富含铁硫的、有机物贫乏的极端pH环境下，或者无机矿物环境下的生长极其重要，也使其在各种低品位矿物(例如黄铁矿)的浸出中具有一定优势。因为亚铁和硫是许多自然和人造极端酸性环境中的主要可用性能源。而硫元素在各种微生物的利用下，其最终产物为成硫酸盐，这必然会带来pH的持续降低。同时各种较高浓度的亚铁及铁离子也会对细胞生长造成一定胁迫。故能耐受低pH及高浓度亚铁/铁，使其在极端环境中的应用价值大大提高。

[0064] 本实施例中所使用的培养基及试剂信息如下：

[0065] 1)11.05g/L、22.1g/L、44.2g/L的FeSO4.7H2O母液：用稀硫酸溶液配置为10倍母液，终pH调至1.2后，使用0.22μm的滤膜过滤添加至灭好菌的9K培养基中，添加量10mL/100mL。

[0066] 2)0.02％Yeast母液：用纯水配好浓度为100倍母液后，121℃灭菌备用，添加量1mL/100mL。

[0067] 3)9K培养基具体配方如下：(NH4)2SO4 3g、KCI 0.1g、MgSO4.7H2O 0.5g、K2HPO4 0.5g、Ca(NO3)2 0.01g，使用硫酸将pH调至1.0，定容至900mL，121℃灭菌20min。

[0068] 具体实验步骤如下：

[0069] 在pH为1.0的9K培养基中，按照1mL/100mL的比例，单独添加已经灭菌的0.02％的Yeast母液。按照10mL/100mL的比例，单独添加已经过过滤除菌的不同浓度的FeSO4.7H2O母液。

[0070] 按照30％的接种比例，离心收集筛选菌株hq2指数期的菌体，使用pH为1.0的9K培养基清洗3遍，接种于准备好的培养基中。培养温度37℃，摇床180r/min。培养过程中每两2+ 2+
天，取样检测其pH、ORP、及细胞数量的变化。其中ORP用于表示Fe 被氧化的程度，当Fe 被
3+
氧化为Fe 并在培养体系中不断积累，会导致体系中氧化性增强，导致氧化还原电位ORP的
2+
升高。当ORP从300左右升高到600左右时表示体系中Fe 已被大量氧化。其次细胞数量的检测使用显微镜直接计数法。实验结果如图7所示。可以看出，筛选菌株在pH为1.0时，对不同
2+
浓度的Fe 均有较强的氧化能力。且在2天之类，对11.05g/L到44.2g/L的FeSO4.7H2O中所含
2+ 7 8
Fe 离子的氧化率均达90％以上。由图7C可看出，细胞的数量也从10增加到10 ，这说明筛选菌株在1.0的极端pH下，依然具有较好的生长情况，且对高浓度亚铁离子表现出优秀的氧化效率。

[0071] 除此之外，目前已经报道的Sulfobacillus属的菌株，包括Sulfobacillus thermotolerans Kr1，S.thermosulfidooxidans VKM B‑1269，S.acidophilus NAL，以及S.sibiricus N1菌株，均不能在pH为1.0时生长。且与筛选菌株hq2亲缘关系最近的菌株
2+
Sulfobacillus thermotolerans Kr1，也没有pH为1.0时对高浓度Fe 氧化能力的报道。且相关报道中用于Kr1菌株培养的FeSO4.7H2O浓度只有9.82g/L(表3)。

[0072] 表3：筛选菌株hq2与Sulfobacillus thermotolerans Kr1菌株生长特性比较

[0073]

[0074]

[0075] 而本发明所筛选的菌株不仅具有更宽泛的生长pH，更高浓度的Fe2+和Fe3+的耐受2+
能力，而且还能在极低pH的条件下，高效氧化高浓度Fe ，是良好的资源浸矿微生物菌种。