一株锑还原功能兼性厌氧属间芽孢杆菌及其应用 |
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| 申请号 | CN202410012070.2 | 申请日 | 2024-01-02 | 公开(公告)号 | CN117987301A | 公开(公告)日 | 2024-05-07 |
| 申请人 | 广东省科学院生态环境与土壤研究所; | 发明人 | 陈冠虹; 方利平; 李芳柏; | ||||
| 摘要 | 本 发明 属于 微 生物 技术领域，公开了一株锑还原功能兼性厌 氧 属间芽孢杆菌及其应用，具体公开了一株属间芽孢杆菌，保藏名称为Mesobacillus jeotgali PS1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：64031，保藏日期为2023年11月17日。本发明首次公开了属间芽孢杆菌PS1在还原锑中的作用，具体的，通过实验证明，本发明提供的属间芽孢杆菌PS1在以乳酸钠和Sb(V)分别为 电子 供体和受体条件下生长，培养72h后溶液中锑去除率可达到64％，并生成方锑矿沉淀。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一株属间芽孢杆菌，保藏名称为Mesobacillus jeotgali PS1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：64031，保藏日期为2023年11月17日。 |
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| 说明书全文 | 一株锑还原功能兼性厌氧属间芽孢杆菌及其应用技术领域背景技术[0002] 锑(Antimony，Sb)是岩石圈中广泛分布的一种有毒类金属，其开采量在金属矿产资源中位列第9。锑硫化矿开采、冶炼和电子材料制造等生产活动使得锑的环境污染成为全球性问题，其中稻田土壤锑污染由于可能会引起稻米中锑累积从而带来健康风险受到广泛关注。锑在环境中主要以Sb(III)和Sb(V)价态存在，在近中性pH条件下Sb(III)相比Sb(V)更容易吸附在铁矿物上，所以Sb(V)在土壤‑水稻体系具有较高的迁移性。虽然Sb(III)相比Sb(V)毒性较大，但Sb(III)(即Sb(OH)3)容易在中性pH条件下形成三氧化二锑(Sb2O3)沉淀，所以锑还原有利于锑成矿进而促进锑的吸附固定，被认为是锑污染修复的一种重要策略。微生物是土壤锑还原的重要驱动者，利用微生物进行锑还原并开发其强化技术对土壤锑污染控制具有重要意义。 [0003] 相比严格厌氧锑还原菌，例如Desulfuribacillus stibiiarsenatis MLFW‑2T、Desulfovibrio vulgaris，兼性厌氧锑还原细菌能够耐受氧气的存在，在溶解氧变化或其他电子受体存在的环境中更具有生存竞争力，并具备锑污染修复应用潜力。目前只有几株兼性厌氧锑还原菌被分离和验证其功能，例如Dechloromonas sp.AR‑2和Propionivibriosp.AR‑3。尽管兼性厌氧锑还原菌具有环境适应性和成本经济性的优势，但该菌种资源有限，且其锑还原过程及调控策略尚不明确，限制了该功能菌在锑污染修复中的应用。 [0004] 电子穿梭体存在会调节微生物胞外呼吸，从而影响微生物金属转化反应。蒽醌‑2，6‑二磺酸二钠(AQDS，disodium anthraquinone‑2,6‑disulfonate)是腐殖质的类似物，能有效促进多种重金属的微生物胞外还原，对土壤锑还原菌群的锑还原效率有促进作用。黄素类电子穿梭体(包括核黄素RF和黄素单核苷酸FMN)可由微生物细胞分泌，作为氧化还原辅因子与外膜细胞色素C(例如MR‑1外膜Mtr蛋白)结合，促进胞外呼吸菌的电流产生。外源黄素(特别是FMN)能增加DvH的锑还原效率，表明黄素在微生物胞外聚合物介导锑还原过程中可能发挥重要作用。然而，电子穿梭体对微生物锑还原效率的调控作用及应用可行性仍是技术难点。 发明内容[0005] 本发明第一方面的目的，在于提供一株属间芽孢杆菌。 [0006] 本发明第二方面的目的，在于提供一种芽孢杆菌菌剂。 [0007] 本发明第三方面的目的，在于提供本发明第一方面的属间芽孢杆菌和/或本发明第二方面的芽孢杆菌菌剂的应用。 [0008] 本发明第四方面的目的，在于提供一种产品。 [0009] 本发明第五方面的目的，在于提供一种还原锑的方法。 [0010] 本发明第六方面的目的，在于提供一种锑污染修复方法。 [0011] 为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是： [0012] 本发明的第一个方面，提供一株属间芽孢杆菌，保藏名称为Mesobacillus jeotgali PS1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：64031，保藏日期为2023年11月17日。 [0013] 本发明的第二个方面，提供一种芽孢杆菌菌剂，包括本发明第一方面的属间芽孢杆菌、本发明第一方面的属间芽孢杆菌的发酵培养物、本发明第一方面的属间芽孢杆菌的芽孢、本发明第一方面的属间芽孢杆菌的发酵上清液中的至少一种。 [0014] 上述菌剂的活性成分可为上述属间芽孢杆菌、上述属间芽孢杆菌的培养物(如发酵产物)和/或上述属间芽孢杆菌的芽孢，上述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌剂的其他活性成分本领域技术人员可根据菌剂的效果确定。 [0015] 术语“培养物”是指经人工接种和培养后，长有微生物群体的液体或固体产物(培养容器内的所有物质，发酵产物)的统称。即通过将微生物进行生长和/或扩增而获得的产物，其可以是微生物的生物学纯培养物，也可以含有一定量的培养基、代谢物或培养过程中产生的其他成分。 [0016] 在本发明一些实施方式中，所述菌剂除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为领域(如微生物、农业)内常用的且在生物学上是惰性的载体。所述载体可为固体载体或液体载体；所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇；所述液体载体可为有机溶剂或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。 [0017] 在本发明一些实施方式中，所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。 [0019] 本发明的第三个方面，提供本发明第一方面的属间芽孢杆菌和/或本发明第二方面的芽孢杆菌菌剂在(1)～(8)中任一项中的应用： [0021] (2)制备用于原位钝化锑的产品； [0022] (3)锑的去除； [0023] (4)制备用于去除锑的产品； [0024] (5)锑的还原； [0025] (6)制备用于还原锑的产品； [0026] (7)锑污染修复； [0027] (8)制备锑污染修复的产品。 [0028] 在本发明一些实施方式中，所述锑为五价锑Sb(V)。 [0029] 本发明的第四个方面，提供一种产品，包括本发明第一方面的属间芽孢杆菌和/或本发明第二方面的芽孢杆菌菌剂。 [0030] 在本发明一些实施方式中，所述产品还包括电子穿梭体。 [0031] 在本发明一些实施方式中，所述电子穿梭体包括蒽醌‑2，6‑二磺酸二钠(AQDS)、蒽醌‑2‑磺酸钠(AQS)、黄素单核苷酸(FMN)或核黄素(RF)中至少一种。 [0032] 在本发明一些实施方式中，所述产品包括试剂、制剂或药物。 [0033] 在本发明一些实施方式中，所述产品具有如下至少一种功能： [0034] 1)锑的原位钝化； [0035] 2)锑的去除； [0036] 3)锑的还原； [0037] 4)锑污染修复。 [0038] 在本发明一些实施方式中，所述锑为五价锑Sb(V)。 [0039] 本发明的第五个方面，提供一种还原锑的方法，包括使用本发明第一方面的属间芽孢杆菌、本发明第二方面的芽孢杆菌菌剂或本发明第三方面的产品处理样品的步骤。 [0040] 在本发明一些实施方式中，所述锑为五价锑Sb(V)。 [0041] 在本发明一些实施方式中，所述方法包括：利用本发明第一方面的属间芽孢杆菌、本发明第二方面的芽孢杆菌菌剂或本发明第三方面的产品对锑进行还原得到Sb(III)。 [0042] 在本发明一些实施方式中，所述Sb(III)为三氧化二锑(Sb2O3)。 [0043] 在本发明一些实施方式中，所述样品包括锑污染的土壤、水、植物、矿石以及五价锑Sb(V)。 [0044] 在本发明一些实施方式中，通过施用、润湿、淋湿、雾化、细雨、喷涂、喷雾、浸泡使所述属间芽孢杆菌、所述芽孢杆菌菌剂或产品处理样品。 [0045] 在本发明一些实施方式中，当采用浸泡的方式处理样品时，所述属间芽孢杆菌的菌液的OD值为0.01～1。 [0046] 本发明的第六个方面，提供一种锑污染修复方法，包括使用本发明第一方面的属间芽孢杆菌、本发明第二方面的芽孢杆菌菌剂或本发明第三方面的产品处理锑污染物，所述锑为五价锑Sb(V)。 [0047] 在本发明一些实施方式中，通过施用、润湿、淋湿、雾化、细雨、喷涂、喷雾、浸泡使所述属间芽孢杆菌、所述芽孢杆菌菌剂或产品处理锑污染物。 [0048] 本发明的有益效果是： [0049] 本发明首次公开了属间芽孢杆菌PS1在还原锑中的作用，具体的，通过实验证明，本发明提供的属间芽孢杆菌PS1在以乳酸钠和Sb(V)为电子供体供受体条件下生长，培养72h后溶液中锑去除率可达到64％，并生成方锑矿沉淀。当添加电子穿梭体AQDS和FMN时，还可促进属间芽孢杆菌的锑还原和乳酸消耗速率，24h内相比生物对照处理分别增加4.6和 3.7倍，即外源添加电子穿梭体AQDS和FMN能促进PS1的锑还原速率。该属间芽孢杆菌PS1和电子穿梭体组配可有效用于水体中锑的原位钝化和去除，可为毒害锑污染土壤、水、矿石、植物的生态修复工程提供新的菌株资源及参考。 附图说明 [0050] 图1为图1为锑还原功能兼性厌氧属间芽孢杆菌PS1在NA营养琼脂培养基上生长的菌落形态(A)、对数期菌体扫描电镜图(B)和透射电镜图(C)。 [0051] 图2为锑还原功能兼性厌氧属间芽孢杆菌PS1的16S rRNA基因系统发育树。 [0052] 图3为锑还原功能兼性厌氧属间芽孢杆菌PS1在不同电子穿梭体条件下的锑还原效率和乳酸消耗效果；其中，(A)为不同处理组的Sb(V)的消耗情况，(B)为不同处理组的Sb(III)生成情况，(C)为有机碳底物乳酸浓度随时间的变化结果。 [0053] 图4为锑还原功能兼性厌氧属间芽孢杆菌PS1在不同电子穿梭体条件下的矿物X射线衍射晶相结果。 [0054] 图5为锑还原功能兼性厌氧属间芽孢杆菌PS1在不同电子穿梭体条件下的矿物扫描电镜形貌和表面元素组成。 [0055] 图6为锑还原功能兼性厌氧属间芽孢杆菌PS1在不同电子穿梭体条件下的蛋白量变化。 具体实施方式[0056] 以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细地说明。 [0057] 应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。 [0058] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。 [0059] 以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。 [0060] 实施例1锑还原功能兼性厌氧属间芽孢杆菌PS1的分离鉴定和生理生化特征[0061] 样品采集自广西某地锑污染稻田土壤，以该土壤为接种物首先进行锑还原功能菌群富集培养。称取1g新鲜土壤至无机盐培养基中，培养基组分包括(/L)：1.9g NaHCO3、0.2g KH2PO4、0.25g H4Cl、0.856g MgCl2·6H2O、0.5g KCl、1g NaCl、0.1g CaCl2、1g酵母提取物、1mL SL‑10微量元素溶液和1mL维生素溶液。其中SL‑10微量元素溶液组分包括(/L)：3.0g MgSO4、0.5g MnSO4、1g NaCl、0.1g FeSO4、0.1g CaCl2、0.1gCoCl2、0.13g ZnCl2、0.01g CuSO4、0.01g AlK(SO4)2、0.01g H3BO3、0.025g Na2MoO4、0.024g NiCl2、0.025g Na2WO4。维生素溶液组分包括(/L)：0.01g生物素、0.01g硫辛酸、0.05g核黄素、0.1g泛酸钙、0.1g吡哆醇盐酸盐、0.03g叶酸、0.05g烟酸、0.01g硫胺素和0.05g氰钴胺。培养基用CO2:N2混合气除氧 30min后，121℃湿热灭菌20min。电子供受体终浓度分别为6mM乳酸钠和2mM Sb(V)，经0.22μm无菌滤头过滤除菌后加入培养基。接种后培养物于30℃培养箱中静置培养，72h后培养物出现白色沉淀，取液体样品，经0.22μm滤头过滤后，用原子荧光形态分析仪(Prin‑Cen，ELSPE，China)配置阴离子交换柱测定Sb(V)和Sb(III)浓度。以10％接种量进行每隔72h的锑还原传代培养，获得去除土壤矿物颗粒的锑还原富集菌群。 [0062] 利用Hungate滚管技术分离锑还原菌，将上述锑还原富集菌群在新鲜培养基中进‑1 ‑2 ‑3 ‑4 ‑5 ‑6 ‑7 ‑4 ‑5行梯度稀释后，设置梯度为10 、10 、10 、10 、10 、10 、10 ，分别取约100μL 10 、10 、‑6 ‑7 10 、10 稀释液接种于含1.2％琼脂培养基的Hungate管中进行滚管。培养3d后，在厌氧手套箱中挑取单个菌落并转移到新的含2mM Sb(V)培养基中培养3天，然后测定溶液中锑形态。确认和挑选有Sb(III)生成的培养菌液，再经过三次滚管和筛选单菌落后，获得具有锑还原功能的纯菌株PS1。 [0063] 对纯菌株PS1的形态特征、生理生化特征进行分析，具体如下：菌株PS1为革兰氏染色不定杆菌，有椭圆形芽孢，中生或偏端生。如图1中的A所示，在(NA营养琼脂)平板上30℃培养3天，菌落圆形，凸起，边缘不整齐，淡橙黄色。利用扫描电镜(SEM，图1中的B)对戊二醛固定后的细胞进行形貌观察，显示该菌株整体呈短杆状，菌体末端钝圆；利用透射电镜(TEM，图1中的C)对树脂包埋后细胞‑矿物沉淀进行表征，结果显示菌株PS1具有单层细胞膜，形成的矿物分布于细胞外，对细胞完整度无影响。菌株的生理生化结果显示，菌株PS1可厌氧生长，具有硝酸盐还原能力；能利用葡萄糖、果糖、麦芽糖和纤维二糖产酸，但不能用甘露醇、肌醇、山梨醇、鼠李糖、蔗糖、蜜二糖和阿拉伯糖产酸；菌株具有接触酶活性，而氧化酶、VP试验和吲哚呈阴性，无脲酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶和β‑半乳糖苷酶(ONPG)活性；能使明胶液化，水解七叶灵和淀粉，但不能水解酪蛋白。 [0064] 实施例2锑还原功能兼性厌氧属间芽孢杆菌PS1的基因组分析 [0065] 利用细菌DNA提取试剂盒(DNeasy Blood&Tissue Kit，Qiagen，Valencia，CA)对菌株PS1的基因组DNA进行提取，通过三代测序和二代测序校正的方法对其全基因组进行测序。将测序获得的该菌株16S rRNA基因序列(SEQ ID NO:1)，并在Blast中与Genbank已登录的序列进行核苷酸同源性比较。 [0066] 结果表明该菌株PS1的16S rRNA基因序列与Mesobacillus jeotgali(咸海鲜属间芽杆菌)的同源性达99.78％。 [0067] 将菌株PS1和其他Mesobacillus属模式菌株的16S rRNA序列，在MEGA软件中利用MUSCLE算法进行序列的多重比对，通过删除和对齐比对后的序列，利用邻接法构建系统发育树。 [0068] 从图2的系统发育树结构可以看出，菌株PS1与Mesobacillus jeotgali YKJ‑10和Mesobacillus boroniphilus JCM 21738具有相近的系统发育关系，而与Cytobacillus horneckiae DSM 23495发育关系较远。 [0069] 综上，菌株PS1鉴定为属间芽孢杆菌，命名为属间芽孢杆菌(Mesobacillus jeotgali)PS1，该菌株于2023年11月17日保藏于广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No:64031，分类号为Mesobacillus jeotgali。 [0070] 测序得到的菌株PS1的16S rRNA基因长为1391bp，序列如下： [0071] GCGGATCTTCATTAGCTTGCTTTTGAAGATCAGCGGCGGACGGGTGAGTAACA [0072] CGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGGAGCTAATACC [0073] GGATAATCCTTTCCCTCACATGAGGGAAAGCTGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTT [0074] ACAGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCA [0075] ACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGG [0076] CCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCT [0077] GACGGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAGTTCTGTTGT [0078] CAGGGAAGAACAAGTACCGGAGTAACTGCCGGTACCTTGACGGTACCTGACCAGA [0079] AAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTT [0080] GTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTCCTTAAGTCTGATGTGAA [0081] AGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGA [0082] AGAGGAGAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAA [0083] CACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGC [0084] GTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTG [0085] CTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCAAACGCATTAAGCACTCC [0086] GCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGC [0087] ACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGT [0088] CTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCGTTCCCCTTCGGGGGACAGAGT [0089] GACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCC [0090] GCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGT [0091] GACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCC [0092] TTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGAACAAAGGGTCGCGAAGCC [0093] GCGAGGTCGAGCCAATCCCATAAATCCATTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACT [0094] CGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATA [0095] CGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCG [0096] AAGTCGGTGGGGTAAC(SEQ ID NO:1)。 [0097] 实施例3锑还原功能兼性厌氧属间芽孢杆菌PS1在不同电子穿梭体条件下的锑还原效率和乳酸消耗 [0098] 为了考察属间芽孢杆菌PS1对锑还原和乳酸消耗效率及不同电子穿梭体的调控作用，将属间芽孢杆菌PS1种子液接种于含6mM乳酸钠和2mM Sb(V)的300mL无机盐培养基中进行扩繁(起始OD为0.01)，于30±1℃静置培养24h至对数期中期，5000g离心10min收集对数期菌体，用新鲜培养基清洗菌体三次后，将菌液分别接种至Sb、Sb+AQDS(蒽醌2,6二磺酸)和Sb+FMN(核黄素‑5‑磷酸)处理中，起始OD为0.01，电子穿梭体浓度为50μM。利用121℃湿热灭菌20min的菌体PS1作为非生物对照。在培养第0.5、12、24、36、48和72h，取液体样品，经0.22μm滤头过滤后，用原子荧光形态分析仪测定Sb(V)和Sb(III)浓度，并用高效液相色谱(HPLC，Agilent 1260，USA)配置Sepax HP‑C18色谱柱测定样品中乳酸浓度。 [0099] 结果显示，如图3中A所示，非生物对照处理中Sb(V)在培养期内浓度无明显变化，活性菌株PS1处理中Sb(V)浓度随时间增加而降低，24h时的Sb(V)转化率为44.7％，反应速率为0.025/h。AQDS和FMN添加处理中Sb(V)转化速度加快，24h内反应速率分别为0.115/h和0.092/h，相比生物对照处理分别增加4.6和3.7倍。36h后Sb、Sb+AQDS和Sb+FMN处理中Sb(V)转化率分别为92％、93％和86％，并趋于稳定。Sb(III)浓度结果显示灭菌细胞处理中没有Sb(III)生成，而活性菌株PS1处理中Sb(III)在36h内随时间推移而累积(图3中B)。AQDS和FMN添加加速了Sb(III)生成，在36h时浓度达最高，浓度分别为1.85mM和1.68mM，较高于无电子穿梭体处理中的Sb(III)浓度(1.66mM)。培养36h后，各处理中Sb(III)浓度随时间而降低。72h时，Sb、Sb+AQDS和Sb+FMN处理中可溶性锑浓度相比初始总锑浓度分别下降64％、 62％和72％，并都伴有白色沉淀产生，证明菌株PS1对溶液中Sb(V)具有良好的去除能力。 [0100] 培养过程中有机碳底物乳酸浓度随时间的变化结果显示(图3中C)，在培养前期AQDS和FMN相比CK处理加快了乳酸消耗速度，与Sb(V)的还原加快相对应。36h后所有处理中乳酸浓度趋于稳定。乳酸是稻田土壤中常见的微生物发酵产物，也是水稻根际分泌物的重要组分之一，可作为稻田土壤锑还原功能菌群可利用的电子供体，从而促进异化锑还原过程。菌株PS1驱动锑还原和乳酸消耗，电子穿梭体存在加速了锑和乳酸转化。由于氧化还原反应电子传递在热力学上的驱动力大小与电子供受体间的电势差呈正相关关系，电子穿梭体的电势尽可能高(但低于细胞外膜终端电子受体(例如锑酸盐)的电势)，有助于增强微生物细胞呼吸的氧化还原效率。在中性pH条件下Sb(OH)6‑/Sb(OH)3具有较高的标准氧化还原电位，为0.764V，两种电子穿梭体中AQDS的氧化还原电势为‑0.185V，较高于FMN(‑0.216V)，所以AQDS相对FMN处理中菌株PS1锑还原和乳酸消耗速率更快，表明AQDS更具有促进细菌锑还原的潜力。 [0101] 实施例4：锑还原功能兼性厌氧属间芽孢杆菌PS1在不同电子穿梭体条件下的矿物检测 [0102] 本实施例用于验证实施案例3中不同处理条件下锑还原功能兼性厌氧属间芽孢杆菌PS1的矿物晶相和形貌特征，具体如下： [0103] 取不同处理中培养72h后的菌液25mL，通过5000g离心10min收集沉淀。对沉淀依次用蒸馏水、100％丙酮和蒸馏水漂洗，重复三次，去除细胞物质，然后冷冻干燥6h以上。利用X射线衍射仪(Smartlab 9kW,Rigaku Corporation,Japan)对样品粉末进行晶型鉴定，XRD扫描2θ角度范围为5–100°，速度为1.0°/min。另外，对样品粉末进行喷金镀膜，用SEM‑EDS(S‑3000N，Hitachi)进行表面形貌和元素组成观察。 [0104] 结果如图4所示，XRD结果表明不同条件培养72h后锑还原生成的微晶体为方锑矿Sb2O3(senarmontite)，衍射峰强度、结晶度和结构在各处理中基本不变。SEM‑EDS表征表面形貌和元素组成结果显示各处理中生成十四面体晶体(图5)，直径最大约为20μm，锑元素质量百分比占59.4％～76.2％。所以菌株PS1能够氧化乳酸耦合锑还原成矿，生成十四面体方锑矿，电子穿梭体加快锑还原速率过程中不改变矿物产物晶相和组成。 [0105] 实施例5：锑还原功能兼性厌氧属间芽孢杆菌PS1在不同电子穿梭体条件下的生物量变化 [0106] 本实施例用于验证实施案例3中不同处理下锑还原功能兼性厌氧属间芽孢杆菌PS1的生物量，具体如下： [0107] 取培养72h后的菌液，经7000g离心后，重悬至0.2μM氢氧化钠中，于100℃120rpm水浴振荡30min进行蛋白质提取，采用Bradford法测定提取液中蛋白浓度。 [0108] 结果如图6所示，Sb处理条件下相比无锑处理(CK)显著增加蛋白质浓度，提升1.9倍，表明菌株PS1驱动锑还原过程中，Sb(V)很可能做电子受体参与细胞异化还原呼吸，消耗乳酸从而产生能量进行细胞增殖。进一步的，Sb+AQDS和Sb+FMN处理中蛋白质浓度虽然相比无锑处理提升2.2和2.6倍，但相比锑处理无明显差异。因为细胞代谢产能主要受电子供体和受体转化量影响，电子穿梭体虽加速细菌的锑还原，但没有改变锑还原总量，所以电子穿梭体加快锑还原速率过程中对锑还原菌株PS1的细胞生长无明显影响。 [0109] 上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。 |
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