[0001] 本发明属于环保领域，具体涉及一种绿草定或其中间代谢产物的降解剂及其应用。

[0002] 农药的化学结构决定了其持久性或自然降解水平。根据它们的化学结构，它们可以分为两类：氯化和非氯化农药。在氯化农药中，有机氯农药是自然界中具有强烈持久性的农药，并导致该类药物的积累，导致食品污染。它们在生物学上非常稳定，并且是亲脂性的，导致自然降解较慢。农业活动中除草剂对地表水的污染在世界范围内已有充分的记录。

[0003] 绿草定是一种选择性内吸性除草剂，可迅速被植物的叶子和根部吸收，应用于处理农田里的阔叶杂草和木本植物。绿草定属于有机氯农药的一种，具有较高的水溶性(>6g/L)，随着其在农业生产中的广泛应用，其对地下水的威胁不断加大。

[0004] 在自然界中通过物理化学过程对农药等化合物的降解是非常有限的。因此，必须开发低成本、有效和环保的技术来处理环境中残留的绿草定，以尽量减少对环境和人类健康的潜在危害。

[0005] 为了解决现有技术中绿草定的降解效果差、成本高的问题，本发明提供了一种绿草定或其中间代谢产物的降解剂。

[0006] 该绿草定或其中间代谢产物的降解剂包括聚多曲霉菌菌株、聚多曲霉培养液、聚多曲霉发酵液和聚多曲霉悬液中的一种或多种，所述聚多曲霉菌的ITS核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0007] 本发明的一个目的是提供一种菌剂。

[0008] 所述菌剂包括如上所述的绿草定或其中间代谢产物的降解剂。

[0009] 本发明的一个目的是提供一种如上所述的绿草定或其中间代谢产物的降解剂，或如上所述的菌剂在降解绿草定、绿草定残留或绿草定的中间代谢产物中的应用。

[0010] 进一步地，降解所述绿草定、所述绿草定残留或所述绿草定的中间代谢产物的条件为：温度30‑35℃；pH 6.0‑9.0。

[0011] 本发明的一个目的是提供一种如上所述的绿草定或其中间产物的降解剂，或如上所述的菌剂在绿草定污染环境的生物修复中的应用，所述环境中含有绿草定或其中间代谢产物。

[0012] 进一步地，所述环境为土壤或水体。

[0013] 进一步地，所述绿草定在水体中浓度为25‑150mg/L，在土壤中的浓度为25‑150mg/kg，所述环境修复条件为：温度30‑35℃；pH 6.0‑9.0。

[0014] 进一步地，所述绿草定在水体中浓度为100mg/L，在土壤中的浓度为100mg/kg，所述环境修复条件为：温度30℃；pH＝7。

[0015] 本发明的有益效果为：使用本发明提供的绿草定或其中间代谢产物的降解剂或菌剂对绿草定污染环境的生物修复是一种高效、经济的环境友好型农药残留处理技术，具有操作简单、修复效果好、成本费用低、不影响农业生产等优势,有助于解决农业生产中农药残留的问题，同时提高了农产品质量安全。附图说明

[0016] 图1为菌株W1在含100mg/L绿草定无机盐液体培养基中的生长效果。

[0017] 图2为菌株W1在不同温度下对绿草定的降解效率。

[0018] 图3为菌株W1在不同pH条件下对绿草定的降解效率。

[0019] 图4为菌株W1在不同底物浓度下对绿草定的降解效率。

[0020] 图5为菌株W1对土壤中残留绿草定的降解效率。

[0021] 图6为菌株W1对绿草定的降解途径。

[0022] 为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。

[0023] 针对现有绿草定治理中存在的技术缺陷，本发明的目的是提供一株可有效降解水体和土壤中绿草定残留的微生物菌种降解剂和菌剂，可用于修复被农药绿草定污染的水体和土壤环境，保护人畜健康和生态环境安全。

[0024] 微生物大量存在于自然界、并且具有种类繁多、繁殖迅速和对环境适应性强等特点，可用于生物修复。与传统技术相比，生物修复不需要处理化学农药，可用于残留物的原位处理，在持续暴露于化学品后，污染区域中自然存在的微生物会在一段时间内适应。因此，该过程可以在土壤或水生环境中有机地进行。大多数时候，不需要外部刺激，因为农药等化合物是降解过程的营养或碳来源。因此，这种方法因其经济和环境友好的性质而得到了广泛的重视。

[0025] 为了实现本发明的技术目的，本发明所提供的绿草定降解菌株编号为W1，ITS序列见序列表，该菌株分类命名为聚多曲霉(Aspergillus sydowii)，已经于2021年7月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.23059。

[0026] 本发明所用培养基：

[0027] YPD液体培养基：酵母粉10.0g，蛋白胨20.0g，葡萄糖20.0g，用蒸馏水定容至1L，115℃灭菌30min。

[0028] 马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基：马铃薯200g，切成小块煮烂，用八层纱布过滤，加入葡萄糖20g，琼脂15～20g，加入蒸馏水定容至1L，自然pH，115℃灭菌30min。

[0029] 无机盐培养基(MSM)：K2HPO4 0.5g，KH2PO4 1.5g，NH4Cl 0.63g，MgSO4 0.16g，NaCl0.35g，NaNO3 1.06g，用蒸馏水定容至1L，pH 6.9‑7.2，121℃灭菌20min。

[0030] 将绿草定添加到无机盐培养基(MSM)获得绿草定无机盐培养基。

[0031] 实施例1：菌株W1对绿草定的降解：

[0032] 接种液的制备：将斜面保藏的聚多曲霉W1接种于PDA培养基平板上，在28℃恒温培养箱中培养3天。挑取培养好的单菌落接种于YPD液体培养基中，于30℃摇床培养3天，取适量菌体并用冷却的无菌水洗涤3次完全去除培养基，用等体积去离子水稀释作为接种液备用。为菌株提供合适的温度和pH等有利于它的生长环境条件，能够有效提高微生物降解农药的效率。

[0033] (1)将上述真菌W1的接种液按2％(v/v)接种于含100mg/L绿草定的无机盐培养基中，将培养温度设定4个水平：25℃、30℃、35℃和40℃。摇床转速设定为180rpm，初始的绿草定降解培养基pH为7.0，培养5天后利用高效液相色谱岛津LC‑20A检测绿草定残留浓度。检测条件为：流动相为90％甲醇和10％水；使用5um 4.6×250mm的Venusil MP C18柱，检测波长333nm，流速为0.6mL/min，保温箱温度为30℃。由图1和图2可知，真菌W1降解绿草定的最适温度为30℃，最高降解率为46.71％。

[0034] (2)用配制好的磷酸盐缓冲液调节绿草定无机盐培养基pH，设定4个水平：pH 6、pH 7、pH 8和pH 9。分别将上述真菌W1的接种液按2％(v/v)接种于含100mg/L绿草定的不同pH的无机盐培养基中，在温度30℃、180rpm条件下培养5天后检测绿草定残留浓度。测试仪器和测试条件与步骤(1)相同。由图3可知，真菌W1降解绿草定的最适酸碱度为pH 7.0，最高降解率为56.01％。

[0035] (3)在100mL无机盐培养基中分别加入绿草定，调节底物浓度为4个水平：25、50、100和150mg/L。其他条件为：培养温度30℃、培养液pH 7.0，菌体接种量2％(v/v)，摇床转速
180rpm。各培养5天后测定绿草定降解率，每个处理进行3次平行重复。测试仪器和测试条件与步骤(1)相同。由图4可知，底物浓度越低，真菌W1对绿草定的降解率越高，但绿草定浓度为100mg/L时，菌株的日均降解量最高，达到0.96mg/d。由此可知，真菌W1降解绿草定的最佳底物浓度为100mg/L。

[0036] 实施例2土壤中残留绿草定的降解效率

[0037] 菌剂的制备方法，包括如下步骤：(1)菌种活化：将斜面保存的聚多曲霉W1接种于马铃薯葡萄糖培养基平板上，30℃条件下培养24‑36h；(2)种子液培养：分别挑取活化菌株接种于液体牛肉膏蛋白胨培养基中，30℃条件下摇瓶培养24‑36h；(3)菌剂的制备：发酵液经离心后，倒去上清液，沉淀悬浮于生理盐水中，制备细胞悬液，即得菌剂。

[0038] 自常州大学的一处无污染草坪中采集土壤样品。取5‑20cm表层土壤，剔除其中的石块、植株残体等，于阴凉处均匀摊开自然风干，过2mm筛备用。称取土壤样品1200g，添加绿草定使土壤农药最终浓度为100mg/kg，调节水分至25％，搅拌均匀，分成6份，随机选3份接种真菌W1细胞悬液4mL，在35℃培养箱静置培养，每五天取实验土壤5g测定农药残留量。另外3份土样添加4mL水作为空白对照，同时设置三个平行组。

[0039] 称4.5g土壤于试管中，加入2倍体积的乙酸乙酯进行超声30min萃取，静置取上清液，共萃取三次。将萃取后的乙酸乙酯过ODS C18小柱，收集滤液旋转蒸干后用甲醇溶解，样品过0.22μm有机滤膜。高效液相色谱岛津LC‑20A检测含量，计算菌株W1对土壤中绿草定的降解率。检测条件为：流动相为90％甲醇和10％水；使用5um 4.6×250mm的Venusil MP C18柱，检测波长333nm，流速为0.6mL/min，保温箱温度为30℃。检测结果如图5所示，处理组接种真菌菌株W1第10天的绿草定降解为17.67％，由于微生物的繁殖随后进入快速降解期，第20天绿草定的降解率高达69.32％，随着绿草定在土壤中残留量的降低降解速率减缓，第30天的绿草定降解率为82.13％。

[0040] 实施例3微生物降解绿草定的中间代谢产物分析

[0041] 将案例1的发酵液过无菌滤膜，采用液相色谱质谱联用仪(Waters Xevo TQ‑S,Waters Technologies,Inc.,CA,USA)测定菌株的降解产物情况。MS条件：流动相为90％甲醇和10％水；使用5um 4.6×150mm的Venusil MP C18柱，流速为0.3mL/min，保温箱温度为30℃，质谱采用电喷雾正离子模式，MRM喷雾电压5250V，离子源温度400℃。质谱测定数据采用全扫描模式采集，采集范围100～700m/z。通过液质数据得知菌株W1对绿草定见附图6的降解产物与降解途径。实验结果进一步表明，该菌株对绿草定及其中间产物具有降解能力，可应用于绿草定污染的生物修复。

[0042] 序列表

[0043] <110>常州大学

[0044] 山西晟禾生物科技有限公司

[0045] <120>

[0046] <160>1

[0047] <170>SIPOSequenceListing 1.0

[0048] <210>1

[0049] <211>521

[0050] <212>DNA

[0051] <213>聚多曲霉(Aspergillus sydowii)

[0052] <400>1

[0053] atgcctgtcc gagcgtcatt gctgcccatc aagcccggct tgtgtgttgg gtcgtcgtcc 60[0054] ccccccgggg gacgggcccg aaaggcagcg gcggcaccgt gtccggtcct cgagcgtatg 120[0055] gggctttgtc acccgctcga ctagggccgg ccgggcgcca gccgacgtct ccaaccattt 180[0056] ttcttcaggt tgacctcgga tcaggtaggg atacccgctg aacttaagca tatcaactgc 240[0057] ggaaggatca ttactgagtg cgggctgcct ccgggcgccc aacctcccac ccgtgaatac 300[0058] ctaacactgt tgcttcggcg gggaaccccc tcgggggcga gccgccgggg actactgaac 360[0059] ttcatgcctg agagtgatgc agtctgagtc tgaatataaa atcagtcaaa actttcaaca 420[0060] atggatctct tggttccggc atcgatgaag aacgcagcga actgcgataa gtaatgtgaa 480[0061] ttgcagaatt cagtgaatca tcgagtcttt gaacgcacat t 521