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一种汉逊德巴利 酵母菌株及其用途

专利类型	发明公开	法律事件	公开; 实质审查; 授权;
专利有效性	有效专利	当前状态	授权
申请号	CN202110809512.2	申请日	2021-07-15
公开(公告)号	CN113355249A	公开(公告)日	2021-09-07
申请人	四川中烟工业有限责任公司;	申请人类型	企业
发明人	张倩颖; 李东亮; 罗诚; 蔡文; 耿宗泽; 马亚萍;	第一发明人	张倩颖
权利人	四川中烟工业有限责任公司	权利人类型	企业
当前权利人	四川中烟工业有限责任公司	当前权利人类型	企业
省份	当前专利权人所在省份：四川省	城市	当前专利权人所在城市：四川省成都市
具体地址	当前专利权人所在详细地址：四川省成都市龙泉驿区国家成都经济技术开发区成龙大道龙泉段2号	邮编	当前专利权人邮编：610000
主IPC国际分类	C12N1/16	所有IPC国际分类	C12N1/16 ; A24B3/12 ; A24B3/14 ; A24B15/20 ; C12R1/645
专利引用数量	4	专利被引用数量	0
专利权利要求数量	6	专利文献类型	A
专利代理机构	四川省成都市天策商标专利事务所	专利代理人	龚海月;
摘要	本发明公开了一种汉逊德巴利酵母菌株及其用途，将从烟叶中筛选出的产香汉逊德巴利酵母菌菌株或其发酵液接种至烟叶表面，在一定条件下进行发酵，可以显著提升烟叶品质，发酵烟叶具有甜润感显著提升，烟气柔和，杂气和刺激性降低等特点。
权利要求	1.一种汉逊德巴利酵母菌株(Debaryomyces hansenii)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为：CGMCC No.22724。 2.如权利要求1所述的汉逊德巴利酵母在烟株组织发酵的用途。 3.一种汉逊德巴利酵母发酵液制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)提供一种汉逊德巴利酵母菌株；所述汉逊德巴利酵母菌株的保藏号为CGMCC No.22724； (2)将菌种按照体积比1‑3％的接种量接种于马铃薯葡萄糖培养基中，28‑30℃、150‑ 200rpm恒温摇床培养24‑36h得到种子液； (3)取种子液按体积比1‑3％的接种量接种于马铃薯葡萄糖培养基或麸皮培养基中， 28‑30℃、150‑200rpm恒温摇床培养24‑36h，获得发酵液。 4.如权利要求3所述的种子液或发酵液在烟株组织发酵的用途。 5.一种烟用生物香料，其特征在于，制备方法包括以下步骤： (1)提供一种汉逊德巴利酵母菌株；所述汉逊德巴利酵母菌株的保藏号为CGMCC No.22724； (2)将菌种按照体积比1‑3％的接种量接种于马铃薯葡萄糖培养基中，28‑30℃、150‑ 200rpm恒温摇床培养24‑36h得到种子液； (3)取种子液按体积比1‑3％的接种量接种于马铃薯葡萄糖培养基或麸皮培养基中， 28‑30℃、150‑200rpm恒温摇床培养24‑36h，获得发酵液； (4)将上述种子液或发酵液于5000‑10000rpm离心10‑20min，取上清液；并将上清液经‑ 80℃预冻24h后，真空冷冻干燥得到烟用生物香料。 6.如权利要求5所述的烟用生物香料在烟用原料或成品烟中的用途，所述烟用原料包括烟叶、烟丝、梗丝、薄片、卷纸或滤嘴；所述成品烟包括卷烟、雪茄或电子烟。
说明书全文	一种汉逊德巴利酵母菌株及其用途技术领域 [0001] 本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种汉逊德巴利酵母菌株及其用途。背景技术 [0002] 烟草吃味不足，可以通过添加烟草香精香料来弥补。烟草香料主要分为人工合成和天然香料两大类。人工合成香料是非天然的，会给人体健康带来危害。天然香料主要来源于动物、植物和微生物，其中动物、植物香料资源有限，产量有限，不能满足日益增长的市场需求。微生物发酵制备天然香料具有生产周期短，不受气候影响，反应条件温和、选择性高、效率高等特点，受到越来越多的关注。 [0003] 从醇化烟叶表面筛选特定产香微生物，生产香韵凸出的烟叶和天然烟用香原料，对生产天然不加香卷烟和天然烟用香料、改善烟叶品质、提高卷烟质量等具有重要意义，将进一步满足人们对绿色卷烟产品的需求。 [0004] 汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)为常见的生香酵母，发酵时会产生较淡的甜酯香略带酒香，被广泛应用于肉制品的制备中。目前尚无从烟叶中筛选得到产香汉逊德巴利酵母，并将其用于烟草发酵增香和生产天然烟用香料的报道。发明内容 [0005] 本发明旨在提供一种汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)； [0006] 本发明的另一个目的是提供了汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)及其制品在烟草中的应用。 [0007] 为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案： [0008] 本发明的第一个方面是提供一种汉逊德巴利酵母菌株(Debaryomyces hansenii)，已于2021年6月17日藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为：CGMCC No.22724。 [0009] 本发明的第二个方面是提供本发明第一个方面所述的汉逊德巴利酵母在烟株组织发酵的用途。 [0010] 本发明的第三个方面是提供一种汉逊德巴利酵母发酵液制备方法，包括以下步骤： [0011] (1)提供一种汉逊德巴利酵母菌株；所述汉逊德巴利酵母菌株的保藏号为CGMCC No.22724； [0012] (2)将菌种按照体积比1‑3％的接种量接种于马铃薯葡萄糖培养基中，28‑30℃、150‑200rpm恒温摇床培养24‑36h得到种子液； [0013] (3)取种子液按体积比1‑3％的接种量接种于马铃薯葡萄糖培养基或麸皮培养基中，28‑30℃、150‑200rpm恒温摇床培养24‑36h，获得发酵液。 [0014] 本发明的第四个方面是提供本发明第三个方面所述的种子液或发酵液在烟株组织发酵的用途。具体使用方法为：将上述发酵液或种子液，按照烟叶重量的5‑30％，加入到烟叶中，置于25‑45℃下发酵1‑5天。 [0015] 本发明的第五个方面是提供一种烟用生物香料，制备方法包括以下步骤： [0016] (1)提供一种汉逊德巴利酵母菌株；所述汉逊德巴利酵母菌株的保藏号为CGMCC No.22724； [0017] (2)将菌种按照体积比1‑3％的接种量接种于马铃薯葡萄糖培养基中，28‑30℃、150‑200rpm恒温摇床培养24‑36h得到种子液； [0018] (3)取种子液按体积比1‑3％的接种量接种于马铃薯葡萄糖培养基或麸皮培养基中，28‑30℃、150‑200rpm恒温摇床培养24‑36h，获得发酵液； [0019] (4)将上述种子液或发酵液于5000‑10000rpm离心10‑20min，取上清液；并将上清液经‑80℃预冻24h后，真空冷冻干燥得到烟用生物香料。 [0020] 本发明的第六个方面是提供本发明第五个方面所述的烟用生物香料在烟用原料或成品烟中的用途，所述烟用原料包括烟叶、烟丝、梗丝、薄片、卷纸或滤嘴；所述成品烟包括卷烟、雪茄或电子烟。 [0021] 本发明的有益效果在于： [0022] 本发明将从烟叶中筛选出的产香汉逊德巴利酵母菌菌株或其发酵液接种至烟叶表面，在一定条件下进行发酵，可以显著提升烟叶品质，发酵烟叶具有甜润感显著提升，烟气柔和，杂气和刺激性降低等特点。 [0023] 将汉逊德巴利酵母菌菌株或其发酵液作为原料制备的烟用生物香料，添加至卷烟或雪茄烟中，其与烟草具有较好的协调性，具有丰富香气，使烟气绵柔、醇和，杂气和刺激性降低，回甜明显等特点。此烟用生物香料制备工艺简单，原料来源丰富，成本低廉，使用方便。将该烟用香料用于烟用原料或成品烟的加香加料，能够满足人们对绿色、健康卷烟产品的需求，因此具有显著的工业应用价值和广阔的推广应用前景。具体实施方式 [0024] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。 [0025] 实施实例1 [0026] 菌株的富集、纯化及筛选： [0027] 取烤烟烟叶(四川攀枝花烟叶)5g于100mL富集培养基中，置于摇床中28℃、150rpm培养36h。取1mL培养液置于培养皿中，与冷却至50℃的分离培养基混合均匀，凝固后置于28℃培养48h。挑取生长的菌落，接入分离培养基中，28℃、150rpm培养36h。将培养物梯度稀释后涂布于分离培养基平板，得到单菌落，将单菌落接入分离培养基中，通过嗅香，筛选产香培养物。将具有香气的培养物梯度稀释涂布于分离培养基平板，得到单菌落，通过划线分离得到汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)，编号为SCT‑Y1。 [0028] 所述的富集培养基为：马铃薯200.0g加水煮烂后过滤；葡萄糖20.0g；自来水补足1000mL；pH自然；115℃灭菌20min；接种前添加0.1g溶于乙醇的氯霉素于培养基中。 [0029] 所述的分离培养基为：马铃薯200.0g加水煮烂后过滤；葡萄糖20.0g；5％烟叶提取物5mL；自来水补足1000mL；pH自然；琼脂18g；115℃灭菌20min。 [0030] 实施实例2 [0031] 菌株的ITS分子鉴定及生物学特征： [0032] 使用引物ITS1(5'‑TCCGTAGGTGAACCTGCGG‑3')和ITS4(5'‑TCCTCCGCTTATTGATATGC‑3')对菌株的ITS区分子片段进行PCR扩增，然后经琼脂糖凝胶电泳检测合格后进行测序，得到该菌株的ITS序列。 [0033] 所述汉逊德巴利酵母培养形态描述如下： [0034] 马铃薯葡萄糖琼脂培养基上菌落表面较湿，外形大而凸起、呈乳脂色、边缘光滑，菌落正反面颜色相同。 [0035] 将该序列与GenBank中已登录的部分菌株ITS基因序列进行相似性比较，同源性达到99％，结合形态学鉴定结果，表明该菌株SCT‑Y1属于汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)。 [0036] 实施实例3 [0037] 将汉逊德巴利酵母接种于马铃薯葡萄糖培养基中，置于恒温摇床中28℃、200rpm，培养36h。取种子液按体积比2％的接种量，接种于马铃薯葡萄糖培养基，置于恒温摇床中28℃、150rpm培养36h。将培养液：水：烟叶按照质量比1:1:8，均匀喷洒于烤烟烟叶表面，置于恒温恒湿箱中35℃、75％相对湿度培养1天，将处理好的烟叶置于60℃条件下烘干至水分含量12％，获得发酵烟叶。 [0038] 马铃薯葡萄糖培养基：马铃薯200.0g；葡萄糖20.0g；自来水1000mL；pH自然；115℃灭菌20min。 [0039] 发酵烟叶经过切丝后卷制成烟支，由专业评吸人员进行感官质量评价，结果发现与未发酵样对比，发酵烟叶的感官质量明显提升，具体表现为：甜润感显著提升，烟气柔和，杂气和刺激性降低。 [0040] 实施实例4 [0041] 将汉逊德巴利酵母接种于马铃薯葡萄糖培养基中，置于恒温摇床中28℃、200rpm，培养36h。取种子液按体积比2％的接种量，接种于马铃薯葡萄糖培养基，置于恒温摇床中28℃、150rpm培养36h。将发酵液于5000rpm离心20min，取上清液。将发酵液上清液经‑20℃预冻24h后，真空冷冻干燥，即得烟用生物香料。 [0042] 马铃薯葡萄糖培养基同实施实例3。 [0043] 将该烟用生物香料用50％乙醇溶解后，按照烟丝质量0.05％、0.1％和0.2％的比例加入烟丝，进行感官评定，结果发现与空白样对比，加入烟用香料的卷烟感官质量明显提升，评吸结果见表1。 [0044] 表1烟用生物香料(汉逊德巴利酵母发酵物)的卷烟加香评吸结果 [0045] [0046] 以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

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