一株耐盐芽孢杆菌及其在降解类胡萝卜素上的应用 |
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| 申请号 | CN202410282750.6 | 申请日 | 2024-03-13 | 公开(公告)号 | CN117904004A | 公开(公告)日 | 2024-04-19 |
| 申请人 | 齐鲁工业大学(山东省科学院); | 发明人 | 沈延源; 陈淑君; 李志星; 邱磊; 胡文效; 赵先炎; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及 微 生物 和生物技术领域，尤其涉及一株耐盐芽孢杆菌及其在降解类胡萝卜素上的应用。所述的耐盐芽孢杆菌Bacillus halotolerans于2023年11月22日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号：CGMCC No.29097；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101；分类命名：耐盐芽孢杆菌Bacillus halotolerans；同时提供该菌株在降解烟叶中类胡萝卜素上的应用，能有效促进烟叶类胡萝卜素降解，增加烟叶法尼基丙 酮 、甲基庚烯酮、巨豆三烯酮等物质的含量。 | ||||||
| 权利要求 | 1. 一株耐盐芽孢杆菌A4，其特征在于，所述的耐盐芽孢杆菌A4为耐盐芽孢杆菌Bacillus halotolerans，于2023年11月22日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号：CGMCC No . 29097；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。 |
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| 说明书全文 | 一株耐盐芽孢杆菌及其在降解类胡萝卜素上的应用技术领域背景技术[0002] 类胡萝卜素是存在于植物和微生物中的亲脂性异戊二烯类色素，已知有700多种，主要包括β‑胡萝卜素、α‑胡萝卜素、叶黄素、番茄红素等，其中β‑胡萝卜素分布最广。β‑胡萝卜素因含有3 15个共轭双键而表现出高度不饱和性，通过酶或光氧化可降解产生C‑13、C‑~11、C‑10、C‑9等衍生物，这些衍生物中包括β‑紫罗兰酮、巨豆三烯酮、香叶基丙酮等重要的香料物质，因此β‑胡萝卜素及其降解产物在食品、化妆品、酒类风味发酵、烟草加工等行业均具有广泛应用。β‑胡萝卜素裂解产物β‑紫罗兰酮和大马士酮是西红柿的主要风味成分； β‑胡萝卜素降解形成的类异戊二烯的C‑10化合物组分对柑橘果汁的香气影响很大；葡萄酒主要香气成分异戊二烯衍生物(如β‑突厥烯酮、β‑紫罗兰酮等)也是β‑胡萝卜素降解产物。 新鲜烟叶中的类胡萝卜素种类除上文提及的外，还具有新叶黄素、紫黄素、八氢番茄红素等，类胡萝卜素总含量不高，一般为0.1% 1.1%，将β‑胡萝卜素添加到烟丝中能有效提高雪~ 茄烟叶香味品质。 [0003] 雪茄是一种具有独特香韵的烟草制品，经过晾晒、农业发酵、堆积发酵、养护醇化等工艺后制得的雪茄样品，有花香、烘焙香、坚果香等复杂香韵。近年来，雪茄产品在国内销售和需求逐渐上升，而国产雪茄在烟叶香气、品质等不及进口雪茄，国产雪茄产业发展受限、工业可用性不高等因素不利于国产雪茄的发展及其在国际市场中的竞争力。 [0004] 为了更好地改善烟叶的香气和品质，已有大量研究通过功能菌株筛选和应用提升低等级烟叶的烟叶香气和品质，如利用白地霉(G.candidum)发酵烟叶，产生酯类、醇类、酮类等挥发性香味物质；利用短小芽孢杆菌Bacillus pumilus 0855‑9发酵制得发酵蛋白酶液，将粗酶液均匀地喷洒至低次烟叶烟丝，明显改善了烟叶的品质、香气质，杂气减轻，抽吸口感较好；龙章德等（龙章德，王敏，薛云，等.烟叶中β‑胡萝卜素高效降解菌株的筛选鉴定及发酵条件优化[J].轻工学报，2022，37(4):86‑93）发现一株西方许旺酵母（Schwanniomyces occidentalis）可降解β‑胡萝卜素，增加烟叶二氢猕猴桃内酯、橙花基丙酮等物质含量。类胡萝卜素的氧化降解与烟叶香气质、香气量和烟叶品质有着正向影响，类胡萝卜素能够在微生物过氧化物酶、类胡萝卜素降解氧合酶、脂肪氧合酶等氧化酶作用下，在碳链的不同位置断裂成为多种香气物质，而目前关于烟叶类胡萝卜素降解菌株的筛选和应用研究较少。 [0005] 公开号为CN111657536A的专利文件公开的一种提高烟叶品质的方法，包括：筛选的具有类胡萝卜素降解能力的菌种；将所筛选的菌种制备为生物制剂；以及生物制剂应用于烟叶醇化获得具有类胡萝卜素降解产物的烟叶；所述菌种为从烤烟中分离出的高地芽孢杆菌。公开号为CN114376257A的专利文件公开的一种菌酶协同处理改善烟叶品质的方法，使用短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)和类胡萝卜素双加氧酶协同混合处理烟叶。 发明内容[0006] 本申请提供一株耐盐芽孢杆菌，同时提供该菌株在降解烟叶中类胡萝卜素上的应用，能有效促进烟叶类胡萝卜素降解，增加烟叶法尼基丙酮、甲基庚烯酮、巨豆三烯酮等物质的含量。该菌株还具有提升烟叶中美拉德反应产物、芳香族氨基酸降解产物、叶绿素降解产物以及西柏烷类降解产物的功能，同时具有降低烟叶中的蛋白质的功能。 [0007] 本申请的技术方案如下：一株耐盐芽孢杆菌A4，所述的耐盐芽孢杆菌A4为耐盐芽孢杆菌Bacillus halotolerans，于2023年11月22日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号：CGMCC No . 29097；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。 [0008] 上述耐盐芽孢杆菌A4在降解类胡萝卜素上的应用。 [0009] 优选地，用于降解烟叶中的类胡萝卜素。 [0010] 优选地，提升烟叶降解产物中香叶基丙酮、法尼基丙酮、甲基庚烯酮、巨豆三烯酮、β‑紫罗兰酮的含量；更优选地，提升了烟叶降解产物中巨豆三烯酮、香叶基丙酮和法尼基丙酮的含量。 [0011] 本发明的另一个目的，保护一种烟叶的发酵方法，采用包括上述耐盐芽孢杆菌A4的制剂来发酵烟叶。 [0012] 优选地，所述制剂中耐盐芽孢杆菌A4的浓度≥1×108CFU/mL；和/或发酵的条件为：温度35℃‑39℃、湿度68%‑72%下发酵5‑10d；和/或制剂与烟叶的用量比为（40‑50）mL：200g。 [0013] 优选地，所述制剂通过以下步骤制备：将所述耐盐芽孢杆菌A4接种于培养基中，于35℃‑40℃、200rpm‑240rpm下培养24h‑48h。 [0014] 优选地，所述耐盐芽孢杆菌A4以≥1%的接种量接种于LB液体培养基中。 [0015] 本申请从烟叶中筛选出了一种可降解类胡萝卜素的菌株，并使用细菌通用引物27F和1492R对筛选出的类胡萝卜素降解菌株进行菌落PCR，将得到的PCR产物送青岛蔚来公司测序之后，使用BLAST在NCBI上进行16S rRNA序列比对，同源度为81.4%，经鉴定，该菌种为耐盐芽孢杆菌（Bacillus halotolerans）。其在LB琼脂培养基中生长，其菌落特征为：菌落直径较大，菌落呈乳白色，形状为不规则形状。 [0016] 菌种保藏信息保藏时间：2023年11月22日， 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号：CGMCC No . 29097， 保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政 编码：100101； 分类命名：耐盐芽孢杆菌Bacillus halotolerans。 [0017] 本发明的有益效果本发明提供了一种耐盐芽孢杆菌A4，该菌株应用于雪茄烟叶中，能够有效降低雪 茄烟叶发酵过程中类胡萝卜素含量，增加法尼基丙酮、巨豆三烯酮、香叶基丙酮等物质含量，能够强化烟叶豆香、木香和坚果味香韵，提升烟叶香气质、香气量，降低杂气和刺激性等感官指标，对开发新型特征香韵雪茄产品和雪茄工业微生物制剂提供了研究思路。 附图说明 [0018] 图1为耐盐芽孢杆菌的菌落图片；图2为感官品评分析结果。 具体实施方式[0019] 以下是本发明的具体实施方式，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。 [0020] 实施例1 耐盐芽孢杆菌株分离、筛选、鉴定。 [0021] 一、 菌株的分离具体步骤如下： 取山东中烟工业有限责任公司提供的烟叶样品10 g，用液氮研磨促进内生菌的释 放，将研磨的粉末，按照20g/L添加入90 mL LB培养基中，于37℃、220 rpm条件下振荡培养 48 h，得到培养液。 [0022] 二、菌株的筛选具体步骤如下： ‑7 （1）将上述获得的培养液梯度稀释至10 ，涂布至筛选培养基上培养24 h，挑取有透明圈的菌株进行复筛。称取 10 mg 烟叶于 250 mL 三角瓶中，加入 100mL 无菌水浸泡 24 h，抽滤，取滤液 2 mL 加到富集培养基中，37 ℃、转速 150 r/min 培养 2 d，得到菌‑3 ‑4 ‑5 源。取适量菌源进行梯度稀释，选择10 ，10 ，10 三个浓度梯度在分离培养基上进行平板涂布，每个浓度梯度平行涂布3个平板，将涂布好的平板于培养箱中37 ℃培养2～3d，挑选出形态较好，有透明圈产生的单菌落，反复进行划线分离纯化。 [0023] （2）挑选出透明圈较为明显的单菌落接种于100 mL发酵培养基中28 ℃、转速150 r/min 培养2 d，通过观察摇瓶颜色，以及GC‑MS分析检测降解产物，进一步筛选具有降解类胡萝卜素能力的菌株，标记为A4。 [0024] 三、菌株的鉴定具体步骤如下： （1）对得到的菌株A4使用通用细菌引物27F，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示 (5′‑AGAGTTTGATCCTGGCTCAG‑3′)和1492R，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示(5′‑ CTACGGCTACCTTGTTACGA ‑3′)扩增菌株16S r RNA基因。 [0025] （2）使用30μL反应混合物进行PCR，选择Taq DNA Polymerase（Takara公司）酶进行，PCR条件为预变性95℃，5 min；扩增阶段35个循环，按照95℃，30 s；58℃，30 s；72℃，1 min 30 s进行，得到PCR产物。 [0026] （3）将步骤（2）得到的PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行分析并送青岛蔚来公司进行测序。 [0027] （4）在NCBI数据库中将序列与先前发布的细菌16S rRNA序列比对，菌株A4同源度为99%。所述菌株A4在LB固体培养基中，其菌落特征为：菌落直径较大，菌落呈乳白色，形状为不规则形状，如图1所示。 [0028] （5）经鉴定，菌株A4为Bacillus halotolerans，属于芽孢杆菌属，并被保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)保藏，编号：29097； [0029] 实施例 2耐盐芽孢杆菌在雪茄烟叶发酵中的应用。 [0030] 具体步骤如下：（1）菌株A4以1%接种量接种于LB液体培养基中，于37℃、220 rpm下培养48h得到发酵液，发酵液按照10 mL加入无菌水中使得最终体积为50mL，混合均匀得到制剂，此时制剂 8 中耐盐芽孢杆菌的浓度至少为1×10 CFU/mL。使用喷壶将该制剂均匀喷洒于250g海南雪茄烟叶表面。 [0031] （2）将喷洒发酵液制剂的烟叶置于自封袋中，在恒温恒湿培养箱中室温回潮24h。 [0032] （3）设置恒温恒湿培养箱的温度为37℃，湿度为70%，发酵5d，每天翻一遍烟叶。 [0033] （4）发酵结束后，置于‑20℃下保存。 [0034] 对比例1 无菌发酵具体步骤如下： （1）将46mL无菌水使用喷壶均匀喷洒于海南雪茄烟叶表面，标注为 CK。 [0035] （2）将喷洒无菌水的烟叶置于自封袋中，在恒温恒湿培养箱中室温回潮24h。 [0036] （3）设置恒温恒湿培养箱的温度为37℃，湿度为70%，发酵5d，每天翻一遍烟叶。 [0037] （4）发酵结束后，置于‑20℃下保存。 [0038] 成分分析对实施例2（A4）和对比例1（CK）中的发酵雪茄烟叶进行成分分析，具体步骤如下： （1）采用气相色谱‑质谱联用技术（GC‑MS）测定发酵烟叶类胡萝卜素降解产物含量，发酵结束的烟叶在40℃低温烘干并研磨成粉末，取1.5 g烟叶粉末于顶空瓶中，添加乙‑1 ‑1 酸苯乙酯作为内标，含量为100 μg•μL 。氦气流速为1 mL•min ，烘箱温度固定为40℃保持 2 min，在15℃/min下升温至250℃并保持5 min，离子源温度为210℃，传输线温度为280℃。 [0039] （2）计算机谱库WILEY 8.0和NIST14库用于比对分析化合物，选择相似度在800以上的类胡萝卜素降解产物、美拉德反应产物、芳香族氨基酸降解产物、叶绿素降解产物以及西柏烷类降解产物进行分析，含量采用绝对定量法进行计算。类胡萝卜素降解产物含量变化结果如下表1所示，其它反应或者降解产物如表2所示。 [0040] 表1实施例2（A4）和对比例1（CK）中类胡萝卜素降解产物含量变化 [0041] 通过表1可以看出，菌株A4发酵烟叶类胡萝卜素降解产物含量与对比例1相较增加了1.08倍，说明菌株A4在雪茄烟叶中发酵都能够促进烟叶类胡萝卜素降解。其中，A4发酵的烟叶中巨豆三烯酮2含量与对比例1相较增加了1.40倍，巨豆三烯酮1含量增加了1.15倍，香叶基丙酮含量增加了1.01倍，类胡萝卜素降解产物含量的增加对于增加烟叶香韵、提升烟叶香气质量和减轻杂气具有重要作用。 [0042] 表2实施例2（A4）和对比例1（CK）中相关产物的含量 [0043] 通过表2可知，与对照CK组相比，菌株A4所发酵雪茄烟叶美拉德反应产物、芳香族氨基酸降解产物、叶绿素降解产物以及西柏烷类降解产物均有所增加，相对于对照CK分别提升了51.63%、93.95%、74.56%和36.60%。 [0044] 感官品评分析烟叶样品的感官评价由山东中烟工业有限责任公司进行，按照1‑5分对样品的香 韵、定性指标和定量指标进行打分，不存在记0分。定量指标分为：生青、苦味、刺激性、燃烧性、其它韵感，具体见图2。 [0045] 结果表明，菌株A4发酵烟叶质量得分均高于CK组，菌株A4发酵烟叶质量提升最为明显。A4感官质量总分最高，A4发酵的烟叶生青、苦味、刺激性均有所下降，其中刺激性下降最为明显；且其它韵感提升明显。 |
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