一种加速烟叶醇化及提升烟叶品质的复合微生物菌剂及其应用 |
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| 申请号 | CN202410057183.4 | 申请日 | 2024-01-15 | 公开(公告)号 | CN117866837A | 公开(公告)日 | 2024-04-12 |
| 申请人 | 安徽中烟工业有限责任公司; | 发明人 | 汪季涛; 方泽民; 安子朝; 张劲; 王浩军; 沈忱; 彭振兴; 杨波; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种 加速 烟叶醇化及提升烟叶品质的复合 微 生物 菌剂及其应用。所述复合微生物菌剂包括高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)、特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)中的两种或两种以上微生物菌种的混合物。本发明复合微生物菌剂适用于复烤后待陈化的片烟品质提升，有利于促进烟叶陈化 进程 ，增加烟叶致香成分含量，提升烟叶内在 质量 。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种加速烟叶醇化及提升烟叶品质的复合微生物菌剂，其特征在于： |
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| 说明书全文 | 一种加速烟叶醇化及提升烟叶品质的复合微生物菌剂及其应用 技术领域背景技术[0002] 烟叶陈化是烟草产品生产加工的一个重要步骤，该过程与化学作用、酶作用和微生物作用紧密相关，其中微生物影响了整个烟叶陈化过程，是提升烟叶发酵效果的关键因素。微生物通过自身代谢活动，不仅能够降解对烟草质量不利的有害物质，还能将蛋白质、淀粉等严重影响烟叶品质的大分子物质分解为小分子化合物，从而提升烟叶的安全性和香气品质。所以为加速烟草陈化速度，提高烟草吸食质量、安全性及经济效益，人们常利用有益微生物来降解烟叶中大分子物质的含量。 [0003] 在烟叶醇化或发酵中，烟叶表面微生物的种类和数量对醇化效果影响较大。微生物发酵可缩短发酵周期同时提高烟草吸食品质，逐渐成为烟草行业的重要加工技术手段，2015年马宇平等人利用由优势芽孢杆菌菌种和酶等配制生物制剂；2019年叶亚军等人研究产中性蛋白酶的米曲霉菌剂；2020年帅瑶等人使用了解淀粉芽孢杆菌GUHP86与GZU03复配菌种发酵；2019年张海波等人研究由特基拉芽孢杆菌和短小芽孢杆菌搭配的复合菌剂。但现有微生物发酵烟草技术尚不成熟，用于人工接种的微生物大多是单一菌株，只能提升烟草某一方面的品质,同时微生物来源繁杂、安全性未知、应用受限，对不同烟叶品种普适性低等问题。从烟草中分离出的原生微生物则可以避免添加外源微生物带来的不良影响，从而增加香气含量和改善烟草品质。 发明内容[0004] 本发明为了解决目前烟叶自然醇化效率低、烟叶处理工艺安全性以及相关作用时间短等现状，提供了一种加速烟叶醇化及提升烟叶品质的复合微生物菌剂及其应用。 [0005] 本发明从大量醇化烟叶上筛选获得了能产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等多种酶的烟草源微生物菌株，将其制备成复合微生物菌剂。该复合微生物菌剂中所有微生物均来自烟叶本身的微生物库，保证了烟叶安全性的同时复合菌剂相较于单菌产酶综合能力强，省去了在生物制剂制备中搭配酶制剂来平衡其他高分子物质的降解作用。此外，该复合微生物菌剂对烟叶的提质也具有较好的普适性，对未醇化烟叶和低等级的醇化烟叶有较好的提质效果，同时在烟叶生产工艺复烤前后均可添加，能够伴随烟叶仓储长时间发挥作用。 [0006] 本发明复合微生物菌剂，包括高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)、特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)中的两种或两种以上微生物菌种的混合物。 [0007] 进一步地，所述复合微生物菌剂中微生物活菌数为：高地芽孢杆菌(Bacillus 7 altitudinis)活菌数≥10 CFU/mL，特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)活菌数≥ 7 7 10 CFU/mL，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)活菌数≥10 CFU/mL，短小芽孢杆菌 7 (Bacilluspumilus)活菌数≥10CFU/mL。 [0008] 更进一步地，所述复合微生物菌剂包括高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)、特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，活菌数比例为1:1:1:1。 [0010] 在一个实施方案中，高地芽孢杆菌、特基拉芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、短小芽孢杆菌的菌数比根据实际生长情况可自由调配。 [0011] 在一个实施方案中，发酵时间控制在24小时，本申请中24小时并非确指，可有根据实际操作过程中的具有偏差浮动，例如可以是前后偏差1‑2小时，即发酵时间为22‑26小时。 [0012] 另一方面，本发明用微生物组合物或复合微生物菌剂处理过的烤烟叶片一定程度上还可以用于防止陈化过程烟叶霉变。 [0013] 本文所用术语“组合物”，是指包含两种或两种以上微生物菌种的混合物，或者由所述微生物菌种组成。如果需要，所述组合物还可以包括其他的有利于所述菌株保存的物质，例如，培养基、微量元素、海藻糖、蔗糖、维生素、氨基酸、肉汤等。 [0014] 本文所用术语“复合菌剂”，是指包含两种或两种以上且互不拮抗的微生物菌种制成的微生物制剂，所述复合菌剂以所述菌种为活性成分，还可以另外包含载体或赋形剂，也可以包含其他的有利于所述菌株保存的物质，例如，培养基、微量元素、海藻糖、蔗糖、维生素、氨基酸、肉汤等。在一个实施方案中，所述菌剂配伍合理、具有协同作用等优点。 [0015] 本文所用术语“培养物”，是指在特定工艺条件控制下由微生物菌种在特定的培养基上经过发酵后形成的微生物制品，它主要包含经过发酵后微生物菌种细胞群、微生物菌种细胞外代谢产物和培养基。 [0016] 本发明复合微生物菌剂适用于复烤后待陈化的片烟品质提升，有利于促进烟叶陈化进程，增加烟叶致香成分含量，提升烟叶内在质量。本发明选择的菌株来源于烟叶本身，保证了发酵产品的安全性，该菌剂易培养，生长周期短，能耐受苛刻条件等特点。通过使用该发明可获得复烤后片烟快速醇化，且杂气减少，干燥感、刺激性降低，甜润感增强，香气指标、烟气指标和口感指标整体改善等效果。 [0017] 本发明的有益效果体现在： [0018] 1、本方法简单、处理量大、可在复烤前后阶段直接喷洒； [0020] 图1是菌剂处理后烟叶挥发性致香物质色谱图。 [0022] 图3是菌剂处理次等烟叶挥发性致香物质色谱图。 [0023] 图4是无菌水处理次等烟叶挥发性致香物质色谱图。 具体实施方式[0024] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例对本发明技术方案进行清楚、完整地描述。 [0025] 本发明的实施例中，可通过商业途径获得本文所述的菌种，例如： [0026] 高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)可以是芽孢杆菌YS193，从中国工业微生物菌种保藏管理中心(地址：北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼邮编：100015)购买获得。 [0027] 特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)可以是芽孢杆菌YS154，从中国海洋微生物菌种保藏管理中心(地址：厦门市大学路178号，邮编：361005)购买获得。 [0028] 贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)可以是芽孢杆菌YS157，从中国工业微生物菌种保藏管理中心(地址：北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼邮编：100015)购买获得。 [0029] 短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)可以是芽孢杆菌YH186，从中国工业微生物菌种保藏管理中心(地址：北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼邮编：100015)购买获得。 [0030] 本发明的实施例中，复合菌剂的制备方法包括以下至少一种方法或步骤： [0032] (2)加水800～900mL/L，搅拌均匀，使其充分溶解； [0033] (3)调节培养基pH至6.0～8.0，定容； [0034] (4)121℃高压蒸汽灭菌20～30min，得到发酵培养基； [0036] (6)将贝莱斯芽孢杆菌种子液按1％接种量接种于发酵培养基中，基于贝莱斯芽孢杆菌的稳定期，发酵培养30小时； [0037] (7)将短小芽孢杆菌种子液按1％接种量接种于发酵培养基中，基于短小芽孢杆菌的稳定期，发酵培养30小时； [0038] (8)将特基拉芽孢杆菌种子液按1％接种量接种于发酵培养基中，基于特基拉芽孢杆菌的稳定期，发酵培养30小时。 [0039] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 [0040] 鉴于现有技术中已经公开了芽孢杆菌菌剂用于烟叶处理，但是所公开的为解淀粉芽孢杆菌GUHP86与GZU03复配菌种，或为特基拉芽孢杆菌和短小芽孢杆菌搭配的复合菌剂并未涉及本发明中的高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)，也未涉及贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，申请人故设计如下试验组合，分别验证不同组合下的烟叶陈化效果。 [0041] 实施例1‑12： [0042] 下表1示出的是实施例1‑12中不同菌种的组合。其中，实施例1为对照组，为不含有7 任何菌种的无菌水。每种菌种的活菌数在10CFU/mL左右，基于以下实施例的菌种组合，设计如下方案对不同菌种对于烟叶陈化效果进行验证，为了便于计数及比较，本实施例之后的所有实施例中数值均精确至0.01。 [0043] 表1 [0044] 实施例 高地芽孢杆菌 特基拉芽孢杆菌 贝莱斯芽孢杆菌 短小芽孢杆菌1 × × × × 2 √ × × √ 3 √ × √ × 4 √ √ × × 5 × × √ √ 6 × √ × √ 7 × √ √ × 8 √ × √ √ 9 √ √ × √ 10 √ √ √ × 11 × √ √ √ 12 √ √ √ √ [0045] 包括以下步骤： [0046] (1)将烟叶样品混匀统一初始水分； [0047] (2)按照相同质量进行分装至容器； [0048] (3)向步骤(2)分装后的烟叶中按照烟叶质量接种20％的复合菌剂(菌液体积占比烟叶质量)，混合均匀； [0049] (4)在28℃，相对湿度65％条件下在控温控湿培养箱中培养15d。 [0050] 在上述步骤的基础上进一步检测不同实施例中烟叶经菌剂处理后的总糖含量变化(参考YC/T 159‑2002烟草及烟草制品水溶性糖的测定连续流动法)、生物碱含量变化(参考YC/T160‑2002烟草及烟草制品总植物碱的测定连续流动法)、钾氯比变化(钾的测定参考YC/T217‑2007烟草及烟草制品钾的测定连续流动法，氯的测定参考YC/T 162‑2011烟草及烟草制品氯的测定连续流动法测定)、总氮含量变化(参考YC/T 161‑2002烟草及烟草制品总氮的测定连续流动法)。感官质量鉴定由安徽中烟技术中心组织7名具备评吸资质的专业技术人员，参照《烟草在制品感官评价方法》(YC/T 415‑2011)，对片烟的感官质量进行评价，评价指标包括：香气指标(香气质、香气量和杂气)，烟气指标(劲头、浓度和细腻程度)，口感指标(刺激性、干燥感、余味和甜度)10项指标，每项指标满分为9分。除劲头和浓度指标外，每项指标设置权重，T(感官总分)＝(香气质*0.2+香气量*0.2+杂气*0.1+细腻度*0.05+刺激性*0.1+干燥感*0.05+余味*0.15+甜度*0.15)*100/9。 [0051] 下表2示出的是实施例1‑12中不同菌种的组合中，烟叶经菌剂预处理后的理化指标： [0052] 表2 [0053] [0054] 下表3示出的是实施例1‑12中不同的菌种的组合中，烟叶经菌剂处理后感官评分： [0055] 表3 [0056] [0057] 试验结果发现，实施例2‑12中均产生了明显的物质变化，说明高地芽孢杆菌与贝莱斯芽孢杆菌、特基拉芽孢杆菌以及短小芽孢杆菌的组合均能对烟叶中的碳水物质进行一定的降解，实施例1中有一定的相似反应但并不明显，推测是烟叶中的残留菌种或其他未知杂菌导致的；另一方面，实施例2‑7为双菌种的复合菌剂，实施例8‑11是三种菌种混合的复合菌剂，实施例12是四种菌种混合的复合菌剂，出乎意料的发现，实施例12的总糖含量最高，感官评分最高。实施例12的氮碱比、钾氯比及糖碱比评定标准均优于实施例1‑11，说明尽管高地芽孢杆菌与贝莱斯芽孢杆菌、特基拉芽孢杆菌以及短小芽孢杆菌其中之一的组合效果没有明显的优势，但是当四种菌种的复合菌剂对于烟叶的陈化效果具有更加优秀的协同增效的作用。 [0058] 实施例13：复合菌剂对不同等级片烟醇化质量的应用 [0059] 1、烟叶的醇化发酵前处理如上述实施例12。 [0060] 2、烟叶致香分析 [0061] 对实施例13的烟叶进行进一步分析，比较不同发酵处理下主要香气物质成分含量、香气物质前体物含量、烟草化学成分指标、感官质量。 [0062] 其中，致香物质提取和定性定量分析方法： [0064] (2)GC/MS条件：采用气质联用仪测定提取液中的香气成分。 [0065] 色谱条件：仪器型号TRACE1300 Series色谱柱型号为HP‑5MS毛细管色谱柱(30mx0.25mmx0.25pm)载气：He，每分钟20mL；进样口温度：260℃：进样量：0.5uL；分流进量分流比为：15：1；升温程序：初始温度为40℃，保持时间为3min；然后以每分钟增加15℃升温至160℃，最后再以每分钟增加9℃升温至260℃，保持时间为1min； [0066] 质谱条件：TSQ系列MS传输线温度：260℃：电离模式：EI源：电离能量：70eV：离子源温度：260℃：扫描时间3min；扫描范围：40‑600Da(3)检测结果分析：将检测到挥发性成分的质谱信息结合NIST 14标准质谱数据库进行定性确定，采用内标法对各组分定量分析。 [0067] 烟草化学成分测定方法与感官质量鉴定参照实施例12。 [0068] 表4烟叶处理前后重要致香物质含量分析量(μg/g) [0069] [0070] [0072] 根据表4结果经过处理后的烟叶吃味表现为花香、淡清香等风味的物质的量相对于对照组总体均有所提升，且相对于对照组重要的致香成分种类增加，而不利于风味或一些对风味贡献不大的高分子物质含量有所减少，且烟叶中重要的致香前体物质新值二烯含量显著增加，说明经过复合菌剂处理能对高分子物质进行降解及转化，促进小分子风味物质的形成，对提高烟叶品质使其形成独特的香气风味具有良好的作用，整体挥发性物质色谱结果见图1和2。 [0073] 表5烟叶处理前后感官品吸质量的变化 [0074] [0075] 对烟叶品质进行评价： [0076] 与对照相比、复合菌剂处理的烟叶样品桔焦、生青等杂气明显减轻，干燥、刺激性明显降低。整体香气质感和风格的清晰度明显改善，与致香成分检测的结果相互映照。 [0077] 表6处理前后烟叶主要化学成分含量变化 [0078] [0079] 表7处理前后烟叶六项常规物质含量 [0080] [0081] 通过对烟叶中物质含量测定可知，复合菌剂处理后的烟叶淀粉、纤维素、蛋白等大分子含量下降，其中淀粉显著降解，从而导致还原糖含量显著升高。还原糖，总糖含量有较大幅度增加，分别提高到107.8％和108.6％；烟碱含量明显下降，虽然总氮含量变化不大但在考虑烟叶的质量是由多因素协调关系表现，烟碱和总氮含量能形成合适的氮碱比。同时与糖含量形成合适的糖碱比，糖氮比，钾氯比含量合适，对平衡烟叶香味，增加烟香浓度，形成特有的风味起着重要作用。 [0082] 实施例14：复合菌剂在提升低等级烟叶品质中的应用 [0083] 具体实施方式同实施例13，其区别在于：选用低等级烟叶进行人工醇化。 [0084] 处理步骤同实施例13。 [0085] 表8烟叶处理前后重要致香物质含量分析量(μg/g) [0086] [0087] [0088] 注：以上各物质风味特征评价参考史宏志等，烟草香味学，北京：中国农业出版社，2011. [0089] 如表8所示，经过处理后的烟叶在重要的致香成分相较对照均有所提升，且在果香风味、烟气浓度方面的风味有促进作用的物质都较对照有所提升，新值二烯作为烟叶重要的香气前体物质也有所提高，说明该菌剂能对大分子物质进行降解及转化，促进小分子风味物质的形成，对提高烟叶品质具有较好作用，整体挥发性物质色谱结果见图3和图4。 [0090] 表9烟叶处理前后感官品吸质量的变化 [0091] [0092] 对烟叶品质进行评价： [0093] 与对照烟叶相比，经过菌剂处理过的样品烟叶清甜香风格特征更加彰显，香气质感提升，烟气更加细腻棉柔余味干净舒适。具体感官评价结果见表9。 [0094] 表10处理前后烟叶主要化学成分含量变化 [0095] [0096] 表11处理前后烟叶六项常规物质含量 [0097] [0098] 通过对烟叶中主要化学成分以及六项常规物质含量测定可知，处理后的烟叶中淀粉和纤维素大分子被微生物降解利用含量下降，还原糖，总糖含量有较大幅度增加，分别提到114.1％和114.5％；烟碱、总氮含量下降，与糖含量形成合适的糖碱比，糖氮比，氯，钾含量合适，对平衡烟叶香味，增加烟香浓度起着重要作用。 [0099] 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制。 |
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