【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、リポキシゲナーゼ、タンパクジスルフィドイソメラーゼ、フェノールオキシダーゼ、リシルオキシダーゼ、タンパクジスルフィドリダクターゼ、チロシンオキシダーゼまたはスルフヒドリルオキシダーゼから成る群より選択される酵素によって架橋した、少なくともひとつのタンパク被膜またはそのようなタンパク被膜の一部で取り囲まれた、活性成分配合物に関する。

【０００２】さらに本発明は、ひとつまたはそれ以上の活性成分を少なくともひとつの被膜で取り囲み、その時、活性成分を取り囲む被膜の少なくともひとつ、またはそのような被膜の一部が、リポキシゲナーゼ、タンパクジスルフィドイソメラーゼ、フェノールオキシダーゼ、リシルオキシダーゼ、タンパクジスルフィドリダクターゼ、チロシンオキシダーゼまたはスルフヒドリルオキシダーゼから成る群より選択される酵素によって架橋したタンパクから成る活性成分配合物の製造に関する。
また、本発明は、活性成分配合のための、前記酵素の使用に関する。

【０００３】また、本発明は、本願発明の活性成分配合物に加え、酵素としてリシルオキシダーゼを含有する、
ヒト用食物、動物用飼料および医薬組成物に関する。 本発明は特に、ビタミン、酵素、ヒト食物用添加物および動物飼料用添加物、例えばカロチノイド、から成る乾燥粉末に関する。 場合によっては、様々な添加物を包埋することも可能である。

【０００４】粉末形の活性成分配合物、たとえばビタミンおよびカロチノイド製品は公知であり、製薬業界、ヒト用食物および動物用飼料工業において大量に利用されている。 好適な製品を製造するための多くの方法が、文献に記載されている。

【０００５】配合物を粉体化するための様々な製造方法、特に噴霧方法の記載があり、その際、油溶性ビタミンまたはカロチノイドのような酸化−感受性物質が、酸化作用受けないよう、防御されている。

【０００６】ドイツ特許１０３５３１９には、低湿度（８％を下回る）下に、油溶性ビタミン分散液を大過剰粉末デンプン中へ噴霧する記載がある。 乾燥デンプン末により、噴霧粒子から水分を除去する。 この結果、粒子は、大量のデンプンを粒子表面に固着したまま凝固する。 更に、過剰のデンプンを除去し、これを工程に戻さなければならない。

【０００７】スイス特許４８８４５５には、撥水性および吸水性物質を含む無機物混合物の、剥離剤としての使用が記載されている。 これは、微細乾燥デンプンが誘起する爆発の危険性の回避を意図したものである。

【０００８】スイス特許３８９５０５には活性成分分散液の冷却気体媒質中への噴霧が記載されており、ここで、噴霧粒子は冷却により凝固する。 この過程には、１
５ｍの落下高さが必要で、温度は必ず室温より低くなければならない。

【０００９】高級脂肪酸の金属塩を含む粉末中への封じ込めにより、噴霧粒子を凝固させることも可能である。
この方法はスイス特許４３１２５２に記載されている。

【００１０】安定な活性成分含有配合物を製造するための別の方法が、欧州特許ＥＰ−Ａ−０６１８００１に記載されている。 ここで、球体粒子は、様々な担体基質混合物中に包埋した活性成分を含有し、この球体粒子は、
まず、活性成分、油分、タンパクおよび水分を非水混和性溶媒に添加して得た第一水中油型エマルジョンから制御した分割方法により小球が成形され、その後、生成した小球を分離することにより製造される。 小球の形成には特別な混合システムが必要である。 次に、この方法で得た粒子をアセトアルデヒド、グルタルアルデヒド、グリオキサールのようなアルデヒドで処理すると、化学的に架橋する。 これは生成物の不溶性によっても証明でき、このようにして活性成分の付加的な安定性が獲得される。

【００１１】アメリカ特許４６７０２４７には、架橋粒子を製造するための別の方法が記載されている。 この方法では、まず、油溶性ビタミン、ゼラチンのような保護コロイドおよび還元糖を主要素とするエマルジョンを噴霧および乾燥することにより粉体粒子へ変換する。 次にこの粒子を、温度１０５〜１８０℃で加熱処理する。 タンパクのアミノ基と還元糖のオキソ基間で起きたメイラード反応により生成した乾燥粉末粒子は、マトリクス構成要素の架橋により水不溶性となる。

【００１２】欧州特許ＥＰ７８２８８３には、カプセル壁を有し、食用塩でタンパクを塩析し、トランスグルタミナーゼでカプセル壁を架橋させて製造した経口マイクロカプセルが記載されている。 この方法の不利点は、広範囲の適用ができないことである。 すなわち、たとえばトランスグルタミナーゼは噴霧乾燥した活性配合成分を適切に架橋できず、保管時にも活性成分が分解されるため、噴霧配合には不適である。 酵素活性による架橋が完了するまで待機すると、配合物の噴霧は不可能となる。

【００１３】酸化−感受性化合物、この場合には特に油溶性ビタミンおよびカロチノイド、が大気と接触すると、酸素と反応して活性成分が不要の化合物へと変換され、活性成分の消失が誘導される。 この酸化は、例えば、タンパク上の反応基と反応し、結果的に酸素透過性を減少させて活性成分への安定した防御を提供するような添加物を、配合剤へ添加することにより回避できる。
これは、タンパクと還元糖のメイラード様反応で、タンパクの水への溶解が回避されることにより起こる。 また、タンパクをアルデヒドと反応させて架橋することも可能で、さらに、これにより担体マトリクスの安定性が増加する。

【００１４】しかし、これらの方法にはある不利点があり、より良い安定化の手段を模索する必要がある。 すなわち、タンパクと還元糖間のメイラード反応を利用すると、どのような場合にも温度のストレスを受けるため、
わずかであったとしても活性成分が分解されている。 加えて、生成物が茶褐色化する傾向がある。 メイラード反応を介した活性成分の配合については、たとえば、特許明細書ＥＰ−Ａ−０５４７４２２に記載がある。

【００１５】アルデヒドまたはタンニン酸のような酸に代表される化学薬品を架橋剤として利用する場合の不利点は、架橋のために、高反応性だが健康に有害な添加物を使用することである。 このような方法で生産される生成物は、消費者の需要に限界を生じる。

【００１６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、簡便で、経済的で、広範囲に適用でき、かつ前記の不利点を克服した活性成分の配合方法を開発することである。

【００１７】

【課題を解決するための手段】この課題を、本発明の活性成分配合物の製造方法により達成できることが見出された。 この方法では、ひとつまたはそれ以上の活性成分が少なくともひとつの被膜で取り囲まれ、ここで、活性成分を取り囲む被膜の少なくともひとつ、またはそのような被膜の一部が、リポキシゲナーゼ、タンパクジスルフィドイソメラーゼ、フェノールオキシダーゼ、フェノールペルオキシダーゼ、リシルオキシダーゼ、タンパクジスルフィドリダクターゼ、チロシンオキシダーゼまたはスルフヒドリルオキシダーゼから成る群より選択された酵素で架橋を形成するタンパクから成ることを特徴とする。

【００１８】代謝における、これらの酵素の化学的役割およびその化学反応については、たとえばグリーン等(G
reen et al.,Biochem.J. 1983, 211, 481〜493)、カガン等（Kagan et al.,Am.J.Respir.Cell Mol. Biol.,5,
1991, 206〜210)、ヘイウッド等（Haywood et al.,Bioc
hem. J., 1981, 199, 187〜201)またはマチス等（Mathe
is et al.,J.Food Biochem. 11, 1987, 309〜327)による著書にも記載がある。

【００１９】本発明の方法による酵素誘導性の架橋が有する利点は、加熱によるタンパク／糖衣の架橋に伴う活性成分への温度ストレスとそれに起因するメイラード反応を介した活性成分配合物の茶褐色化、および、アルデヒドのような有毒化学物質の使用の両方を回避できる点である。 加熱による架橋で起こるメイラード反応は、還元糖とタンパク上のフリーなアミノ基またはその他のフリーなアミノ基との結合を誘導し、それにより活性成分配合物を安定化する。 化学化合物をタンパクの架橋に用いると、通常、ジアルデヒドのようなアルデヒドとタンパク上のフリーなアミノ基または別のアミノ基との間に架橋が形成される。 本発明の方法では、タンパクが直接に架橋し、その架橋は、たとえば、タンパクまたはリポタンパク中に存在する脂肪酸残基を介して、システイン−システイン結合（＝シスチン結合）を介して、ミカエル反応による付加生成物を介して、またはリシンからのアルデヒド生成と続くフリーなアミノ基との架橋を介して起こる。

【００２０】このことが、本発明の新規活性成分配合物を導き出した。 この新規活性成分配合物は、ひとつまたはそれ以上の活性成分を取り囲み、リポキシゲナーゼ、
タンパクジスルフィドイソメラーゼ、フェノールオキシダーゼ、フェノールペルオキシダーゼ、リシルオキシダーゼ、タンパクジスルフィドリダクターゼ、チロシンオキシダーゼまたはスルフヒドリルオキシダーゼから成る群より選択される酵素によって架橋したタンパクから成る、少なくともひとつの被膜またはそのような被膜の一部を有する。 本発明の活性成分配合物は、安定性が良好で、茶褐色化を誘発せず、化学的な架橋剤を含有しない。

【００２１】本発明の方法に好適な活性成分または本発明の活性成分配合物は、原則として、医薬組成物およびヒトや動物の栄養剤に使用される全ての活性成分を含む。 好適な活性成分はビタミン、酵素、ヒト食物用添加物、動物飼料用添加物である。

【００２２】本発明の方法または活性成分配合物中に含まれる活性成分としての酵素は、たとえば、アミダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、ホスホリパーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、ニトリラーゼ、マンナナーゼ、フィターゼまたはキシラナーゼのような加水分解酵素、メチルトランスフェラーゼまたはアミノトランスフェラーゼのようなトランスフェラーゼ、
グルコースオキシダーゼまたはイソメラーゼのようなオキシドリダクターゼを意味する。

【００２３】疎水性の活性成分は特に有利であり、その中でも容易に酸化できるものは特に有利である。 後者には、ビタミンＡ、Ｄ、ＥおよびＫ群とその混合物が含まれ、特にカロチノイドおよび／またはキサントフィルとの混合物から成る。 本発明の目的のためには、ビタミン類を油中に溶解した形で、天然または合成ビタミン由来のプロビタミンおよび純ビタミンとして使用できる。 特に興味深い生成物は、ビタミンＤ ₃ 、ビタミンＫ ₁ 、ビタミンＡおよびその誘導体、特にビタミンＡアセテート、
ビタミンＡパルミテート、およびビタミンＡプロピオネートおよびそれらの混合物である。 ビタミンＥアセテートおよびビタミンＥパルミテートのような様々なビタミンＥ誘導体もまた、興味深い。 ヒト食物用添加物および動物飼料用添加物として有利なのは、カロチン、キサントフィルおよびβ−カロチンのようなカロチノイド、この他アスタキサンチン、アスタシン、ビキシン、ノルビキシン、カプソルビン、バイオラキサンチン、ルビキサンチン、ロドキサンチン、エチルアポ−８'−カロチノエート、ニューロスポラキサンチン、シトラナキサンチン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、β−アポ４'
−カロチナール、β−アポ８'−カロチナール、β−アポ１２'−カロチナール、β−アポ−８'−カロチノン酸、ルテイン、カプサンチン、リコペン、およびこの群に含まれる物質を含有したヒドロキシエステルおよびカルボキシエステル、たとえば、メチルまたはエチルエステルのような低級アルキルエステルまたはその混合物である。

【００２４】本発明の活性成分配合物中の活性成分含量は、粉末の乾燥質量あたり、通常１〜７５質量％であり、有利に５〜５０質量％であり、特に有利に１０〜３
５質量％である。

【００２５】ビタミンまたはカロチノイドの含量は、粉末の乾燥質量あたり、通常５〜５０質量％であり、有利に１０〜３５質量％である。

【００２６】本発明の有利な方法では、活性成分−含有性のエマルジョンまたは分散液を、疎水性シリカで負荷した雰囲気中に、また、場合によっては不活性化した雰囲気中に噴霧する。 この雰囲気は、別の剥離剤、例えば、でんぷんまたはコーンスターチのような変性でんぷんをはじめとする、炭水化物起源の作用物質により有利に負荷できる。

【００２７】さらに有利な方法では、活性成分配合物を、製造工程の後、噴霧のような方法で乾燥させる。 この乾燥により、湿分残量が有利に１０質量％、特に有利に６質量％を下回る。 より低い湿分残量を設定することも可能である。

【００２８】本発明の方法を実施する温度は、基本的に８０℃、有利に６０℃よりも低く保持されている。

【００２９】さらに、本発明は、本発明の方法により獲得でき、また、付加的な特徴として活性成分の０.０２
５〜４倍量の剥離剤または剥離剤混合物を含有する活性成分配合物に関するとともに、このようなタイプの活性成分配合物から成るヒト用食物または動物用飼料に関する。

【００３０】好適な剥離剤は、疎水性シリカ、コーンスターチ、化学処理で疎水化したコーンスターチ、高級脂肪酸の金属塩およびその他の植物デンプンまたはこれら剥離剤の混合物である。 このような剥離剤の少なくともひとつと、潤滑剤として働く無機化合物、例えばナウジリン^(R)またはゼオレックス^(R) 、のような他の助剤との混合物が特に有利である。

【００３１】疎水性シリカの場合、活性成分に対する割合は、有利に０.０２５〜０.４、特に有利に０.０５〜
０.２の範囲である。 コーンスターチの場合、その割合は、有利に０.２５〜２、特に有利に０.５〜１.５の範囲である。

【００３２】本発明の活性成分配合物は、このような活性成分、タンパクおよびその他の担体および、炭水化物および／または天然デンプンもしくは化学変性デンプンから成る群より選択される増量剤を主成分とする分散液を合成することにより獲得できる。 この他に安定剤または乳化助剤のような添加物も含有する。 さらに、様々な形態でタンパク分子を架橋する酵素をも含有する。 得られた架橋により、タンパクまたは活性成分の組み込まれたマトリクスの水への溶解能が低下し、その結果安定性が上昇する。

【００３３】本発明の方法で使用するタンパクは、基本的に、どのようなタンパクでもよい。 経済的な理由から有利とされる架橋可能なタンパクには、ゼラチン、カゼイン、大豆タンパク、小麦タンパク、とうもろこしタンパクおよびコラーゲンがある。

【００３４】有利な架橋可能なタンパクには、植物タンパクまたはゼラチンのような動物タンパクの全種類が含まれる。 具体的には、骨ゼラチン、胎牛ゼラチン、魚ゼラチンの他、カゼインのような乳タンパク、大豆タンパク、グルテンのような小麦タンパク、とうもろこしタンパク、コラーゲンがあり、特に有利なタンパクは、ゼラチン、乳タンパクおよび大豆タンパクである。 本発明の方法におけるゼラチンとは、それらが天然ゼラチンや化学修飾された誘導体であることに関係なく、全ゼラチン種を意味する。

【００３５】本発明の方法により有利に合成される分散液には、広いブルームレンジを有するＡおよびＢタイプのゼラチンを使用する。 特に有利に、ブルームレンジが５０〜２５０のゼラチンを使用する。

【００３６】本発明で使用するゼラチン量は、活性成分配合物の乾燥質量あたり、１０〜５０質量％、有利に１
５〜４０質量％、特に有利に２０〜３５質量％である。

【００３７】また、機械的安定性のために、タンパクへ、可塑剤、糖および／または糖アルコール、たとえばスクロース、グルコース、ソルビトール、ソルボース、
マンニトール、またはグリセロールのようなポリオールを添加することが望ましい。

【００３８】本発明の架橋可能な酵素には、リポキシゲナーゼ、タンパクジスルフィドイソメラーゼ（有利にＥ．Ｃ．クラス５.３.４）、フェノールオキシダーゼ（有利にＥ．Ｃ．クラス１.１４）およびペルオキシダーゼ（有利にＥ．Ｃ．クラス１.１１）、リシルオキシダーゼ（有利にＥ．Ｃ．クラス１.４.３）、タンパクジスルフィドレダクターゼ（有利にＥ．Ｃ．クラス１.６.
４）、チロシンオキシダーゼ（有利にＥ．Ｃ．クラス１.１４）またはスルフヒドリルオキシダーゼ（有利にＥ．Ｃ．クラス１.８.）がある。 これらは動物、植物または微生物を起源とする。 菌類または酵母のような真核微生物由来のもの、あるいはグラム陽性菌やグラム陰性菌またはアルケオバクテリアのような原核生物由来のものが有利である。 様々な起源のリシルオキシダーゼを酵素として有利に使用する。 特に有利に使用されるリシルオキシダーゼは、ジェネラカンジダ（genera Candid
a)、ハンセヌラ（Hansenula)、ピキア（Pichia)、スポロボロマイセス（Sporobolomyces)、スポロパキデルミア（Sporopachydermia)、またはトリゴノプシス（Trigo
nopsis)由来である。 特に有利に使用されるリシルオキシダーゼは、ジェネラおよびカンジダネゴイアエンシス（negoyaensis)、カンジダネモデンドラ（nemodendr
a)、カンジダボイジニイ（boidinii)、カンジダリポリチカ（lipolytica)、カンジダステアトリチカ（steatol
ytica)、カンジダトロピカリス（tropicalis)、カンジダユーティリス（utilis)、ハンセヌラミヌタ（minut
a)、ハンセヌラポリモルファ（polymorpha)、ピキアピナス（pinus)、ピキアパストリス（pastoris)、スポロボロマイセスアルボ−ルベセンス（albo−rubescens)、
スポリパキデルミアセレアナ(cereana)、トリゴノプシスバリアビリス(variabilis)由来である。 ジェナスおよびピキアパストリス種由来のリシルオキシダーゼは、本発明の方法に非常に好適である。

【００３９】慣用の方法で細胞破砕し、イオン交換クロマトグラフィー、続いて分子ふるいクロマトグラフィーを行い、最後にイオン交換クロマトグラフィーを再度実施することにより、本発明のピキアパストリスのリシルオキシダーゼを、ピキアパストリス細胞のバイオマスから精製した。 この精製方法により、リシルオキシダーゼの純度を、９０％より高く、有利に９５％より高く、特に有利に９９％より高く精製できる。

【００４０】精製したリシルオキシダーゼをエドマンタンパクシークエンス法で調べた。 これによりＮ末端が決定され、トリプシン切断により種々のペプチドを獲得した（例５参照）。

【００４１】本発明は、以下に示す配列の少なくともひとつを含有するか、アミノ−末端配列

【００４２】

【化２】

【００４３】または、タンパクのペプチドに対応し、トリプシン切断後に獲得される部分配列を含有し、

【００４４】

【化３】

【００４５】タンパク中のリシンのアミノメチル基を特異的にホルミル基に酸化できる単離タンパクに関する。
前記の配列に使用した文字およびシンボルは以下の意味を有する：Ｘは、同定が不可能であった位置の、未確認アミノ酸を示し；括弧書きされたアミノ酸は、記載のアミノ酸がおそらく正しいと思われるものの、明確に同定されなかったことを示し；斜線は、アミノ酸の選択を意味し、すなわち、斜線の前および後のアミノ酸のいずれかがその位置における正しいアミノ酸であることを示す。 アミノメチル基の酸化が、結果的にタンパクの架橋を誘導し、同一タンパクまたは異なるタンパクの領域で架橋し合う可能性もある。

【００４６】リシルオキシダーゼ（＝タンパク−リシン ６−オキシダーゼ、ＥＣ１.４.３.１３またはリシルオキシダーゼ）、特にピキアパストリス由来のリシルオキシダーゼは、タンパクの酵素による架橋を可能にし、
このときタンパクとしてゼラチンを有利に使用する。 この反応は、リシンのアミノメチル基のホルミル基への酸化を含む。 ホルミル基は、別のリシンのアミノ基または他のフリーなアミノ基、たとえばアミノサッカライド、
と反応してシッフの塩基を形成する。 利用者にとって、
技術的に特に利点であるのは、全ての連続反応が時間的に分離して起こること、すなわち、リシンのアミノメチル基からのホルミル基の形成、およびアミノ基とホルミル基の反応が、時間的に分離して起きる点である。 たとえば、トランスグルタミナーゼを助剤とした酵素による架橋を考えた場合、これは非常に大きな利点である。 なぜなら、架橋反応はこのような反応中で速やかに誘起され、酵素反応と架橋反応との間に時間的な分離を認められなかったからである。 反応が時間的に分離して起きることで、噴霧乾燥または微粒子化過程（ＥＰ−Ａ−００
６５１９３参照）による活性成分配合物の製造方法に、
酵素反応を有利に使用できるようになった。 形成される分子が関連組織の天然構成成分のため、無害であることも利点のひとつである（図１および２）。 これらは、組織リシンオキシダーゼにより合成される。

【００４７】図１：２つのリシン側鎖からのアルドール結合の形成

【００４８】

【化４】

【００４９】前記の酵素は、精製酵素または天然物資源から得た粗抽出物の形で使用でき、天然物資源には、たとえば菌類、酵母、動植物細胞のような真核生物、またはグラム−陽性菌やグラム陰性菌、アルケオバクテリアなどの原核生物がある。 酵素を細胞外培地中に分泌するか、または細胞が透過性である限り、本発明の方法には、全ての有機体または細胞を使用できる。 本発明の方法は、精製酵素を用いて実施するのが有利であるが、望ましくない２次活性物質が存在しないのであれば、粗抽出物も使用できる。

【００５０】タンパクの架橋に必要とされる酵素量または酵素活性は、当業者に公知の簡易な予備試験による慣用の方法で測定できる。 酵素は、架橋されるタンパク中に存在するリシン残基をはじめとする架橋可能な基の２
０〜１００％量で添加するのが普通である。 有利にはタンパク１ｇあたり酵素０.００１〜１０００ユニット、
さらに有利にタンパク１ｇあたり０.０１〜１００ユニット、特に有利に０.１〜１０ユニットである。

【００５１】活性成分配合物は、ひとつまたはそれ以上の活性成分を含有し、配合物中に存在するこの活性成分は、ビタミンやカロチノイドのように様々なクラスであったり、または、数種の異なるカロチノイドやビタミン、またはその混合物のように、ある活性成分クラスに属する数種の活性成分であったりする。

【００５２】配合物中の活性成分は、ひとつまたはそれ以上の被膜で取り囲まれる。 この被膜は、本発明の架橋タンパク被膜をひとつまたはそれ以上含むか、あるいは、本発明の架橋されたタンパク被膜をひとつまたはそれ以上含む他に化学的に架橋したタンパク被膜を少なくともひとつ、および／または天然ポリマー被膜や合成ポリマー被膜をも含有できる。 本発明の方法で架橋したタンパクが、活性成分を取り囲む少なくともひとつの被膜の、一部分に過ぎない可能性もある。

【００５３】どのような天然および／または合成ポリマーも、基本的には全て、活性成分の配合に好適である。
特筆すべき天然タンパクの例は、グアーゴム、アルギネート、カラギナン、ペクチンのようなポリマーであるか、または、マンノースおよび／またはガラクトースを基本構造とするポリマーである。 特筆すべき合成タンパクの例は、アクリル酸、メタクリル酸、アクリレート、
メタクリレート、このようなモノマーの混合物、たとえば、Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｌ３０Ｄ−５５（メタクリル酸：エチルアクリレート、１：１）またはＥｕｄｒａｇ
ｉｔ Ｓ（メタクリル酸：メチルメタクリレート、１：
２）である。 ポリマーには、そのほかのモノマーも存在してよく、たとえばトリメチルアンモニオエチルメタクリレート、ポリリシンまたはポリアリルアミンのようにプラス電荷を供給するモノマーも存在してよい。 使用するポリマーまたはポリマー混合物によっては、活性成分の配合を有利にする本発明の被膜の助けをかりて、作用部位で特異的に放出するようにできる。 すなわち、胃液に抵抗性の被膜、小腸で溶解する被膜、胃で特異的に溶解する被膜、第１胃の環境下には溶解しない被膜、体内に導入後ある程度の時間を経て活性成分を放出するような被膜などを製造できる。 体内に活性成分配合物が取り込まれた後にはじめて放出が起こるような形にして、活性成分を、動物用飼料またはヒト用食物にも配合できる。

【００５４】ひとつまたは数種の活性成分は、本発明の方法で架橋したタンパク被膜のひとつまたはそれ以上により、有利に取り囲まれている。

【００５５】活性成分配合物を含有するエマルジョンは、疎水性の剥離剤、たとえば疎水性シリカ、コーンスターチのような天然デンプン、疎水性コーンスターチのようなデンプンの疎水性誘導体、長鎖脂肪酸塩またはこれらの混合物を用いて有利に噴霧される。 剥離剤を最初から噴霧用チャンバー内に入れることもでき、剥離剤として、空気または不活化ガス（例、窒素）中の疎水性シリカ粒子などが挙げられる。 次いで、空気または保護気体流を処理して噴霧粒子を乾燥させるが、場合によっては剥離剤の除去後でよく、温度を緩慢に８０℃まで、有利に６０℃まで、特に有利に室温まで上昇させてもよい。

【００５６】必須構成成分に加え、活性成分の乾燥粉末を製造するのに一般的に使用されるその他の化合物を分散液に有利に添加できる。

【００５７】図２：シッフの塩基を得るためのリシン残基とアリシンの反応、さらに、リシノノルロイシン、デスモシン、イソデスモシンを得る反応。

【００５８】

【化５】

【００５９】動物飼料用添加物として乾燥粉末を使用する時、活性成分が酸化−感受性である場合には、安定剤、たとえばエトキシクイン、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨ
Ａ）、トコフェロールのような抗酸化剤やアスコルビルパルミテート、モノグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリドと酢酸のエステル、クエン酸、乳酸、ジアセチル酒石酸、トリグリセロールの脂肪酸エステル、ソルビタンの脂肪酸エステル、プロピレングリコールの脂肪酸エステル、ステアロイル−２−ラクチレート、リン酸、
フィチン酸、およびこれらのアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩、および錯形成剤、たとえばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ酸酢酸（ＮＴＡ）を添加することが特に重要である。

【００６０】さらに、グリセロール、ソルビトール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールのような吸湿剤またはレシチンのような付加的乳化剤も、エマルジョンにしばしば添加される。

【００６１】糖、デンプン、デンプン誘導体、中でも特にコーンスターチやマルトデキストリンのような炭水化物、または、アラビアゴム、グアーゴム、トラガカントゴム、寒天、カラギナン、いなごまめゴム、アルギネート、ペクチン、キサンタン、カードランのような増粘剤、および特定のデンプン分解物もエマルジョンの粘度調整に有効であることが知られている。

【００６２】こういった添加物の意味、性質および量に関するより詳しい情報を得るために、適当な専門誌、たとえば、前記の専攻論文、”油溶性ビタミン”ｖｏｌ.
９、特に１２８〜１３３頁、を引用した。

【００６３】これらの添加物は、活性成分配合物を有利に安定化し、個々の投与条件に適応させる。

【００６４】本発明の方法を実行する場合、活性成分を含む分散液を調製するために、たとえば、ゼラチンを熱水（５０〜７０℃）に溶解し、この溶液へ糖、アミノ化合物、ビタミンおよび／またはカロチノイド、安定化剤、その他慣用の添加物、場合によっては水、を添加し、温度を上昇させながら激しく撹拌して混合物を分散させる。 本発明の方法の最終工程において粉末を酵素で架橋するために、完成した分散液を、ＮａＯＨ、ＫＯ
Ｈ、Ｃａ（ＯＨ） ₂ 、ＭｇＯ、炭酸ナトリウムまたはＮ
Ｈ ₄ ＯＨのような塩基または酢酸ナトリウムやＮａ ₂ ＨＰ
Ｏ ₄のような塩基性塩によりｐＨを４〜１０に調製する。 このようにして得た分散液を慣用の方法、すなわち、噴霧乾燥、噴霧造粒またはその他慣用の乾燥手段により粉体へ変換する。

【００６５】ＥＰ−Ｂ−００６５１９３には、非常に細かく粉砕されたカロチノイドの易流動性粉体を製造する方法が記載されている。 ここでは、カロチノイドを揮発性含水有機溶剤中に、場合によっては圧力を上昇させながら、５０〜２００℃で１０秒より短い時間内に溶解し、次いで、そのようにして得られた分子分散溶液を、
温度０〜５０℃で膨潤性コロイド水溶液とともに激しく撹拌することにより活性成分をコロイド状に沈澱させる。 溶媒と分散媒質を慣用の方法により分散液から除去する。 膨潤性コロイドにはタンパクを使用する。 これらのタンパクは、前記した本発明の酵素の添加により架橋される。 酵素を、乾燥工程の前に、水性微細溶液に有利に添加するため、乾燥以前に、架橋に必要な十分量の反応基が生成される。 この方法の詳細はＥＰ−Ｂ−００６
５１９３に記載される。

【００６６】ＥＰ−Ｂ−０４１０２３６には、コロイド状カロチノイド配合物の別の製造方法についての記載がある。 ここでは、高温沸騰した油中カロチノイド懸濁液を、３０秒を越さない範囲で、過熱水蒸気と接触させる。 カロチノイドを溶解させた油分に代えて、クロロホルム、メチレンクロライド、テトラクロロメタン、トリクロロエチレンのような有機溶媒を代用することも可能である（ＤＥ Ａ １２１１９１１参照）。 最終混合物を保護コロイド水溶液と乳化し、エマルジョンを噴霧乾燥する。 再度、タンパクを保護コロイドとして使用し、
混合および噴霧前に前記の酵素を添加して本発明の方法により架橋する。 この方法の詳細はＥＰ−Ｂ−０４１
０２３６に記載される。

【００６７】ＥＰ−Ｂ−０４９８８２４には、微分散活性成分配合物の、より有利な製造方法が記載されている。 ここでは、ゼラチンのようなタンパクに代表される保護コロイドの存在下に、活性成分であるカロチノイドを微細化し、続いて、生成した懸濁液を乾燥する。 タンパクを有利に架橋し、活性成分配合物を本発明の方法で使用する酵素の添加により安定化する。 このような製造方法に関する詳細に関しては、この特許の他に、ＷＯ９
４／１９４１１に記載がある。

【００６８】本発明では、引き続き、分散液から粉体を製造するが、この方法は、従来文献より公知の全ての方法で実施することが可能である。

【００６９】粉体には望ましい粒度分布（０.１〜０.６
ｍｍ直径）があるため、分散液中のゲル化液滴が最終的にその形態が安定化するまで個々に独立状態を保持できるような処理を有する方法ほど有利である。

【００７０】例を挙げると、 ＥＰ−Ｂ１−７４０５０
では、分散液を、疎水性シリカまたは高級脂肪酸の金属塩中に噴霧し、ＥＰ−Ｂ１−２８５６８２では、分散液を、デンプン粉中に噴霧する。 剥離剤として疎水性シリカを使用する噴霧操作は、３５質量％より低いゼラチン含量の配合物の製造方法で、特に有利に実施される。

【００７１】記載の方法で製造した粉体は、乾燥後の水分含量が１０質量％より少なく、通常では６質量％よりも少ない。 得られた粉体生成物は、表面が良好に成形された粒子から成る。 また、約４０℃の温水に速やかに溶解して乳濁液となる。

【００７２】本発明の活性成分配合物は医薬組成物の製造およびヒト用食物や動物用飼料の製造に好適かつ有利である。

【００７３】

【実施例】例１ ピキアパストリス−Ｌｕ５８３−からのリシルオキシダーゼの調製。

【００７４】 この微生物種をＹＭアガー： マルトエキストラクト（malt extract) ３ｇ／ｌ Difco ペプトン（peptone) ５ｇ／ｌ Difco イーストエキストラクト（yeast extract) ３ｇ／ｌ Difco アガー（agar) ２０ｇ／ｌ Difco 上で培養した。

【００７５】プレートを２８℃で４８時間培養し、その後４５℃で少なくとも４週間保存することが可能である。

【００７６】前培養および発酵培地： グルコース（１２１℃で３０分圧熱滅菌） １０ｇ／ｌ 別個に調製し、１２１℃で３０分圧熱滅菌： 硫酸マグネシウム×７ Ｈ ₂ Ｏ ０.２ｇ／ｌ リン酸二水素カリウム ３.０ｇ／ｌ ヴィシニャック＆サンター 塩溶液＊ ０.２ｍｌ／ｌ
（Vishniac & Santer solt solution) 別個に調製し、濾過滅菌： ロダービタミン溶液（Loddar vitamin solution)＊＊
１０ｍ／ｌ 培地成分を滅菌後、混合する。

【００７７】＊ヴィシニャック＆サンター 塩溶液の内容 チトリプレックス（Titriplex)ＩＩＩ ５０ｇ／ｌ 硫酸亜鉛×７ Ｈ ₂ Ｏ ２２ｇ／ｌ 塩化カルシウム ５.５４ｇ／ｌ 塩化マンガン×４ Ｈ ₂ Ｏ ５.０６ｇ／ｌ 硫酸鉄×７ Ｈ ₂ Ｏ ４.９９ｇ／ｌ モリブデン酸（ＶＩ）アンモニウム×４ Ｈ ₂ Ｏ １.
１ｇ／ｌ 硫酸銅×５ Ｈ ₂ Ｏ １.５７ｇ／ｌ 塩化コバルト×６ Ｈ ₂ Ｏ １.６１ｇ／ｌ ＫＯＨでｐＨを６.０に調整。

【００７８】＊＊ロダービタミン溶液の内容 ビオチン ２０μｇ／ｌ パントテン酸カルシウム ２００００μｇ／ｌ 葉酸 ２μｇ／ｌ イノシトール １００００μｇ／ｌ ｐ−アミノ安息香酸 ２００μｇ／ｌ ナイアシン（ニコチン酸） ４００μｇ／ｌ 塩酸ピリドキシン ４００μｇ／ｌ リボフラビン ２００μｇ／ｌ 塩酸チアミン ４００μｇ／ｌ 前培養 発酵液１０ｌ用に、１ｌの各エーレンマイヤーフラスコ中の２×２５０ｍｌ前培養液へ白金ループでＬｕ−５８
３を３〜４回接種してを調製し、２８℃、２００ｒｐｍ
で２４時間インキュベートした。

【００７９】主培養 以下の条件を備える１０ｌインフォース(Infors)発酵器中でのバッチ： 温度 ２８℃ 通気 ５ｌ／分で循環気体の導入 回転数 ４００ｒｐｍ 発酵器取付部品 標準回転パドル３個、組み込みバッフル 発酵開始前に、５０％濃度(Ｖ／Ｖ）ｎ−ブチルアミン水溶液を添加してｐＨを約７.０に調整した。 次いで、
発酵器に前培養液２×２５０ｍｌを接種した。 発酵を約２８〜３０時間かけて実施した。 ６００ｎｍでＯＤを測定することにより発酵の停止時期を決定した。 ６００ｎ
ｍにおける発酵液のＯＤを大気を規準に測定し、その値が０.９〜１.０でなければならない。 ＯＤがこれより大きくなると、酵素活性が短時間の内に消滅する。

【００８０】後処理 発酵器の内容物をヘレアスクリオフージ（Hereaus Cryo
fuge）８０００を用い、４５℃、５０００ｒｐｍ（約９
５００×ｇ）で２０分間遠心分離した。 得られた湿バイオマスを５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液２５０ｍｌ中で洗浄し、再度遠心分離した。 このバイオマスは、−１
５℃のディープフリーザーで保存できる。

【００８１】細胞破砕およびリシルオキシダーゼの測定 湿バイオマス（１００ｍｌ）を、ガラスビーズ（直径０.５ｍｍ）１００ｍｌとともに、回転数５０００ｒｐ
ｍのボールミル中で、氷冷下に３０分間破砕した。 細胞分画をガーゼで濾過し、４℃、１００００ｒｐｍで１０
分間遠心分離した。 上清の活性をＨＰＬＣアッセーで測定した。 リシルオキシダーゼはベンジルアミンをベンズアルデヒドに変換する（２５０ｎｍで検出）。 産生されるベンズアルデヒド量を検量プロットにより測定した。

【００８２】実施条件 緩衝液Ａ：水、０.１％ ＴＦＡ 緩衝液Ｂ：アセトニトリル、０.１％ ＴＦＡ ０分 ４０％ Ｂ ６分 ７０％ Ｂ ６.１分 １００％ Ｂ ６.５分 １００％ Ｂ 流速 １ｍｌ／分 ６.５〜９分 ４０％Ｂへ戻す。 流速１.５ｍｌ／分。

【００８３】７×１０ｌの発酵器内容物から得たリシルオキシデート含有上清を集めてひとまとめにした。 活性の測定結果は、１.８ｌ中１２５.５Ｕ／ｌであった。

【００８４】例２ 蛍光染色液によるゼラチンの標識およびリシルオキシダーゼによるゼラチンの架橋 ゼラチン（１０ｇ）をｐＨ９.０の５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液に溶解した。 ｐＨを確認し、０.５Ｍ Ｎ
ａＨＣＯ ₃で再調整した。 蛍光染色液Ｃｙ−５またはＢ
ｏｄｉｐｙ６３０／６５０−Ｘ、ＳＥ）をＤＭＳＯ（＝
ジメチルスルホキシド）５ｍｌに溶解し、１：１００の質量比でタンパクへ添加した。 染色液のサクシニミジルエステルをタンパクのフリーなアミノ基と室温で１６時間かけて反応させた。 反応混合物を、大容量のアジド０.０１％を含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で５
回透析し、１％濃度のタンパク溶液として−２０℃で保存した。

【００８５】ゼラチンＡ１００ブルーム４５４ｇを、４
ｌの振盪フラスコを用い、リシルオキシダーゼ発酵液の合した上清を含む溶液（ＺＨ２９３０３／５；１２５.
５Ｕ／ｌ）１８００ｍｌ中に、４０℃で撹拌しながら溶解した。 そこへＢｏｄｉｐｙ処理したゼラチン（前記参照）を添加した。 最終混合物を４０℃で４８時間撹拌し、このとき、継続的に大気、すなわち酸素と接触できるように、フラスコには蓋をしない。

【００８６】サンプル３００ｇを、下記の時間ごとに、
溶液から採取した。

【００８７】 サンプル１：実験開始直後 サンプル２：実験開始後２時間 サンプル３：実験開始後５時間 サンプル４：実験開始後２４時間 サンプル５：実験開始後２９時間 サンプル６：実験開始後４８時間 サンプルを以下のように後処理した： ａ）２００ｇを単一−成分ノズルにより、疎水性シリカ（Sipernat D 17)のミスト中に直接噴霧し、直径が約２
００μｍの粒子を得た。 生じた湿式生成物を分割した；
半分を室温で乾燥し、残りの半分を８０℃で乾燥した。
いずれの場合も、大気流中の吸引漏斗上で実施した。

【００８８】ｂ）残りの１００ｇにビタミンＡ、イソ甘味料およびとうもろこしデンプンを添加し、ウルトラツラックス（Ultraturrax)で油層を乳化した後、同様の方法で噴霧し、噴霧生成物を室温で乾燥させて乾燥粉末にした。 生成物の組成は、だいたい以下の通りである。

【００８９】２５％ エトキシクインおよびＢＨＴで安定化した酢酸ビタミンＡ ３０％ ゼラチンＡ１００ブルーム ２５％ コーンスターチ １５％ イソ甘味料 残分：水+シパーナットＤ１７（Sipernat D 17）＋発酵残留物 例３ 蛍光相関分光計（＝ＦＣＳ、fluorescence crrelation
spectroscopy)による架橋の測定 ＦＣＳは、数変動を関知する分光光度計の測定方法を基本とする。 ＦＣＳでは、極めて希薄な溶液中の蛍光分子の拡散係数および数濃度(number concentration)を測定できる。 図１および図２は、ＦＣＳ装置の構成とその機能原理を示す。 ＦＣＳは、顕微鏡対物レンズにより微量液体サンプルにレザー光線の焦点を合わせ、そこに存在する蛍光物質を測定する。

【００９０】図１は、ＦＣＳ装置を示す図である。 焦点を合わせたレザー光線および同焦点レンズアパーチュアにより、サンプルの非常に小さい測定容量（＝同焦点容量）が確定される。 この容量から発する蛍光の時間による変化を、コレレーターにより分析する。

【００９１】図２：測定容量における粒子数の変動はＦ
ＣＳシグナルＩ（ｔ）を変動させる。 ＦＣＳシグナルの自動相関関数Ｇ（ｔ）から、平均滞留時間τ（＝粒子が測定容量内を通過し拡散する平均時間）および測定容量中に含まれる分子数Ｎを読みとるれる。 τは、蛍光分子の大きさにそのまま比例する。

【００９２】今回は容量が非常に少ないので、そこには平均してわずかの粒子しか存在しない。 拡散が起きるため、容量中の粒子数は平均値Ｎ付近で間断なく変化する。 これは、蛍光強度Ｉ（ｔ）も、その平均値Ｉｍ付近で変動することを意味する。 拡散時間τ（分子の大きさに比例）および蛍光分子数濃度を蛍光の変動から算出できる（図１参照）。

【００９３】ゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）による分子量の測定 分子量の分布（ＭＷＤ）をＧＰＣで測定した。 主要な実験パラメータは： カラム： ＴＳＫゲル、４０００ＳＷＸＬ、２５０・４ｍｍ 移動相： ０.０１Ｍ ＮａＨ ₂ ＰＯ ₄ 、０.１Ｍ Ｎａ ₂ ＳＯ ₄ 、１％ ＳＤＳ ｐＨ： ５.３ 温度： ３０℃ 流速： ０.５ｍｌ／分 検出： ＵＶスペクトロメーター：２２０ｎｍ 物質約０.５ｇを移動相１００ｍｌ中、Ｔ＝６０℃で１
５分撹拌してサンプルを調製した。 このようにして得た混濁溶液を０.２μｍのフィルターを通して濾過し、Ｇ
ＰＣ装置のサンプルループ（約２０μｌ）へ注入した。
水不溶性ゼラチン成分は検出されない。

【００９４】この方法で得られる実測変数は、溶出時間の関数として検出器の強度シグナルに表れる（濃度測定）。 ＧＰＣでは、分子はその流体力学半径ｒＨによって分離される。 大きいｒＨを有する分子は、小さいｒＨ
を有する分子よりも早く溶出される。

【００９５】標準ポリマー（今回：プルランスタンダード、pullulan standards）を使用して得た検量線による溶出図からＭＷＤを計算できる。 [MD Lechner、K. Ge
hrkeおよびEH Nordmeier著”Makromolekulare Chemi
e”第４.３.６.１.章、Birkhaeuser Verlag(1996)参照]。一次近似式、溶出時間ｔＥとプルランスタンダードの分子量Ｍは以下の式で示す比例関係にある： ｔ _Ｅ ∝ ｌｏｇ（Ｍ） （１） ただし、３次多項式でｌｏｇ（Ｍ）に対するｔ _Ｅをプロットすると、データはより正確になる。この多項式の逆数を使用して、ゼラチンの溶出時間からゼラチンの分子量を算出できる。このようにして得た分子量は、決してゼラチンの絶対分子量（たとえばＬＳから得た分子量）
ではなく、単なる相対分子量（ここで使用した標準物質の相対値）である。 ここで注記すべきは、プルランスタンダードを使用したため、溶出図の１２分＜ｔ＜２５分（≡１０ ³ ｇ／モル＜ＭＷ＜１０ ⁷ ｇ／モル）の範囲しか、相対分子量の算出に有用でないことである。 片対数プロット（ｔＥ対ｌｏｇ（Ｍ））であれば、曲線下面積が被検物質量にだいたい比例している[反応式（１）参照]。 溶出図では、不変の総面積を標準化しているので、各物質の曲線下面積−すなわち、物質の特異量−を直接比較できる。

【００９６】観察結果を以下に示す：標識ゼラチンと非標識ゼラチンおよびリシルオキシダーゼとのインキュベート時間を延長すると、それに伴い、ＦＣＳ測定によるτ値（分子の大きさに比例）の低下、同時に蛍光強度（Ｉ、ｋｃｐｓ）の減少（表１、図３）が観察された。

【００９７】加えて、インキュベーション時間の延長と共に、ＧＰＣで確認される高分子ゼラチンの割合が減少した（表２、図４）。

【００９８】ゼラチンはリシルオキシダーゼとのインキュベートにより架橋する。 架橋したタンパクは、水に全く溶解せず、膨潤ゲル粒子となる。 ＦＣＳおよびＧＰＣ
のサンプル調整時に、これらの粒子を遠心分離または濾過操作により除去し、検出されないようにした。

【００９９】ゼラチンのインキュベーション時間の延長に伴い、溶出図において、高分子ゼラチン部分が優先的に消失した。 このことは、架橋が、なんといっても高分子ゼラチン部分に対し、不均等なほど大きい影響を及ぼすことを意味している。 これは統計的根拠をもってしても全く妥当な結果である。 加えて、リシン群の分子量依存的分布もまた、この結果をもたらす原因の一部を担っていると思われる。

【０１００】ＦＣＳ測定で見られたτの減少は、分子量の減少と判断され、これはゲル濾過クロマトグラフィーで直接確認できる。 強度の減少は、生成物を再溶解した際の上清に存在する蛍光粒子の数の減少に起因する。 大きなゼラチン分子の方が、小さな分子よりも高い確率で架橋による影響を受けやすいと考えられる。 さらに、小さい分子は、不溶性部に残留する未架橋の大きなゼラチン分子と比べて、リシルオキシダーゼの働きで確立されたネットワークを、より回避しやすい。

【０１０１】従って、リシルオキシダーゼにより生成するアリシンおよび続いて生成するシッフの塩基の数が、
架橋に十分であることが分かる。

【０１０２】例４ マイクロタイタープレートを用いた、迅速かつ平行して実行できる架橋の実施 ゼラチンを、ｐＨ８.４のホウ酸緩衝液中、１ｍＭ Ｎ
−ヒドロキシサクシンイミド−活性化ビオチンで標識し、ｐＨ７.４の２０ｍＭリン酸緩衝液で数回透析した。 このようにして標識したゼラチンの、アビジンまたはストレプトアビジンへの結合能は、予備実験で確認されている。 ビオチン標識後のゼラチン１０〜１００ｍｇ
／ｍｌはアビジン修飾したビアコアセンサーチップ（Bi
acore sensorchip)表面に結合する。 未標識ゼラチンはこの表面に結合しない。

【０１０３】試験の原理および方法 ゼラチンをマイクロタイタープレートの表面へ吸着した。 次に、ビオチン標識ゼラチンおよび架橋物質／酵素を添加した。 吸着したゼラチンはビオチニル化ゼラチンと架橋する。 洗浄工程の後、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体を使用して、ビオチニル化を検出した。

【０１０４】ｐＨ９.２である、０.１Ｍ ＮａＨＣＯ ₃
中の１％濃度ゼラチン溶液０.４ｍｌをＮＵＮＣマキシソープエライザプレート（MaxiSorp Elisa plates)上に、室温で３時間かけて吸着させた。 続いて、これをＰ
ＢＳ、０.０５％トゥィーン２０（Tween 20)溶液で３回洗浄した。

【０１０５】それからビオチニル化ゼラチンおよび異なる濃度の架橋剤を添加した。 この操作を５ｍＭ ＤＴＴ
および０.１％トゥィーン２０を含むＰＢＳ緩衝液中で実施した。 マイクロタイタープレートを様々な温度と時間でインキュベートした。 次に、未反応材料を除去するため、このプレートを６回洗浄した。

【０１０６】検出の際に、ベーリンガー社製ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼをＰＢＳ、０.１％トゥィーン２０で１：１００００に希釈し、各ウェルに１ｍｌ
づつ添加した。 インキュベーションを新たに室温（約２
３℃）で３０分間実施した。 さらに洗浄工程を経てた後、反応混合物（４２ｍＭテトラメチルベンジジンのＤ
ＭＳＯ溶液０.１ｍｌ、０.１Ｍ酢酸ナトリウム１０ｍ
ｌ、クエン酸でｐＨを４.９に調整）を添加した。 この反応過程により青色の溶液ができる。 ５分後に２Ｍ硫酸０.１ｍｌにより反応を停止させた。 青色は次第に黄色に変化した。 ４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。

【０１０７】例５ リシルオキシダーゼの精製 細胞破砕 −２０℃で保存した後、ピキアパストリスの細胞（約１
８ｍｌ）を解凍し、緩衝液Ａ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１ｍＭエタノールアミン、ｐＨ７.０）で５０ｍｌ
に希釈する。 ガラスビーズ５０ｍｌ、直径０.５ｍｍ、
を添加し、氷中で冷却しながら５０００ｒｐｍで３０分間かけて細胞を破砕した。 破砕後の懸濁液をガーゼで濾過した。 濾液を４℃、８０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した。

【０１０８】イオン交換クロマトグラフィー 上清をＮａＯＨでｐＨ７.０に再調整し、Ｑ−セファロースカラム（Ｑ−Sepharose Fast Flow、ファルマシア、直径５ｃｍ、長さ１３ｃｍ、容量２５０ｍｌ）にのせた。 カラム（コンダクティヴィティー０.７ｍＳ／ｃ
ｍ、５４０ｍｌ）にのせた後、緩衝液Ａ６００ｍｌを流した。 カラムは、緩衝液Ａ１ｌと緩衝液Ｂ（緩衝液Ａに１Ｍ ＮａＣｌを添加したもの）１ｌとの直線勾配（リニアグラジエント）により溶出させた。 活性のある分画を回収した。

【０１０９】分子ふるいクロマトグラフィー 関連分画を１０ｋＤａのオメガフィルターを通して濃縮し、分取用スーパーデックスカラム（ファルマシア、直径２.６ｃｍ、長さ６０ｃｍ、容量３２０ｍｌ）にのせ、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭＮａ
Ｃｌ、１ｍＭエタノールアミン、ｐＨ７.５、流速３ｍ
ｌ／分の条件で分離した。 活性のある分画を回収した。

【０１１０】イオン交換クロマトグラフィー 分子ふるいクロマトグラフィーで得た関連分画を精製し、ＭｏｎｏＱカラム（ファルマシア、ＨＲ５／５）を用いたクロマトグラフィーによりさらに精製した。 緩衝液Ａおよび緩衝液Ｂで勾配（グラジエント）をかけた。
流速１ｍｌ／分、１ｍｌづつで１００フラクションを取った。 リシルオキシダーゼは主要活性タンパクとして溶出された。 このタンパクは、還元条件下のＳＤＳゲルによる検出で、分子量が約１２１０００Ｄａであった。

【０１１１】以下に示す配列が得られた： アミノ−末端配列

【０１１２】

【化６】

【０１１３】トリプシンによるタンパクの切断後に得られたペプチドに対応する配列：

【０１１４】

【化７】

【０１１５】

【表１】

【０１１６】

【表２】

【図面の簡単な説明】

【図１】蛍光相関分光計（＝ＦＣＳ）装置の図である。

【図２】図１のＦＣＳ装置を使用して、平均滞留時間τ
および分子量を導く方法を示す図である。

【図３】インキュベーション時間とτ値あるいは蛍光強度との関係を示すグラフである。

【図４】インキュベーション時間と分子量の関係を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. ⁷識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ２３Ｊ 3/18 Ａ２３Ｊ 3/18 Ａ２３Ｋ 1/16 ３０３ Ａ２３Ｋ 1/16 ３０３Ｆ Ａ２３Ｌ 1/00 Ａ２３Ｌ 1/00 Ｃ Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 ヴォルフガング ベヴェルト ドイツ連邦共和国 フランケンタール ロ ルシャー リング ８ツェー (72)発明者 エリック リュデッケ ドイツ連邦共和国 ムターシュタット ト ーマス−マン−シュトラーセ 27 (72)発明者 ユルゲン クリングラー ドイツ連邦共和国 ムターシュタット ブ ルネンシュトラーセ 31 (72)発明者 ローベルト ヘーガー ドイツ連邦共和国 ハイデルベルク リー グニッツァーシュトラーセ ３