一种抗原特异性浆细胞的筛选方法及其应用 |
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| 申请号 | CN202410417592.0 | 申请日 | 2024-04-09 | 公开(公告)号 | CN118006552A | 公开(公告)日 | 2024-05-10 |
| 申请人 | 暨南大学; | 发明人 | 梁家杰; 唐勇; 滕佩君; 王誉涵; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及 抗体 制备技术领域，提供了 抗原 特异性浆细胞的筛选方法及其应用，其筛选方法依次通过得到双特异抗体、得到 荧光 抗原、获得带有荧光的细胞以及将单个抗原特异性浆细胞分离出来，得到单个抗原特异性浆细胞。本发明中抗原特异性浆细胞的筛选方法依次通过得到双特异抗体、得到荧光抗原、获得带有荧光的细胞以及将单个抗原特异性浆细胞分离出来，不仅可以获取单个抗原特异性浆细胞，且制备成本低，操作简单，筛选时间短。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种抗原特异性浆细胞的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种抗原特异性浆细胞的筛选方法及其应用技术领域背景技术[0002] 单抗（单克隆抗体）具有高特异性和亲和力，现已被广泛应用于病毒感染、肿瘤、自身免疫性疾病、神经系统疾病等疾病的诊断和治疗，而高质量的单抗对于疾病治疗和开发高性能免疫诊断试剂是重中之重。因此，快速、高效的抗体发现技术对于抗体药物的研发以及疾病的诊疗具有重要的意义。 [0003] 浆细胞（Plasma cell，PC）又称抗体分泌细胞（Antibody secreting cell，ASC），其是免疫系统中释放大量抗体的最成熟B细胞，单抗是由单一B细胞克隆产生的高度均一且仅针对某一特定抗原表位的抗体，而抗体是机体由于抗原的刺激由浆细胞分泌产生的，因此直接筛选单个抗原特异性的浆细胞是单抗发现最理想、最直接以及最高效的方式，也是单抗发现技术的核心。 [0004] 此外，机体外周血中浆细胞的数量不多，通常经免疫后约50个抗原特异性浆细胞/10000个浆细胞，因此筛选准确率更高、后续测序和表达成本更低。然而，浆细胞的膜表面没有膜结合抗体，抗体一旦成熟就会分泌出去，而且浆细胞又没有办法在体外长期培养，单细胞分泌的抗体量十分少，分泌的抗体难以被检测到，因此，直接筛选单个抗原特异性的浆细胞十分困难。 [0005] 为了解决筛选单个抗原特异性的浆细胞十分困难的问题，相关技术人员开发了一种捕获二抗的微孔阵列，每个微孔刚好可以容纳单个浆细胞，把浆细胞分布到每个微孔中培养3.5个小时，浆细胞分泌的抗体则被二抗捕获，然后加入偶联荧光染料的抗原进行染色，则强荧光的孔中的浆细胞分泌的抗体性能较好，使用显微操纵台便可把这些浆细胞挑取出来进行测序即可得到抗体序列。 [0006] 另外，相关技术人员还开发了一种基于光镊技术的筛选浆细胞的Beacon®系统，该系统包括一块分隔了很多小腔室的微流控芯片以及一套光镊设备，每个浆细胞被分到每个小腔中培养一段时间，然后通过偶联了抗原的微球以及偶联了荧光的二抗对培养上清进行显色，使用光镊系统对强荧光的腔室中的浆细胞分离出来进行测序即可得到抗体序列。 [0007] 虽然上述两种技术均可以实现单个抗原特异性的浆细胞的筛选，但是每套仪器的成本均较高，且操作复杂，筛选时间长。 发明内容[0008] 本发明提供了一种抗原特异性浆细胞的筛选方法及其应用，旨在解决现有技术筛选单个抗原特异性的浆细胞的成本较高，且操作复杂，筛选时间长的问题。 [0009] 第一方面，本发明提供了一种抗原特异性浆细胞的筛选方法，其包括以下步骤：S1、将待抗种属的特异性抗体与2‑IT溶液进行第一次反应，并对反应后的特异性抗体进行过滤脱盐，使用缓冲液复溶进行过滤脱盐后的特异性抗体； 将待标记的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体与SMCC溶液进行第二次反应，并对反应后的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体进行过滤脱盐，使用缓冲液复溶进行过滤脱盐后的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体； 将复溶后的特异性抗体和复溶后的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体混匀，在低温下反应搅拌混匀得到双特异抗体； S2、使用CB溶液将待标记的抗原稀释成10mg/ml的抗原溶液，并将抗原溶液装入透析袋内；使用CB溶液将荧光素稀释成0.1mg/ml的荧光素溶液；将透析袋封口并浸入荧光素溶液内，进行搅拌；吸取透析袋内的溶液，使用Sephadex G‑25柱层析去除游离荧光素，得到荧光抗原； S3、提取PBMC，加入抗CD16/32的抗体封闭PBMC的Fc受体，进行第一次孵育；将双特异抗体加入第一次孵育后的PBMC中进行反应，并对反应后的所述PBMC进行第一次离心洗涤；将进行第一次离心洗涤后的所述PBMC以10000 1000000个/mL的密度进行培养，并对培~ 养后的所述PBMC进行第二次离心洗涤；将所述荧光抗原和荧光标记的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体进行第二次孵育，并对第二次孵育后的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体进行第三次离心洗涤，获得带有荧光的细胞，带有荧光的细胞即为抗原特异性浆细胞； S4、通过单细胞分离技术将单个抗原特异性浆细胞分离出来，得到单个抗原特异性浆细胞。 [0010] 优选的，所述步骤S1中，所述第一次反应和所述第二次反应分别采用旋转培养器进行；所述待抗种属的特异性抗体和所述待标记的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体的质量均是0.1 mg；所述2‑IT溶液的容积为2μL，浓度为6 mg/mL；第一次反应时旋转培养器的温度为25℃，反应的时间为60min；所述缓冲液为0.05M且pH值为7.0的PBS缓冲液。 [0011] 优选的，所述步骤S1中，所述SMCC溶液的容积为6μL，浓度为7 mg/mL；第二次反应时旋转培养器的温度为25℃，反应的时间为30min；混匀时采用冰箱进行且温度为4℃，混匀时间为18h。 [0012] 优选的，所述步骤S2中，所述CB溶液的浓度为0.025mol/L，pH值为9.0；所述搅拌采用电磁搅拌器进行。 [0013] 优选的，所述步骤S2中，浸入荧光素溶液内时所述荧光素溶液的体积为所述抗原溶液的10倍；将所述透析袋浸入所述荧光素溶液内后，处于4℃的环境下，使用电磁搅拌器进行搅拌，搅拌的时间为18 24h，且所述荧光素溶液装于烧杯内。~ [0014] 优选的，所述步骤S3中，所述抗CD16/32的抗体的质量为2μg；所述第一次孵育和所述第二次孵育的过程均处于4℃的环境下进行，所述第一次孵育的时间为5 10min，所述第~二次孵育的时间为20min；所述培养采用细胞培养箱进行。 [0015] 优选的，所述步骤S3中，将所述荧光抗原和荧光标记的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体进行第二次孵育时，所述荧光抗原和所述荧光标记的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体的质量均为1μg；所述第一次离心洗涤、所述第二次离心洗涤以及所述第三次离心洗涤的次数均为3次。 [0016] 第二方面，本发明提供了一种抗原特异性浆细胞的筛选方法在单克隆抗体制备中的应用，将上述筛选得到的单个抗原特异性浆细胞进行DNA提取、扩增测序，得到特异性单克隆抗体基因，对所述特异性单克隆抗体基因进行重组表达，获取单克隆抗体。 [0017] 第三方面，本发明提供了一种单克隆抗体的获取方法，其包括以下步骤：S1、将待抗种属的特异性抗体与2‑IT溶液进行第一次反应，并对反应后的特异性抗体进行过滤脱盐，使用缓冲液复溶进行过滤脱盐后的特异性抗体； 将待标记的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体与SMCC溶液进行第二次反应，并对反应后的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体进行过滤脱盐，使用缓冲液复溶进行过滤脱盐后的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体； 将复溶后的特异性抗体和复溶后的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体混匀，在低温下反应搅拌混匀得到双特异抗体； S2、使用CB溶液将待标记的抗原稀释成10mg/ml的抗原溶液，并将抗原溶液装入透析袋内；使用CB溶液将荧光素稀释成0.1mg/ml的荧光素溶液；将透析袋封口并浸入荧光素溶液内，进行搅拌；吸取透析袋内的溶液，使用Sephadex G‑25柱层析去除游离荧光素，得到荧光抗原； S3、提取PBMC，加入抗CD16/32的抗体封闭PBMC的Fc受体，进行第一次孵育；将双特异抗体加入第一次孵育后的PBMC中进行反应，并对反应后的所述PBMC进行第一次离心洗涤；将进行第一次离心洗涤后的所述PBMC以10000 1000000个/mL的密度进行培养，并对培~ 养后的所述PBMC进行第二次离心洗涤；将所述荧光抗原和荧光标记的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体进行第二次孵育，并对第二次孵育后的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体进行第三次离心洗涤，获得带有荧光的细胞，带有荧光的细胞即为抗原特异性浆细胞； S4、通过单细胞分离技术将单个抗原特异性浆细胞分离出来，得到单个抗原特异性浆细胞； S5、对单个抗原特异性浆细胞进行DNA提取并进行扩增测序，得到特异性单克隆抗体基因； S6、对所述特异性单克隆抗体基因进行重组表达，获取单克隆抗体。 [0018] 优选的，所述步骤S6完成后，还包括步骤：S7、将所述单克隆抗体进行配对验证。 [0019] 与现有技术相比，本发明中抗原特异性浆细胞的筛选方法依次通过得到双特异抗体、得到荧光抗原、获得带有荧光的细胞以及将单个抗原特异性浆细胞分离出来，从而可以得到单个抗原特异性浆细胞，且其制备成本低，操作简单，筛选时间短。附图说明 [0020] 下面结合附图详细说明本发明。通过结合以下附图所作的详细描述，本发明的上述或其他方面的内容将变得更清楚和更容易理解。附图中：图1是本发明实施例提供的一种抗原特异性浆细胞的筛选方法的流程步骤图； 图2是本发明实施例提供的一种单克隆抗体的获取方法的流程步骤图； 图3是本发明实施例提供的一种单克隆抗体的获取方法的具体原理图； 图4是本发明具体实施例一提供的流式分析图； 图5是本发明具体实施例二提供的流式分析图； 图6是本发明具体实施例三提供的流式分析图； 图7是本发明具体实施例四提供的细胞荧光染色图。 具体实施方式[0021] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。 [0022] 本发明提供了一种抗原特异性浆细胞的筛选方法，结合图1所示，其包括以下步骤：S11、双特异抗体的制备 [0023] 具体地，将待抗种属的特异性抗体与2‑IT溶液进行第一次反应，并对反应后的特异性抗体进行过滤脱盐，使用缓冲液复溶进行过滤脱盐后的特异性抗体。 [0024] 将待标记的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体与SMCC溶液进行第二次反应，并对反应后的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体进行过滤脱盐，使用缓冲液复溶进行过滤脱盐后的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体。 [0025] 将复溶后的特异性抗体和复溶后的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体混匀，在低温下反应搅拌混匀得到双特异抗体。 [0026] 其中，所述第一次反应和所述第二次反应分别采用旋转培养器进行；所述待抗种属的特异性抗体和所述待标记的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体的质量均是0.1 mg；所述2‑IT溶液的容积为2μL，浓度为6 mg/mL；第一次反应时旋转培养器的温度为25℃，反应的时间为60min；所述缓冲液为0.05M且pH值为7.0的PBS缓冲液。 [0027] 所述步骤S1中，所述SMCC溶液的容积为6μL，浓度为7 mg/mL；第二次反应时旋转培养器的温度为25℃，反应的时间为30min；混匀时采用冰箱进行且温度为4℃，混匀时间为18h。 S12、荧光抗原的制备 [0028] 具体地，使用CB溶液将待标记的抗原稀释成10mg/ml的抗原溶液，并将抗原溶液装入透析袋内；使用CB溶液将荧光素稀释成0.1mg/ml的荧光素溶液；将透析袋封口并浸入荧光素溶液内，进行搅拌；吸取透析袋内的溶液，使用Sephadex G‑25柱层析去除游离荧光素，得到荧光抗原。 [0029] 其中，所述CB溶液的浓度为0.025mol/L，pH值为9.0；所述搅拌采用电磁搅拌器进行。 [0030] 浸入荧光素溶液内时所述荧光素溶液的体积为所述抗原溶液的10倍；将所述透析袋浸入所述荧光素溶液内后，处于4℃的环境下，使用电磁搅拌器进行搅拌，搅拌的时间为18 24h，且所述荧光素溶液装于烧杯内。 ~ S13、浆细胞的荧光染色 [0031] 具体地，提取PBMC，加入抗CD16/32的抗体封闭PBMC的Fc受体，进行第一次孵育；将双特异抗体加入第一次孵育后的PBMC中进行反应，并对反应后的所述PBMC进行第一次离心洗涤；将进行第一次离心洗涤后的所述PBMC以10000 1000000个/mL的密度进行培养，并对~培养后的所述PBMC进行第二次离心洗涤；将所述荧光抗原和荧光标记的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体进行第二次孵育，并对第二次孵育后的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体进行第三次离心洗涤，获得带有荧光的细胞，带有荧光的细胞即为抗原特异性浆细胞。 [0032] 其中，所述抗CD16/32的抗体的质量为2μg；所述第一次孵育和所述第二次孵育的过程均处于4℃的环境下进行，所述第一次孵育的时间为5 10min，所述第二次孵育的时间~为20min；所述培养采用细胞培养箱进行。 [0033] 将所述荧光抗原和荧光标记的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体进行第二次孵育时，所述荧光抗原和所述荧光标记的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体的质量均为1μg；所述第一次离心洗涤、所述第二次离心洗涤以及所述第三次离心洗涤的次数均为3次。 [0034] 所述荧光标记的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体为除了步骤S11中的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体的其它种类。如抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体包括CD38、CD138、B220等，若过滤脱盐后的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体为其中一种（如CD38），而此处所说的所述荧光标记的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体为除去过滤脱盐后的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体之外的针对其它表面蛋白的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体（如CD138）。S14、浆细胞的分离 [0035] 具体地，通过单细胞分离技术将单个抗原特异性浆细胞分离出来，得到单个抗原特异性浆细胞。 [0036] 本发明中抗原特异性浆细胞的筛选方法依次通过得到双特异抗体、得到荧光抗原、获得带有荧光的细胞以及将单个抗原特异性浆细胞分离出来，从而可以得到单个抗原特异性浆细胞，且其制备成本低，操作简单，筛选时间短。 [0037] 本发明提供了一种单克隆抗体的获取方法，结合图2所示，其包括以下步骤：S21、双特异抗体的制备 [0038] 具体地，将待抗种属的特异性抗体与2‑IT溶液进行第一次反应，并对反应后的特异性抗体进行过滤脱盐，使用缓冲液复溶进行过滤脱盐后的特异性抗体；将待标记的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体与SMCC溶液进行第二次反应，并对反应后的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体进行过滤脱盐，使用缓冲液复溶进行过滤脱盐后的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体； 将复溶后的特异性抗体和复溶后的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体混匀，在低温下反应搅拌混匀得到双特异抗体； S22、荧光抗原的制备 [0039] 具体地，使用CB溶液将待标记的抗原稀释成10mg/ml的抗原溶液，并将抗原溶液装入透析袋内；使用CB溶液将荧光素稀释成0.1mg/ml的荧光素溶液；将透析袋封口并浸入荧光素溶液内，进行搅拌；吸取透析袋内的溶液，使用Sephadex G‑25柱层析去除游离荧光素，得到荧光抗原；S23、浆细胞的荧光染色 [0040] 具体地，提取PBMC，加入抗CD16/32的抗体封闭PBMC的Fc受体，进行第一次孵育；将双特异抗体加入第一次孵育后的PBMC中进行反应，并对反应后的所述PBMC进行第一次离心洗涤；将进行第一次离心洗涤后的所述PBMC以10000 1000000个/mL的密度进行培养，并对~培养后的所述PBMC进行第二次离心洗涤；将所述荧光抗原和荧光标记的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体进行第二次孵育，并对第二次孵育后的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体进行第三次离心洗涤，获得带有荧光的细胞，带有荧光的细胞即为抗原特异性浆细胞； S24、浆细胞的分离 [0041] 具体地，通过单细胞分离技术将单个抗原特异性浆细胞分离出来，得到单个抗原特异性浆细胞；S25、单细胞的扩增与测序 [0042] 具体地，对单个抗原特异性浆细胞（阳性细胞）进行DNA提取并进行扩增测序，得到特异性单克隆抗体基因。S26、抗体基因表 [0043] 具体地，对所述特异性单克隆抗体基因进行重组表达，获取单克隆抗体。 [0044] 本发明中单克隆抗体的获取方法在所述抗体基因表达的过程完成后，还包括步骤：S26、抗体验证，具体为将所述单克隆抗体进行配对验证。 [0045] 以上步骤S21‑S24分别与上述抗原特异性浆细胞的筛选方法的步骤S11‑S14相同，且具体内容一致，在此不作赘述。 [0046] 本发明中单克隆抗体的获取方法的基本原理为：通过双特异性抗体偶联技术，把抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体与抗种属特异性抗体偶联起来，与动物的免疫组织或外周血中提取的B细胞共培养，相当于把抗种属特异性抗体锚定到细胞膜表面，浆细胞分泌的抗体会被膜上抗种属特异性抗体捕获并富集，加入荧光抗原后即可对抗原特异性的浆细胞进行荧光染色，即带有荧光的细胞为抗原特异性浆细胞，最后通过单细胞分离技术把单个抗原特异性浆细胞分离出来，进行抗体可变区测序获得抗体基因，经过体外表达即可得到抗原特异性的单克隆抗体。因为只需要把双特异性抗体偶联即可，无需额外的柱子或微孔阵列芯片等昂贵耗材，所以成本低；因为只需要在培养基中进行简单培养孵育即可，所以操作简单；因为该方法相当于把分泌的抗体富集在细胞膜表面，体积比分泌到上清中大大减少，因此分泌时间只需要半小时即可达到检测的浓度，所以筛选时间短。 [0047] 具体原理为：通过双特异性抗体从动物组织（如小鼠脾脏、兔子脾脏等）或者外周血（如小鼠外周血、兔子外周血、人外周血等）中筛选抗原特异性浆细胞，并通过单细胞分离技术把单个抗原特异性浆细胞分离出来，随后通过单细胞抗体基因测序技术获得抗体基因，经过表达制备抗原特异性的单克隆抗体。双特异性抗体一端为抗浆细胞特异的表面标记分子（如CD38、CD138、CD27等）的抗体，另一端为抗种属特异性抗体；具体原理如图3所示，双特异性抗体一端为抗浆细胞特异的表面标记分子（如CD38、CD138、CD27等）的抗体，另一端为抗种属特异性抗体。其中抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体可以与浆细胞特异的表面标记分子结合，使得双特异性抗体锚定在浆细胞上。经过一段时间的孵育，浆细胞分泌的抗体会被膜上抗种属特异性抗体捕获并富集。加入荧光抗原后即可对抗原特异性的浆细胞进行荧光染色，即带有荧光的细胞为抗原特异性浆细胞，最后通过单细胞分离技术把单个抗原特异性浆细胞分离出来，进行抗体可变区测序获得抗体基因，经过体外表达即可得到抗原特异性的单克隆抗体。 [0048] 本发明另外提出了一种抗原特异性浆细胞的筛选方法在单克隆抗体制备中的应用，具体是将上述筛选得到的单个抗原特异性浆细胞进行DNA提取、扩增测序，得到特异性单克隆抗体基因，对所述特异性单克隆抗体基因进行重组表达，获取单克隆抗体。 [0049] 本发明中单克隆抗体的获取方法依次通过得到双特异抗体、得到荧光抗原、获得带有荧光的细胞、得到单个抗原特异性浆细胞、得到特异性单克隆抗体基因以及对所述特异性单克隆抗体基因进行重组表达，从而可以获取单克隆抗体，且制备成本低，操作简单，筛选时间短。 [0050] 为了能更好的体现本发明单克隆抗体的获取方法，以下将举出四个具体实施例进行说明：具体实施例一 本具体实施例以浆细胞特异的表面标记分子CD38为锚定点，通过流式细胞术从小鼠脾脏中获得抗原特异性浆细胞，并获取抗体基因并表达抗体。具体步骤如下： 1、双特异抗体的制备 [0051] 取质量为0.1 mg的山羊抗小鼠IgG Fc加入质量为2μL浓度为6mg/mL的2‑IT溶液，并置于旋转培养器上处于25℃的环境下反应60 min；再将反应后的山羊抗小鼠IgG Fc进行超滤脱盐，然后使用0.05M且 pH值为 7.0的 PBS缓冲液复溶脱盐后的山羊抗小鼠IgG Fc；之后取质量为0.1 mg的待大鼠抗小鼠CD38加入质量为6 μL浓度为7 mg/mL 的SMCC溶液中混匀，并置于旋转培养器上处于25℃的环境下反应30 min；再将反应后的大鼠抗小鼠CD38进行超滤脱盐，然后使用0.05M且pH值为 7.0 的PBS缓冲液复溶脱盐后的大鼠抗小鼠CD38； 最后取脱盐后的山羊抗小鼠IgG Fc和脱盐后的大鼠抗小鼠CD38混合均匀，并在4℃环境下的冰箱反应搅拌混匀18h后得到双特异性抗体。 2、荧光抗原的制备 [0052] 用浓度为0.025mol/L、pH值为9.0 的CB将待标记的新冠N蛋白稀释成浓度为10mg/ml的溶液，装入透析袋内，将口袋扎紧，仅留少许空隙；再用相同的CB将FITC配成浓度为0.1mg/ml的溶液，需要量为新冠N蛋白溶液体积的10倍，并盛于烧杯内；之后将透析袋浸没于FITC液内，放入4℃的环境下，并在电磁搅拌器缓慢搅拌下结合18‑24h后取出，标记过程即告完成；最后吸取透析袋内的结合物，用Sephadex G‑25柱层析去除游离FITC，获得荧光抗原。 3、浆细胞荧光染色 [0053] 用梯度离心法从小鼠脾脏细胞中提取PBMC，加入质量为2μg的CD16/32抗体封闭PBMC的Fc受体，并在4℃的环境下孵育5 10min；再将质量为0.5μg的双特异抗体加入PBMC~中，在4℃的环境下反应30min，并离心洗涤三次；之后将洗涤后的细胞以10000个/mL的密度在细胞培养箱中进行培养2h，并离心洗涤三次；再加入质量为0.5μg 的APC‑大鼠抗小鼠B220和质量为1μg的荧光抗原，处于4℃的环境下孵育20min，并离心洗涤三次；最后加入质量为300μL 的MACS Buffer复溶，并加入5μL的7AAD，置于44℃的环境下，避光备用。 4、浆细胞分离 [0054] 将处理好的样品进行流式分选，分离收集7AAD‑、B220‑、Fluor®488+细胞群（Q1区），流式分析图如图4所示。5、单细胞扩增与测序 [0055] 对上述分选的阳性浆细胞分别进行DNA提取，并进行扩增测序，得到特异性单克隆抗体基因。6、抗体基因表达 [0056] 对获得的抗体基因进行重组表达。7、抗体验证 [0057] 将表达的抗体进行配对验证。具体实施例二 [0058] 本具体实施例以浆细胞特异的表面标记分子CD138为锚定点，通过流式细胞术从小鼠脾脏中获得抗原特异性浆细胞，并获取抗体基因并表达抗体。具体步骤如下：1、双特异抗体的制备 [0059] 取质量为0.1 mg的山羊抗小鼠IgG Fc加入质量为2μL浓度为6mg/mL的2‑IT溶液，并置于旋转培养器上处于25℃的环境下反应60 min；再将反应后的山羊抗小鼠IgG Fc进行超滤脱盐，然后使用0.05M且 pH值为 7.0的 PBS缓冲液复溶脱盐后的山羊抗小鼠IgG Fc；之后取质量为0.1 mg的待大鼠抗小鼠CD138加入质量为6 μL浓度为7 mg/mL 的SMCC溶液中混匀，并置于旋转培养器上处于25℃的环境下反应30 min；再将反应后的大鼠抗小鼠CD138进行超滤脱盐，然后使用0.05M且pH值为 7.0 的PBS缓冲液复溶脱盐后的大鼠抗小鼠CD138；最后取脱盐后的山羊抗小鼠IgG Fc和脱盐后的大鼠抗小鼠CD138混合均匀，并在4℃环境下的冰箱反应搅拌混匀18h后得到双特异性抗体。 2、荧光抗原的制备 [0060] 用浓度为0.025mol/L、pH值为9.0 的CB将待标记的新冠N蛋白稀释成浓度为10mg/ml的溶液，装入透析袋内，将口袋扎紧，仅留少许空隙；再用相同的CB将FITC配成浓度为0.1mg/ml的溶液，需要量为新冠N蛋白溶液体积的10倍，并盛于烧杯内；之后将透析袋浸没于FITC液内，放入4℃的环境下，并在电磁搅拌器缓慢搅拌下结合18‑24h后取出，标记过程即告完成；最后吸取透析袋内的结合物，用Sephadex G‑25柱层析去除游离FITC，获得荧光抗原。 3、浆细胞荧光染色 [0061] 用梯度离心法从小鼠脾脏细胞中提取PBMC，加入质量为2μg的CD16/32抗体封闭PBMC的Fc受体，并在4℃的环境下孵育5 10min；再将质量为0.5μg的双特异抗体加入PBMC~中，在4℃的环境下反应30min，并离心洗涤三次；之后将洗涤后的细胞以10000个/mL的密度在细胞培养箱中进行培养2h，并离心洗涤三次；再加入质量为0.5μg 的APC‑大鼠抗小鼠B220和质量为1μg的荧光抗原，处于4℃的环境下孵育20min，并离心洗涤三次；最后加入质量为300μL 的MACS Buffer复溶，并加入5μL的7AAD，置于44℃的环境下，避光备用。 4、浆细胞分离 [0062] 将处理好的样品进行流式分选，分离收集7AAD‑、B220‑、Fluor®488+细胞群（Q1区），流式分析图如图5所示。5、单细胞扩增与测序 [0063] 对上述分选的阳性浆细胞分别进行DNA提取，并进行扩增测序，得到特异性单克隆抗体基因。6、抗体基因表达 [0064] 对获得的抗体基因进行重组表达。7、抗体验证 [0065] 将表达的抗体进行配对验证。具体实施例三 [0066] 本具体实施例以浆细胞特异的表面标记分子CD138为锚定点，通过流式细胞术从人外周血中获得抗原特异性浆细胞，并获取抗体基因并表达抗体。具体步骤如下：1、双特异抗体的制备 [0067] 取质量为0.1 mg的山羊抗人IgG Fc加入质量为2μL浓度为6mg/mL的2‑IT溶液，并置于旋转培养器上处于25℃的环境下反应60 min；再将反应后的山羊抗人IgG Fc进行超滤脱盐，然后使用0.05M且 pH值为 7.0的 PBS缓冲液复溶脱盐后的山羊抗人IgG Fc；之后取质量为0.1 mg的待大鼠抗人CD138加入质量为6 μL浓度为7 mg/mL 的SMCC溶液中混匀，并置于旋转培养器上处于25℃的环境下反应30 min；再将反应后的大鼠抗人CD138进行超滤脱盐，然后使用0.05M且pH值为 7.0 的PBS缓冲液复溶脱盐后的大鼠抗人CD138；最后取脱盐后的山羊抗人IgG Fc和脱盐后的大鼠抗人CD138混合均匀，并在4℃环境下的冰箱反应搅拌混匀18h后得到双特异性抗体。2、荧光抗原的制备 [0068] 用浓度为0.025mol/L、pH值为9.0 的CB将待标记的新冠N蛋白稀释成浓度为10mg/ml的溶液，装入透析袋内，将口袋扎紧，仅留少许空隙；再用相同的CB将FITC配成浓度为0.1mg/ml的溶液，需要量为新冠N蛋白溶液体积的10倍，并盛于烧杯内；之后将透析袋浸没于FITC液内，放入4℃的环境下，并在电磁搅拌器缓慢搅拌下结合18‑24h后取出，标记过程即告完成；最后吸取透析袋内的结合物，用Sephadex G‑25柱层析去除游离FITC，获得荧光抗原。 3、浆细胞荧光染色 [0069] 用梯度离心法从人外周血细胞中提取PBMC，加入质量为2μg的CD16/32抗体封闭PBMC的Fc受体，并在4℃的环境下孵育5 10min；再将质量为0.5μg的双特异抗体加入PBMC~中，在4℃的环境下反应30min，并离心洗涤三次；之后将洗涤后的细胞以10000个/mL的密度在细胞培养箱中进行培养2h，并离心洗涤三次；再加入质量为0.5μg 的APC‑大鼠抗人B220和质量为1μg的荧光抗原，处于4℃的环境下孵育20min，并离心洗涤三次；最后加入质量为 300μL 的MACS Buffer复溶，并加入5μL的7AAD，置于44℃的环境下，避光备用。 4、浆细胞分离 [0070] 将处理好的样品进行流式分选，分离收集7AAD‑、B220‑、Fluor®488+细胞群（Q1区），流式分析图如图6所示。5、单细胞扩增与测序 [0071] 对上述分选的阳性浆细胞分别进行DNA提取，并进行扩增测序，得到特异性单克隆抗体基因。6、抗体基因表达 [0072] 对获得的抗体基因进行重组表达。7、抗体验证 [0073] 将表达的抗体进行配对验证。具体实施例四 [0074] 本具体实施例以浆细胞特异的表面标记分子CD138为锚定点，单细胞显微操作从小鼠脾脏中获得抗原特异性浆细胞，并获取抗体基因并表达抗体。具体步骤如下：1、双特异抗体的制备。 [0075] 取质量为0.1 mg的山羊抗小鼠IgG Fc加入质量为2μL浓度为6mg/mL的2‑IT溶液，并置于旋转培养器上处于25℃的环境下反应60 min；再将反应后的山羊抗小鼠IgG Fc进行超滤脱盐，然后使用0.05M且 pH值为 7.0的 PBS缓冲液复溶脱盐后的山羊抗小鼠IgG Fc；之后取质量为0.1 mg的待大鼠抗小鼠CD138加入质量为6 μL浓度为7 mg/mL 的SMCC溶液中混匀，并置于旋转培养器上处于25℃的环境下反应30 min；再将反应后的大鼠抗小鼠CD138进行超滤脱盐，然后使用0.05M且pH值为 7.0 的PBS缓冲液复溶脱盐后的大鼠抗小鼠CD138；最后取脱盐后的山羊抗小鼠IgG Fc和脱盐后的大鼠抗小鼠CD138混合均匀，并在4℃环境下的冰箱反应搅拌混匀18h后得到双特异性抗体。 2、荧光抗原的制备 [0076] 用浓度为0.025mol/L、pH值为9.0 的CB将待标记的新冠N蛋白稀释成浓度为10mg/ml的溶液，装入透析袋内，将口袋扎紧，仅留少许空隙；再用相同的CB将FITC配成浓度为0.1mg/ml的溶液，需要量为新冠N蛋白溶液体积的10倍，并盛于烧杯内；之后将透析袋浸没于FITC液内，放入4℃的环境下，并在电磁搅拌器缓慢搅拌下结合18‑24h后取出，标记过程即告完成；最后吸取透析袋内的结合物，用Sephadex G‑25柱层析去除游离FITC，获得荧光抗原。 3、浆细胞荧光染色 [0077] 用梯度离心法从小鼠脾脏细胞中提取PBMC，加入质量为2μg的CD16/32抗体封闭PBMC的Fc受体，并在4℃的环境下孵育5 10min；再将质量为0.5μg的双特异抗体加入PBMC~中，在4℃的环境下反应30min，并离心洗涤三次；之后将洗涤后的细胞以10000个/mL的密度在细胞培养箱中进行培养2h，并离心洗涤三次；再加入质量为0.5μg 的APC‑大鼠抗小鼠B220和质量为1μg的荧光抗原，处于4℃的环境下孵育20min，并离心洗涤三次；最后加入质量为300μL 的MACS Buffer复溶，并加入5μL的7AAD，置于44℃的环境下，避光备用。 4、浆细胞分离 [0079] 对上述分选的阳性浆细胞分别进行DNA提取，并进行扩增测序，得到特异性单克隆抗体基因。6、抗体基因表达 [0080] 对获得的抗体基因进行重组表达。7、抗体验证 [0081] 将表达的抗体进行配对验证。 [0082] 需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。 [0083] 上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式用等同变化，均属于本发明的保护之内。 |
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