一种促进牛卵胞浆内单精子注射效率的制剂及方法 |
|||||||
| 申请号 | CN202410203760.6 | 申请日 | 2024-02-23 | 公开(公告)号 | CN118006544A | 公开(公告)日 | 2024-05-10 |
| 申请人 | 山东奥克斯畜牧种业有限公司; 山东省农业科学院畜牧兽医研究所; 中垦华山牧业有限公司; 北大荒农垦集团有限公司牡丹江分公司; | 发明人 | 张燕; 肖遥; 马庆涛; 王玲玲; 高运东; 王先胜; 张毕红; 邓清涛; 姜明; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种促进 牛 卵胞浆内单精子注射 效率的制剂及方法，包括如下步骤：将精子加入预热的受精液中，激活后，采用所述精子去膜剂去膜，得到预处理后的精子；将卵母细胞的外层颗粒细胞剥除后，放入所述注射卵恢复液的平衡好的微滴中；然后在卵子及胚胎操作液中，将所述预处理后的精子注射进入剥除外层颗粒细胞的卵母细胞中；将成功进行ICSI后的卵母细胞在注射卵恢复液中恢复设定时间；将恢复后的卵母细胞转移至注射卵激活液中处理设定时间；将激活后的卵母细胞进行胚胎培养，即可提高牛卵母细胞ICSI操作的囊胚形成率。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种促进牛卵胞浆内单精子注射效率的制剂，其特征在于：至少包括精子去膜剂、精子激活剂、注射卵激活液和注射卵恢复液； |
||||||
| 说明书全文 | 一种促进牛卵胞浆内单精子注射效率的制剂及方法技术领域[0001] 本发明属于牛ICSI技术领域，具体涉及一种促进牛卵胞浆内单精子注射效率的制剂及方法，利用本发明所涉及的方法对牛卵母细胞进行ICSI操作，能显著卵母细胞的卵裂率及最终的囊胚率。 背景技术[0002] 这里的陈述仅提供与本发明相关的背景技术，而不必然地构成现有技术。 [0003] 二代试管婴儿技术即卵胞浆内单精子注射(ICSI)技术是指借助显微操作的方法将单个精子注射到成熟卵母细胞胞浆内，实现精子和卵母细胞体外辅助受精目的的技术，ICSI操作跨越了精子运动、顶体酶释放、颗粒细胞消化、精卵结合、透明带反应等一系列自然条件下的受精步骤，特别是大大降低了对于精子数量的要求(从百万的数量级降低到个位数)，用极少量的正常精子即可完成受精过程。 [0004] 尽管该项技术已经在人及其它多种动物中得到成功应用，但是对于在牛中的应用，囊胚形成率依旧较为低下。 发明内容[0005] 针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种促进牛卵胞浆内单精子注射效率的制剂及方法，利用其中的精子激动剂及精子去膜剂对注射用精子进行处理，利用注射卵激活液及注射卵恢复液对ICSI后的卵母细胞进行处理，能提高牛卵母细胞ICSI操作的囊胚形成率。 [0006] 为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现： [0007] 第一方面，本发明提供一种促进牛卵胞浆内单精子注射效率的制剂，至少包括精子去膜剂、精子激活剂、注射卵激活液和注射卵恢复液； [0008] 精子去膜剂中包括受精液和Triton X‑100，Triton X‑100的体积百分数为0.1‑1％； [0010] 所述注射卵恢复液中，以TCM199为基础液，其中添加有胎牛血清(FBS)。 [0011] 发明人经过实验发现，牛的ICSI的效率十分低下的原因在于精子注射后的卵子无法成功激活，包括精子不能进行正常的核降解、不能正常形成原核、微管组织中心功能不正常、不能引起卵母细胞激活所需的钙震荡等。 [0012] Triton X‑100是一种比较温和的去垢剂(表面活性剂)，可以提高细胞膜的通透性，Triton X‑100能有效去除精子膜，使精子染色质充分暴露于卵母细胞胞质中，促进雄原核的形成，使精子来源的卵母细胞激活因子更易进入卵母细胞的细胞质，更有利于卵母细胞激活。 [0013] 乙醇用于对经过ICSI的卵母细胞进行激活，激活后的ICSI胚胎才能像正常受精的胚胎一样进行卵裂，进而发育到囊胚阶段。 [0014] 胎牛血清为胚胎发育提供激素及含量微小的营养物，提高ICSI后卵的发育率。 [0015] 在一些实施例中，精子去膜剂中，Triton X‑100的体积百分数为0.1‑0.5％。 [0016] 优选的，精子去膜剂中，Triton X‑100的体积百分数为0.1‑0.3％。 [0017] 在一些实施例中，所述制剂还包括精子激活剂，精子激活剂的组分包括受精液、亚牛磺酸、青霉胺和肾上腺素，其中，亚牛磺酸的浓度为0.2‑0.3mM，青霉胺的浓度为0.4‑0.6mM，肾上腺素的浓度为20‑30μM。 [0018] 在一些实施例中，所述注射卵激活液以TCM199为基础液，其中添加体积百分数为5‑8％的乙醇。 [0019] 优选的，注射卵激活液中，乙醇的体积百分数为7％。 [0020] 优选的，所述注射卵恢复液以TCM199为基础液，其中添加体积百分数为8％‑12％的FBS。 [0021] 第二方面，本发明提供一种促进牛卵胞浆内单精子注射效率的方法，包括如下步骤： [0022] 将精子加入预热的受精液中，激活后，采用所述精子去膜剂去膜，得到预处理后的精子； [0023] 将卵母细胞的外层颗粒细胞剥除后，放入所述注射卵恢复液的平衡好的微滴中； [0024] 然后在卵子及胚胎操作液中，将所述预处理后的精子注射进入剥除外层颗粒细胞的卵母细胞中； [0025] 将成功进行ICSI后的卵母细胞在注射卵恢复液中恢复设定时间； [0026] 将恢复后的卵母细胞转移至注射卵激活液中处理设定时间； [0027] 将激活后的卵母细胞进行胚胎培养，即可。 [0028] 在一些实施例中，成功进行ICSI后的卵母细胞在注射卵恢复液中恢复的时间为3‑5h。 [0029] 在一些实施例中，将恢复后的卵母细胞转移至注射卵激活液中处理的时间为3‑10min。 [0030] 上述本发明的一种或多种实施例取得的有益效果如下： [0033] 图1为本发明所涉及ICSI操作盘的制作方法及卵母细胞在操作盘中的放置位置说明； [0034] 图2为ICSI前卵母细胞图(极体位于12点钟，单精子注射针内吸取有1枚注射用精子)； [0035] 图3为ICSI过程中卵母细胞图(极体位于12点钟，穿刺位置位于3点钟，利用注射针的推力将精子慢慢注入卵母细胞)。 具体实施方式[0036] 应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。 [0037] 下面结合实施例对本发明作进一步说明。 [0038] 实施例1 [0039] 本实施例的基本仪器配置如下： [0040] 倒置显微镜(用于观察ICSI操作过程)；显微操作仪(用于进行ICSI操作)；手动油压式显微注射仪(用于固定待注射的卵母细胞)；手动气压式显微注射仪(用于对卵母细胞进行单精子注射)。 [0041] 所需耗材如下： [0042] 90mm细胞培养皿若干(制备ICSI操作盘，进行各种相关操作)；毛细玻璃管若干(100mm×1mm×0.8mm)。 [0043] 所需试剂如下： [0044] 1、精子处理液的制备方法为：所述精子处理液为包含112mM氯化钠、4.02mM氯化钾、2.25mM二水氯化钙、0.83mM一水磷酸二氢钠、0.52mM六水氯化镁、37mM碳酸氢钠、1.25mM丙酮酸钠、10μg/mL肝素钠、10mM咖啡因、4mg/mL牛血清白蛋白的水溶液。 [0045] 2、受精液的制备方法为：所述受精液为含112mM氯化钠、4.02mM氯化钾、2.25mM二水氯化钙、0.83mM一水磷酸二氢钠、0.52mM六水氯化镁、37mM碳酸氢钠、1.25mM丙酮酸钠、10μg/mL肝素钠、4mg/mL牛血清白蛋白的水溶液； [0046] 3、精子激活剂的制备方法为：所述精子激活剂以受精液为基础液，添加0.25mM亚牛磺酸、0.5mM青霉胺、25μM肾上腺素； [0047] 4、卵子及胚胎操作液：所述卵子及胚胎操作液以市售商业化TCM199(Gibco，12350039为基础液，添加0.1g/L牛血清白蛋白； [0048] 5、胚胎培养液：所述胚胎培养液为包含109.5mM氯化钠、3.1mM氯化钾、26.2mM碳酸氢钠、0.8mM六水氯化镁、1.19mM磷酸二氢钾、0.4mM丙酮酸钠、1.5mM葡萄糖、5mM半乳糖酸钙、6mg/mL牛血清白蛋白、20μL/mL必需氨基酸、10μL/mL非必需氨基酸、0.15mg/mL谷氨酰胺的水溶液。 [0049] 6、Sigma M5310(用于制备ICSI操作盘，进行各种相关操作)。 [0050] 具体工艺步骤 [0051] 一种能提高卵胞浆内单精子注射(ICSI)效率的方法，包括以下步骤： [0052] (1)ICSI操作针的制备： [0053] 固定针的制备：制备内径在20μm，且经过30度打弯的固定针； [0054] 单精子注射针的制备：制备内径在5μm，且经过30度打弯的单精子注射针； [0055] 将固定针及单精子注射针安装到显微操作仪上，并调节水平； [0056] (2)精子制备： [0057] 1)使用37℃的水浴锅解冻2支精液； [0058] 2)将解冻后精液加入到4ml预热的精子处理液中； [0059] 3)400g离心5分钟； [0060] 4)离心结束，去上清，向下层精子沉淀中加入2ml预热的精子处理液； [0061] 5)400g离心5分钟； [0062] 6)离心结束，去上清，剩余约0.4ml精子沉淀； [0063] 7)将精子沉淀加入预热的受精液中，并在受精液中加入3％的精子激活剂(v/v)； [0065] (3)卵母细胞制备： [0066] 1)成熟22小时后的卵母细胞，放入卵子及胚胎操作液中，用内径为145μm的剥卵针剥除卵母细胞外层的颗粒细胞； [0067] 2)将卵母细胞放入卵子及胚胎操作液做的微滴中。 [0068] (4)ICSI操作盘的制备： [0069] 1)用卵子及胚胎操作液在直径为90mm大皿上做微滴，微滴位置及形状如图1：用25μl卵子及胚胎操作液做十字型液滴； [0070] 2)微滴表面盖油。 [0071] (5)ICSI操作： [0072] 1)取2μl激活后精子加入ICSI操作盘的微滴中； [0073] 2)将待进行ICSI的卵子加入ICSI操作盘中的十字型微滴中部； [0074] 3)用单精子注射针在操作盘底部吸取1枚精子； [0075] 4)利用固定针的抽吸作用，在9点钟位置将卵母细胞轻轻固定； [0076] 5)用单精子注射针拨动胚胎，使极体位于12点或6点方向； [0077] 6)利用单精子注射针尖部穿过透明带，进入卵母细胞胞质内，利用注射针的推力将精子慢慢注入卵母细胞； [0078] 7)稍作停顿，缓慢退出注射针； [0079] 8)将成功进行ICSI的卵母细胞放置在十字型液滴的上部，将没有极体、未成功进行ICSI的卵母细胞放置在十字型液滴的下部。 [0080] (6)胚胎培养： [0081] 1)将成功进行ICSI后的卵母细胞移入胚胎培养液中，放入38.8度、5‑7％二氧化碳、5‑7％氧气的饱和湿度环境中培养； [0082] 2)第7天，统计胚胎发育情况，数据分析结果见表1。 [0083] 为了验证本发明中精子激活剂的效果，设置对比例进行对比，具体如下： [0084] 对比例1 [0085] 参照实施例1的方法对牛卵母细胞进行ICSI操作，不同的是所注射用精子未用精子激活剂处理。 [0086] 对比例2 [0087] 参照实施例1的方法对牛卵母细胞进行ICSI操作，不同的是所用精子激活剂为以受精液为基础液，添加25mM咖啡因的溶液。 [0088] 对比例3 [0089] 参照实施例1的方法对牛卵母细胞进行ICSI操作，不同的是所用精子激活剂为以受精液为基础液，添加25μM A23187的溶液。 [0090] 表1 [0091] [0092] [0093] 表中的指标说明： [0094] 使用精子激活剂对ICSI用精子进行处理，能提高ICSI后卵母细胞的卵裂率及囊胚率；使用本发明涉及的精子激活剂对ICSI用精子进行处理，与常规精子激活剂(咖啡因、A23187)相比，能提高ICSI后卵母细胞的卵裂率及囊胚率。 [0095] 实施例2 [0096] 本实施例的基本仪器配置如下： [0097] 倒置显微镜(用于观察ICSI操作过程)；显微操作仪(用于进行ICSI操作)；手动油压式显微注射仪(用于固定待注射的卵母细胞)；手动气压式显微注射仪(用于对卵母细胞进行单精子注射)。 [0098] 所需耗材如下： [0099] 90mm细胞培养皿若干(制备ICSI操作盘，进行各种相关操作)；毛细玻璃管若干(100mm×1mm×0.8mm)。 [0100] 所需试剂如下： [0101] 精子处理液、受精液、精子激活剂、卵子及胚胎操作液、胚胎培养液、Sigma M5310，同实施例1。 [0102] 精子去膜剂的制备方法为：所述精子去膜剂以受精液为基础液，添加0.2％ Triton X‑100(v/v)。 [0103] 具体工艺步骤 [0104] 一种能提高卵胞浆内单精子注射(ICSI)效率的方法，包括以下步骤： [0105] (1)ICSI操作针的制备，同实施例1： [0106] (2)精子制备： [0107] 步骤1)‑8)同实施例1。 [0108] 9)取上层0.4ml激活后精子加入等体积的精子去膜剂中，涡旋1分钟； [0109] 10)400g离心5分钟； [0110] 11)取下层沉淀加入1ml受精液中，400g离心5分钟； [0111] 12)取下层沉淀加入0.2ml受精液中，放入38.8度、5‑7％二氧化碳的饱和湿度环境待用。 [0112] (3)卵母细胞制备，同实施例1。 [0113] (4)ICSI操作盘的制备，同实施例1。 [0114] (5)ICSI操作： [0115] 1)取2μl精子去膜剂处理后的精子加入ICSI操作盘的微滴中； [0116] 2)将待注射卵子加入ICSI操作盘中的十字型微滴中部； [0117] 步骤3)‑8)同实施例1)。 [0118] (6)胚胎培养，同实施例1，数据分析结果见表2。 [0119] 为了验证本发明中精子去膜剂的效果，设置对比例进行对比，具体如下： [0120] 对比例4 [0121] 参照实施例1的方法对牛卵母细胞进行ICSI操作，不同的是所用精子经过激活剂处理后，不经过精子去膜剂处理，而是通过常规的单精子注射针按压精子尾部制动的方法处理后注射到卵母细胞内。 [0122] 表2 [0123] [0124] 表2中的指标说明： [0125] 对ICSI待注射精子使用精子激活剂处理后，注射前使用精子去膜剂处理比使用常规的单精子注射针按压精子尾部制动的方法能获得更多的卵裂的卵母细胞及囊胚，且经过去膜剂处理后精子活动能力明显下降，显著降低了单精子注射针吸取精子的操作难度。 [0126] 实施例3 [0127] 本实施例的基本仪器配置如下： [0128] 倒置显微镜(用于观察ICSI操作过程)；显微操作仪(用于进行ICSI操作)；手动油压式显微注射仪(用于固定待注射的卵母细胞)；手动气压式显微注射仪(用于对卵母细胞进行单精子注射)。 [0129] 所需耗材如下： [0130] 90mm细胞培养皿若干(制备ICSI操作盘，进行各种相关操作)；毛细玻璃管若干(100mm×1mm×0.8mm)。 [0131] 所需试剂如下： [0132] 精子处理液、受精液、精子激活剂、卵子及胚胎操作液、胚胎培养液以及Sigma M5310同实施例1。 [0133] 精子去膜剂的制备方法为：所述精子去膜剂以受精液为基础液，添加0.2％ Triton X‑100(v/v)； [0134] 注射卵激活液的制备方法为：所述注射卵激活液以市售商业化TCM199(Gibco，12350039)为基础液，添加7％乙醇(v/v)； [0135] 注射卵恢复液的制备方法为：所述注射卵恢复液以市售商业化TCM199(Gibco，12350039)为基础液，添加10％ FBS(v/v)。 [0136] 具体工艺步骤 [0137] 一种能提高卵胞浆内单精子注射(ICSI)效率的方法，包括以下步骤： [0138] (1)ICSI操作针的制备，同实施例1： [0139] (2)精子制备： [0140] 步骤1)‑8)同实施例1； [0141] 9)取上层0.4ml激活后精子加入等体积的精子去膜剂中，涡旋1分钟； [0142] 10)400g离心5分钟； [0143] 11)取下层沉淀加入1ml受精液中，400g离心5分钟； [0144] 12)取下层沉淀加入0.2ml受精液中，放入38.8度、5‑7％二氧化碳的饱和湿度环境待用。 [0145] (3)卵母细胞制备： [0146] 1)成熟22小时后的卵母细胞，放入卵子及胚胎操作液中，用内径为145μm的剥卵针剥除卵母细胞外层的颗粒细胞； [0147] 2)将卵母细胞放入注射卵恢复液做的提前平衡好的0.1ml微滴中。 [0148] (4)ICSI操作盘的制备，同实施例1： [0149] (5)ICSI操作： [0150] 1)取2μl精子去膜剂处理后的精子加入ICSI操作盘的微滴中； [0151] 2)将待注射卵子加入ICSI操作盘中的十字型微滴中部； [0152] 步骤3)‑8)同实施例1。 [0153] (6)注射后卵母细胞激活： [0154] 1)成功注射的卵母细胞移入提前平衡好的注射卵恢复液做的液滴中，放入38.8度、5‑7％二氧化碳的饱和湿度环境4小时； [0155] 2)将卵母细胞转入注射卵激活液中处理5分钟。 [0156] (7)胚胎培养： [0157] 1)将激活后的卵母细胞移入胚胎培养液中，放入38.8℃、5‑7％二氧化碳、5‑7％氧气的饱和湿度环境中培养； [0158] 2)第7天，统计胚胎发育情况，数据分析结果见表3。 [0159] 为了验证本发明中注射卵激活液的效果，设置对比例进行对比， [0160] 具体如下： [0161] 对比例5 [0162] 参照实施例2的方法对牛卵母细胞进行ICSI操作，即将经过精子激活剂、精子去膜剂处理后的精子注射到卵母细胞中，注射后的卵母细胞不经过激活直接培养。 [0163] 表3 [0164] [0165] 表3中的指标说明： [0166] 对成功进行ICSI的卵母细胞用注射卵激活剂进行激活处理后进行胚胎培养，与不进行激活处理直接进行胚胎培养相比，经过激活处理的卵母细胞能获得更多的卵裂的卵母细胞及囊胚。 [0167] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 |
||||||
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈