一种表面表达非洲猪瘟IrrE蛋白的大肠杆菌重组菌的培育方法 |
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| 申请号 | CN202410204556.6 | 申请日 | 2024-02-24 | 公开(公告)号 | CN118006534A | 公开(公告)日 | 2024-05-10 |
| 申请人 | 扬州大学; 吉林和元生物工程股份有限公司; | 发明人 | 羊扬; 马欣妍; 朱国强; 蔡维北; 刘鹏刚; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种表面表达非洲 猪瘟 IrrE蛋白的大肠杆菌重组菌的培育方法，包括以下步骤：S1、材料准备：IrrE重组大肠杆菌材料，限制性内切酶；T4连接酶，卡那霉素，蛋白 电泳 主要溶液、蛋白上样缓冲液以及培养基；S2、培养基配制：采用LB培养基，LB液体培养基内部配置有精解蛋白胨1.0％， 酵母 浸出 粉0.5％， 氯化钠 1.0％，接着并搅拌使之完全溶解，该培育方法通过在对IrrE重组大肠杆菌生长中，持续添加新的营养物质，确保IrrE重组大肠杆菌的正常、快速的生长繁殖，解决了目前大肠杆菌重组菌在重组培育过程中 营养液 成分单一、造成局部大肠杆菌重组菌营养含量不足的问题，以此提升实验成品的品质，有利于后续非洲猪瘟 疫苗 的研制工作。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种表面表达非洲猪瘟IrrE蛋白的大肠杆菌重组菌的培育方法，其特征在于：包括以下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种表面表达非洲猪瘟IrrE蛋白的大肠杆菌重组菌的培育方法 技术领域[0001] 本发明涉及细菌培育技术领域，具体为一种表面表达非洲猪瘟IrrE蛋白的大肠杆菌重组菌的培育方法。 背景技术[0002] 非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起猪的急性烈性传染病，死亡率可达100％，非洲猪瘟病毒(ASFV)是一种大的、有囊膜的双链DNA病毒，是最新命名的非洲猪瘟病毒科的唯一成员，也是唯一的虫媒DNA病毒，病毒基因组全长为17Okb～190kb，中央有125kb左右的保守区，两端为可变区，含有末端反转重复序列，这些重复序列的增加或者缺失是造成不同分离株基因组长度差异的主要原因[31。非洲猪瘟病毒大多数毒株的毒力都很强，但是免疫原性很低，只有少数几个蛋白具有免疫原性，现有研究表明，不同区域ASFV毒株诱导产生的P72抗体的相应抗原表位都相当保守，P72衣壳蛋白占整个病毒粒子总蛋白的32％，而且抗原性很稳定，常被用来作为血清学检测和免疫制剂，流行病学研究表明，由于ASFV的高致死性和高度传染性，目前又无有效的疫苗，所以对待ASFV的方针历来是严密的检查和大批屠杀，所以建立一套高效安全的诊断方法是必不可少的，目前的研究是利用基因重组技术，将非洲猪瘟病毒P72基因(1938bp)克隆到质粒载体中，在大肠杆菌中表达衣壳蛋白P72，利用pET‑30c(+)载体所具有的6组氨酸序列，通过镍柱进一步纯化融合的目的蛋白，为建立以重组蛋白为检测抗原的非洲猪瘟诊断方法奠定基础。 [0003] 大肠杆菌表达系统常用于疫苗研究工作，有利于研制针对非洲猪瘟的高效疫苗。然而，目前的大肠杆菌重组菌在重组培育过程中，其营养液成分比较单一，主要依靠琼脂为大肠杆菌重组菌提供营养成分，而非洲猪瘟疫苗研究工作需要较多的参照载体，需针对大肠杆菌重组菌进行大量繁殖，而在大肠杆菌重组菌后续大量繁殖时，单一的营养液成分无法满足其需求，进而造成局部大肠杆菌重组菌营养含量不足，发生死亡和停止生长繁育的问题，最终对实验成品的品质会造成影响，导致后续一系列的实验均受到影响，不利于非洲猪瘟疫苗的研制工作。 发明内容[0004] 针对现有技术的不足，本发明提供了一种表面表达非洲猪瘟IrrE蛋白的大肠杆菌重组菌的培育方法，解决了大肠杆菌重组菌在重组培育过程中，其营养液成分比较单一、造成局部大肠杆菌重组菌营养含量不足，发生死亡和停止生长的问题，以此提升实验成品的品质，有利于后续非洲猪瘟疫苗的研制工作。 [0005] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种表面表达非洲猪瘟IrrE蛋白的大肠杆菌重组菌的培育方法，包括以下步骤： [0006] S1、材料准备：IrrE重组大肠杆菌材料，限制性内切酶；T4连接酶，卡那霉素，蛋白电泳主要溶液、蛋白上样缓冲液以及培养基； [0007] S2、培养基配制：采用LB培养基，LB液体培养基内部配置有精解蛋白胨1.0％，酵母浸出粉0.5％，氯化钠1.0％，接着并搅拌使之完全溶解，用5molNaOH(about0.2ml/1000ml培养基)调pH至7.0，高压灭菌20min(120℃0.1Mpa)； [0008] S3、细菌培养：首先将IrrE重组大肠杆菌活化，将保存于‑80℃的IrrE重组大肠杆菌甘油菌室温解冻，取500ul菌接入50mlLB培养基内，再加入相对应的筛选抗性，37℃培养7h；然后上罐，将上步活化的IrrE重组大肠杆菌50ml接入3L发酵培养基中，设定温度，空气流量，压力值，监控DO与PH值； [0009] S4、营养液准备：一等份的蛋白胨、一等份的乳糖、一等份的磷酸氢二钾、一等份的维生素和一等份的氨基酸以及一等份的葡萄糖与果糖与一等分微量元素(包括铁、铜、锰、锌、钴、钼、铬、镍、钒、氟、硒、碘、硅、锡)，最后加入五等份的纯净无菌水，接着采用杀菌后的搅拌棒对各项营养材料进行充分搅拌与混合，直至其形成粘稠状物质，此时根据肉眼观察IrrE重组大肠杆菌的生长情况，逐次添加总材料的三分之一，共添加三次，直至材料全部添加结束； [0010] S5、检测与后期储存：当肉眼观察IrrE重组大肠杆菌基本布满培养基的内部底端面时，可以停止添加新的营养物质，同时从发酵4小时开始，每隔1h进行取样检测OD，当OD值≥40时，开始诱导；诱导物：IPTG(1mol/L，过滤除菌)，加入4ml，至终浓度达到1mmol/L，诱导阶段温度控制再35℃，其他条件不变，诱导10小时；诱导结束后，放罐，5000rpm离心，收集菌体，于‑80℃冰箱保存。 [0011] S6、数据记录：挑取IrrE重组大肠杆菌接种于50mL含有卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中，设定37℃、180r/min进行振荡过夜培养，然后以0.5％接种量转接到新鲜的含有2mmol/LIPTG、50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基之中，37℃、180r/min振荡培养，每间隔2h取样测定A600，绘制生长曲线。 [0012] 优选的，在步骤4中，维生素的种类包括包括维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12，氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天门冬酰胺。 [0013] 优选的，在步骤5中，不同浓度的IPTG均能够诱导目的蛋白的表达，当IPTG浓度达到2mmol/L，37℃培养6h时，目的蛋白的可溶性表达最为明显，因此，可以将IrrE蛋白的最佳诱导条件设置为IPTG终浓度2mmol/L、诱导温度37℃、诱导时间6h。 [0014] 本发明具备以下有益效果： [0015] (1)该表面表达非洲猪瘟IrrE蛋白的大肠杆菌重组菌的培育方法，通过在对IrrE重组大肠杆菌生长中，持续添加新的营养物质，确保IrrE重组大肠杆菌的正常、且快速的生长繁殖，解决了目前大肠杆菌重组菌在重组培育的过程中，其营养液成分比较单一、造成局部大肠杆菌重组菌所摄入的营养物质含量不足、导致后续一系列的实验均受到影响的问题，以此提升实验成品的品质，有利于后续非洲猪瘟疫苗的研制工作。 [0016] (2)该表面表达非洲猪瘟IrrE蛋白的大肠杆菌重组菌的培育方法，通过肉眼观察IrrE重组大肠杆菌基本布满培养基的内部底端面时，可以停止添加新的营养物质，同时从发酵4小时开始，每隔1h进行取样检测，便于实验人员实时的对大肠杆菌的繁殖情况以及生长质量做出了解，方便后续的营养物供给，提升了大肠杆菌培育情况的可控性。 具体实施方式[0017] 基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。 [0018] 本发明提供一种表面表达非洲猪瘟IrrE蛋白的大肠杆菌重组菌的培育方法技术方案：一种表面表达非洲猪瘟IrrE蛋白的大肠杆菌重组菌的培育方法，包括以下步骤： [0019] S1、材料准备：IrrE重组大肠杆菌材料，限制性内切酶；T4连接酶，卡那霉素，蛋白电泳主要溶液、蛋白上样缓冲液以及培养基； [0020] S2、培养基配制：采用LB培养基，LB液体培养基内部配置有精解蛋白胨1.0％，酵母浸出粉0.5％，氯化钠1.0％，接着并搅拌使之完全溶解，用5molNaOH(about0.2ml/1000ml培养基)调pH至7.0，高压灭菌20min(120℃0.1Mpa)； [0021] S3、细菌培养：首先将IrrE重组大肠杆菌活化，将保存于‑80℃的IrrE重组大肠杆菌甘油菌室温解冻，取500ul菌接入50mlLB培养基内，再加入相对应的筛选抗性，37℃培养7h；然后上罐，将上步活化的IrrE重组大肠杆菌50ml接入3L发酵培养基中，设定温度，空气流量，压力值，监控DO与PH值； [0022] S4、营养液准备：一等份的蛋白胨、一等份的乳糖、一等份的磷酸氢二钾、一等份的维生素和一等份的氨基酸以及一等份的葡萄糖与果糖与一等分微量元素(包括铁、铜、锰、锌、钴、钼、铬、镍、钒、氟、硒、碘、硅、锡)，最后加入五等份的纯净无菌水，接着采用杀菌后的搅拌棒对各项营养材料进行充分搅拌与混合，直至其形成粘稠状物质，此时根据肉眼观察IrrE重组大肠杆菌的生长情况，逐次添加总材料的三分之一，共添加三次，直至材料全部添加结束； [0023] S5、检测与后期储存：当肉眼观察IrrE重组大肠杆菌基本布满培养基的内部底端面时，可以停止添加新的营养物质，同时从发酵4小时开始，每隔1h进行取样检测OD，当OD值≥40时，开始诱导；诱导物：IPTG(1mol/L，过滤除菌)，加入4ml，至终浓度达到1mmol/L，诱导阶段温度控制再35℃，其他条件不变，诱导10小时；诱导结束后，放罐，5000rpm离心，收集菌体，于‑80℃冰箱保存； [0024] S6、数据记录：挑取IrrE重组大肠杆菌接种于50mL含有卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中，设定37℃、180r/min进行振荡过夜培养，然后以0.5％接种量转接到新鲜的含有2mmol/LIPTG、50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基之中，37℃、180r/min振荡培养，每间隔2h取样测定A600，绘制生长曲线。 [0025] 其中，在步骤4中，维生素的种类包括包括维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12，氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天门冬酰胺，在步骤5中，不同浓度的IPTG均能够诱导目的蛋白的表达，当IPTG浓度达到2mmol/L，37℃培养6h时，目的蛋白的可溶性表达最为明显，因此，可以将IrrE蛋白的最佳诱导条件设置为IPTG终浓度2mmol/L、诱导温度37℃、诱导时间6h。 [0026] 综上所述，该表面表达非洲猪瘟IrrE蛋白的大肠杆菌重组菌的培育方法，通过在对IrrE重组大肠杆菌生长中，持续添加新的营养物质，确保IrrE重组大肠杆菌的正常、快速的生长繁殖，改进了现有技术主要依靠琼脂为大肠杆菌重组菌提供营养成分的局限性，解决了目前大肠杆菌重组菌在重组培育过程中，其营养液成分比较单一、在大肠杆菌重组菌后续大量繁殖时，无法满足其需求，进而造成局部大肠杆菌重组菌营养含量不足，发生死亡和停止生长繁育的问题，以此提升实验成品的品质，有利于后续非洲猪瘟疫苗的研制工作。 [0027] 需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。 |
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