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一种高热稳定性己糖激酶及其表达与纯化方法
申请号	CN202410161170.1	申请日	2024-02-05	公开(公告)号	CN118006530A	公开(公告)日	2024-05-10
申请人	江南大学;			发明人	邓禹; 周胜虎; 李倩妮; 毛银; 赵运英; 李国辉;
摘要	本发明公开了一种高热稳定性己糖激酶及其表达与纯化方法，属于生物工程领域。本发明以含来源于嗜热菌的己糖激酶GLK基因的重组质粒pET‑28a(+)‑GLK在大肠杆菌中表达为基础，建立了一种己糖激酶的生产方法，包括己糖激酶GLK在重组细胞中的表达方法、分离纯化方法以及保存方法。本发明实现了异源己糖激酶的在大肠杆菌中的高效表达及分离纯化，所述方法为其他高附加值酶蛋白的生产提供了有益借鉴，为我国突破在血糖诊断试剂制备中的短板提供了更多可能性和发展空间。
权利要求	1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，表达SEQ ID NO.1所示的己糖激酶。 2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌以E.coli BL21(DE3)为宿主，以pET‑28a(+)为表达载体。 3.一种提高己糖激酶可溶性表达量的方法，其特征在于，将权利要求1所述重组大肠杆菌在培养基中培养至OD600为1.2‑1.4，用终浓度为0.01‑0.05mmol/L的IPTG诱导培养。 4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： (1)将权利要求1所述的重组大肠杆菌的单菌落在LB培养基中，于35～37℃，200‑250r/min培养一段时间，得到种子液； (2)将步骤(1)制备的种子液接种到改良LB培养基中，于35～37℃，200‑250r/min培养至OD600为1.2‑1.4，加入终浓度为0.01‑0.05mmol/L的IPTG诱导剂，在28～30℃，200‑250r/min摇床培养14‑16h。 5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述改良LB培养基是在LB培养基基础上加 2+ 入按终浓度计1～3g/L甘油、1～15mmol/L Mg 。 6.一种制备SEQ ID NO.1所示己糖激酶酶蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)将含有所述己糖激酶的细胞培养液于5 000r/min离心5min，收集细胞，随后用Tris/HCl(pH 7.8)缓冲液洗涤细胞两次并重悬，得到重组细胞重悬液； (2)重组细胞重悬液于高压匀浆机中进行破碎，破碎条件为6℃、600Pa、15min； (3)破碎后经过10 000r/min、15min的离心分离上清，得到重组细胞破碎上清液； (4)重组细胞破碎上清液于65℃热沉降12h后于10 000r/min离心分离15min获得上清即为粗酶液； (5)粗酶液流穿亲和层析柱后，用Tris/HCl(pH7.8，30mmol/L咪唑)洗脱亲和层析柱中的杂蛋白，用Tris/HCl洗脱亲和层析柱中的己糖激酶，获得己糖激酶粗纯液； (6)将己糖激酶粗纯液流穿阴离子层析柱后，用Tris/HCl洗脱阴离子层析柱中的杂蛋白，用Tris/HCl洗脱阴离子层析柱中的己糖激酶，获得己糖激酶精纯液； (7)将己糖激酶精纯液于超滤管置换缓冲液Tris/HCl为Tris/HCl，从而获得己糖激酶纯酶。 7.氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的己糖激酶在特异性催化葡萄糖中的应用。 8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用是将所述己糖激酶在含有葡萄糖的环境中，于28～30℃反应。 9.氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的己糖激酶在血糖检测中的应用。 10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，用于制备血糖检测产品。
说明书全文	一种高热稳定性己糖激酶及其表达与纯化方法技术领域 [0001] 本发明涉及一种高热稳定性己糖激酶及其表达与纯化方法，属于生物工程领域。背景技术 [0002] 己糖激酶可催化葡萄糖磷酸化形成葡萄糖‑6‑磷酸，与葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶偶联+可将NAD还原为NADH。通过检测NADH在340nm处的吸光值变化可对葡萄糖含量进行定量检测。因此，在生化检测行业中己糖激酶常被用于血糖、尿糖等生化检测项目的葡萄糖定量检测。由于己糖激酶是酶制剂行业的小酶种，国内外鲜有报道己糖激酶生产制备相关的研究成果，因此国内企业对其关注度不高，缺乏己糖激酶生产制备方面的自主知识产权，导致国内己糖激酶市场目前仍然以进口酵母源己糖激酶为主。随着生活水平的提高，人们的饮食习惯也相应发生变化，越来越多人趋于高热量高糖饮食习惯，导致糖尿病患者数量日益增加。由于血糖检测是糖尿病患者治疗环节中不可或缺的步骤，糖尿病患者剧增意味着其对血糖检测的需求增加，己糖激酶的需求量也随之增加，基于国内仍以依赖进口己糖激酶供应需求的现状，开发挖掘价格亲民，对热稳定的己糖激酶迫在眉睫。 [0003] 嗜热菌长期生存于高温环境，其相关蛋白及酶类热稳定性高，是热稳定己糖激酶挖掘筛选的优势来源。根据目前对嗜热菌来源己糖激酶的研究表明，所挖掘并鉴定成功的热稳定性己糖激酶，在其最适反应温度下均具有极高酶活性，但不同嗜热菌菌株之间的己糖激酶其己糖底物谱大不相同，如已经鉴定成功的来源于Aeropyrum pernix、Thermoproteus tenax、Sulfolobus tokodaii和Pyrobaculum calidifontis的己糖激酶均具有广泛的底物谱，能同时对葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖等进行反应。己糖激酶在血糖检测应用要求对葡萄糖特异性高，因此，筛选热稳定性高且对葡萄糖底物特异性好的己糖激酶是十分必要的。发明内容 [0004] 本发明提供了一种来源于嗜热菌的己糖激酶GLK，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。 [0005] 本发明还提供了编码所述己糖激酶的基因。 [0006] 在一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。 [0007] 本发明还提供了表达所述己糖激酶的重组大肠杆菌。 [0008] 在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以E.coli BL21(DE3)为宿主，以pET‑28a(+)为表达载体。 [0009] 本发明还提供了一种提高己糖激酶可溶性表达量的方法，是将所述重组大肠杆菌在培养基中培养至OD600为1.2‑1.4，用终浓度为0.01‑0.05mmol/L的IPTG诱导培养。 [0010] 在一种实施方式中，所述方法包括如下步骤： [0011] (1)将所述重组大肠杆菌单菌落接入含有Kan抗生素的LB培养基中，37℃，200‑250r/min摇床培养过夜，得到种子液； [0012] (2)将种子液以4％接种量接入到改良LB诱导培养基中，37℃，200‑250r/min摇床培养至OD600为1.2‑1.4，加入终浓度为0.01‑0.05mmol/L的IPTG诱导剂进行诱导培养； [0013] (3)诱导培养条件为28℃～30℃，200‑250r/min摇床培养14‑16h。 [0014] 本发明还提供了一种制备所述己糖激酶纯酶的方法，包括如下步骤： [0015] (1)将含有所述己糖激酶的细胞培养液于5 000r/min离心5min，收集细胞，随后用Tris/HCl(pH 7.8)缓冲液洗涤细胞两次并重悬，得到重组细胞重悬液； [0016] (2)重组细胞重悬液于高压匀浆机中进行破碎，破碎条件为6℃、600Pa、15min； [0017] (3)破碎后经过10 000r/min、15min的离心分离上清，得到重组细胞破碎上清液； [0018] (4)重组细胞破碎上清液于60℃～65℃热沉降12h后于10 000r/min离心分离15min获得上清即为粗酶液； [0019] (5)粗酶液流穿亲和层析柱(Ni‑NTA 6FF，上海生工)后，用Tris/HCl(pH7.8，30mmol/L咪唑)洗脱亲和层析柱(Ni‑NTA 6FF，上海生工)中的杂蛋白，Tris/HCl(pH7.8， 50mmol/L咪唑)洗脱亲和层析柱(Ni‑NTA 6FF，上海生工)中的己糖激酶，获得己糖激酶粗纯液； [0020] (6)将己糖激酶粗纯液流穿阴离子层析柱(HiTrap Capto Q ImpRes，Cytiva)后，用Tris/HCl(pH7.8，200mmol/L NaCl)洗脱阴离子层析柱(HiTrap Capto Q ImpRes，Cytiva)中的杂蛋白，Tris/HCl(pH7.8，500mmol/L NaCl)洗脱阴离子层析柱(HiTrap Capto Q ImpRes，Cytiva)中的己糖激酶，获得己糖激酶精纯液； [0021] (7)己糖激酶精纯液于超滤管(10kDa，2 000xg)置换缓冲液Tris/HCl(pH7.8，200mmol/L NaCl)为Tris/HCl(pH7.8)，从而获得己糖激酶纯酶。 [0022] 本发明还提供了所述己糖激酶的保存方法，是将所述己糖激酶保存于含40％‑50％(v/v)甘油的Tris/HCl(pH7.8)缓冲体系，并于‑20℃或‑80℃条件下保存(避免反复冻融)。 [0023] 本发明还提供了所述己糖激酶在特异性催化葡萄糖中的应用。 [0024] 在一种实施方式中，所述应用是将所述己糖激酶在含有葡萄糖的环境中，于28～30℃反应。 [0025] 有益效果： [0026] 本发明对含权利要求1所述己糖激酶进行基因编码合成得到了重组质粒pET‑28a(+)‑GLK。将得到的重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)，得到重组细胞。采用权利要求10所述表达方法对重组细胞进行诱导培养，获得重组细胞培养液。在重组细胞培养液OD600为3.0时，己糖激酶可溶性表达量由表达优化前的63.49mg/L提高到298.91mg/L，提高了4.71倍，重组细胞量OD600由1.88增加到了3.91，提高了近2倍。将重组细胞培养液进行己糖激酶GLK分离纯化后，获得30℃比酶活为42.33U/mg，80℃比酶活为268.40U/mg，纯度≥98％的纯酶。 [0027] 本发明还提供了所述己糖激酶的保存方法，可使己糖激酶GLK纯酶保存一年后己糖激酶GLK残存100％比酶活。本发明所述己糖激酶生产及纯化方法的开发，为我国突破在血糖诊断试剂制备中的短板提供了更多可能性和发展空间。附图说明 [0028] 图1为己糖激酶GLK表达优化前后可溶性表达量、重组细胞积累量的对比，以及在30℃和80℃的比酶活对比。 [0029] 图2为己糖激酶GLK表达优化前后SDS‑PAGE对比。 [0030] 图3为己糖激酶GLK分离纯化效果；其中，A：分离纯化前后的己糖激酶GLK的SDS‑PAGE；B：分离纯化后己糖激酶GLK在30℃和80℃的比酶活。 [0031] 图4为己糖激酶GLK的保存效果；其中，A：己糖激酶GLK在不同温度条件下保存30天后比酶活残存率；B：‑80℃、‑4℃条件下，己糖激酶GLK在不同甘油含量体系中保存1年后比酶活残存率。 [0032] 图5为己糖激酶GLK在不同底物下的催化能力。具体实施方式 [0033] 培养基： [0034] LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母浸粉5g/L、NaCl 10g/L； [0035] 改良LB培养基：在LB培养基基础上加入1～2.0g/L甘油、1.0‑15mmol/L Mg2+。 [0036] 检测方法： [0037] 己糖激酶的酶活检测方法：按表1所示方法检测比酶活。 [0038] 表1：GLK比酶活测定方案 [0039] [0040] [0041] 根据表1操作后得到的数据利用(公式1)(公式2)进行计算分析。 [0042] [0043] [0044] Vt：反应体系总体积；Df：稀释倍数；ε：NADH吸光摩尔系数，6.22mmol/L‑1cm‑1；d：光路长度；VE：样品酶添加体积；C：样品酶对应的蛋白浓度(mg/mL)，利用改良型Bradford法蛋白浓度测定试剂盒测定。 [0045] 己糖激酶的纯度检测方法：取破碎上清液、己糖激酶粗酶液、100mg/L粗纯液、100mg/L精纯液、400mg/L粗纯液、400mg/L精纯液，100mg/L BSA各40μL于不同的EP管，分别添加上样缓冲液6μL，混匀后煮沸10min。利用12％SDS‑PAGE进行电泳，结束后使用考马斯亮蓝G‑250染液染色。经脱色后，以BSA(牛血清白蛋白，纯度≥98％)作为标准蛋白判断己糖激酶GLK的纯度。 [0046] 己糖激酶残存酶活检测方法： [0047] 取保存于4℃、0℃、‑20℃、‑80℃条件下含0％‑50％(v/v)甘油的Tris/HCl(pH7.8)缓冲体系的己糖激酶纯酶(保存1年后)，保存前的纯酶，分别根据表1，在30℃条件下检测两者比酶活，根据(公式3)进行比酶活残留率计算。 [0048] 比酶活残留率＝保存前比酶活/保存后比酶活×100％ (公式3)。 [0049] 实施例1：表达己糖激酶的重组菌的构建 [0050] 合成GLK基因序列(SEQ ID NO.2所示)并克隆到pET‑28a(+)载体获得重组质粒pET‑28a(+)‑GLK；将重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)，获得重组细胞。 [0051] (1)将含有己糖激酶的重组细胞单菌落接入含有Kan抗生素的LB培养基中，37℃，200‑250r/min摇床培养过夜，得到种子液。 [0052] (2)将种子液以4％接种量接入到LB培养基中，37℃，200‑250r/min摇床培养至OD600为0.6‑0.8，加入终浓度范围在0.5mmol/L的IPTG诱导剂进行诱导培养。诱导培养条件为30℃，200‑250r/min摇床培养10h，得到含有己糖激酶GLK的重组细胞培养液，经检测，细胞培养液的产酶量为63.49mg/L。 [0053] 实施例2：己糖激酶GLK表达条件优化 [0054] 将实施例1构建的重组菌株按如下方法培养： [0055] 将种子液以4％接种量接入到改良LB培养基中，37℃，200‑250r/min摇床培养至OD600为1.2‑1.4，加入终浓度范围在0.01‑0.05mmol/L的IPTG诱导剂进行诱导培养。诱导培养条件为28℃‑30℃，200‑250r/min摇床培养14‑16h，得到含有己糖激酶GLK的重组细胞培养液，产酶量为298.91mg/L。 [0056] 实施例3：己糖激酶的SDS‑PAGE检测 [0057] 按照实施例1、实施例2的方法制备重组细胞培养液， [0058] 用分光光度计分别检测实施例1、实施例2的方法重组细胞培养液的OD600(图1)。以转速5 000r/min的条件离心5min分别收集优化前后的重组细胞培养液，随后用Tris/HCl(pH7.8)缓冲液洗涤重组细胞两次并重悬，分别获得OD600为3.0的重组细胞重悬液。 [0059] 分别将前述制备的两组OD600为3.0重组细胞重悬液于高压匀浆机中进行破碎，破碎条件为6℃、600Pa、15min。破碎后经过10 000r/min、15min的离心分离上清，得到重组细胞破碎上清液。将优化前后的沉淀用Tris/HCl(pH7.8)重悬，得到重组细胞沉淀重悬液。 [0060] 分别取优化前后(实施例1、实施例2)的重组细胞重悬液，破碎上清液、沉淀重悬液及100mg/L BSA各40μL于不同的EP管，分别添加上样缓冲液6μL，混匀后煮沸10min。利用12％ SDS‑PAGE进行电泳，结束后使用考马斯亮蓝G‑250染液染色。经脱色后，分析优化前后蛋白表达情况(图2)，以BSA(牛血清白蛋白，纯度≥98％)作为标准蛋白，利用Image J计根据(公式4)蛋白条带灰度值并计算GLK表达量(图1)。 [0061] [0062] CBSA：取BSA(纯度≥98％)标样溶解于Tris/HCl(pH7.8)中所测定的蛋白浓度，mg/L； [0063] CGLK：GLK的浓度，mg/L； [0064] VBSA：SDS‑PAGE时BSA的加样体积，μL； [0065] VGLK：SDS‑PAGE时GLK的加样体积，μL； [0066] IntDenGLK：GLK条带对应的积分灰度值。 [0067] 实施例4：己糖激酶GLK纯化 [0068] 将实施例3制备的优化前后的重组细胞破碎上清液进行分离纯化，其具体步骤为： [0069] (1)热沉降纯化 [0070] 将重组细胞破碎上清液于60℃‑65℃热沉降12h后于10 000r/min离心15min分离上清，获得粗酶液。 [0071] (2)亲和层析纯化 [0072] 将粗酶液流穿亲和层析柱(Ni‑NTA 6FF，上海生工)后，用Tris/HCl(pH7.8，30mmol/L咪唑)洗脱亲和层析柱(Ni‑NTA 6FF，上海生工)中的杂蛋白，Tris/HCl(pH7.8， 50mmol/L咪唑)洗脱亲和层析柱(Ni‑NTA 6FF，上海生工)中的己糖激酶，获得己糖激酶粗纯液。 [0073] (3)阴离子层析纯化 [0074] 将己糖激酶粗纯液流穿阴离子层析柱(HiTrap Capto Q ImpRes，Cytiva)后，用Tris/HCl(pH7.8，200mmol/L NaCl)洗脱阴离子层析柱(HiTrap Capto Q ImpRes，Cytiva)中的杂蛋白，Tris/HCl(pH7.8，500mmol/L NaCl)洗脱阴离子层析柱(HiTrap Capto Q ImpRes，Cytiva)中的己糖激酶，获得己糖激酶精纯液，纯度≥98％。 [0075] (4)超滤管置换脱盐 [0076] 己糖激酶精纯液于超滤管(10kDa，2 000xg)置换缓冲液Tris/HCl(pH7.8，200mmol/L NaCl)为Tris/HCl(pH7.8)，从而获得己糖激酶纯酶。经测定，在30℃比酶活为 42.33U/mg，在80℃时比酶活为268.40U/mg。 [0077] 实施例5：己糖激酶GLK纯度检测及保存 [0078] 将上述己糖激酶纯分别保存于Tris/HCl(pH7.8)缓冲体系，并于‑80℃、‑20℃、0℃、4℃、25℃，30℃条件下保存30天后检测比酶活残留率(图4A)。 [0079] 将保存于含0％‑50％(v/v)甘油的Tris/HCl(pH7.8)缓冲体系的己糖激酶纯酶保存于4℃、0℃、‑20℃、‑80℃条件下保存1年后检测比酶活残留率(图4B)。 [0080] 实施例6：己糖激酶GLK底物特异性 [0081] 将获得的己糖激酶纯酶根据表2进行检测，比较己糖激酶分别以D‑葡萄糖，D‑果糖，D‑半乳糖，D‑甘露糖为底物的条件下的比酶活，以判断其底物特异性(图5)。 [0082] 表2底物特异性检测方法 [0083] [0084] [0085] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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