一株乳酸乳球菌及其在制备治疗牛乳腺炎的药物中的应用 |
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| 申请号 | CN202410414669.9 | 申请日 | 2024-04-08 | 公开(公告)号 | CN118006515A | 公开(公告)日 | 2024-05-10 |
| 申请人 | 中国农业大学; | 发明人 | 尚楠; 王玉; 李平兰; 高博雅; 杨若湫; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一株乳酸乳球菌及其在制备 治疗 牛 乳腺炎 的药物中的应用，该乳酸乳球菌L‑WY410的分类命名为乳酸乳球菌Lactococcus lactisL‑WY410，于2024年01月31日保藏在中国 微 生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.29830，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本发明的乳酸乳球菌能够抑制金黄色葡萄球菌和无乳链球菌生长，其外膜囊泡可作为活性物质应用在由金黄色葡萄球菌和/或无乳链球菌引起的 牛乳腺炎 药物中，为治疗由金黄色葡萄球菌和/或无乳链球菌引起的牛乳腺炎感染提供了新的药物来源。 | ||||||
| 权利要求 | 1.乳酸乳球菌L‑WY410，其特征在于，其分类命名为乳酸乳球菌Lactococcus lactis L‑WY410，菌株乳酸乳球菌Lactococcus lactis L‑WY410于2024年01月31日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为：CGMCC NO.29830。 |
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| 说明书全文 | 一株乳酸乳球菌及其在制备治疗牛乳腺炎的药物中的应用技术领域背景技术[0002] 牛乳腺炎（Bovine Mastitis）是一种常见的奶牛疾病，指的是奶牛的乳腺组织发生炎症。这种疾病通常由细菌感染引起，可以严重影响奶牛的健康以及牛奶的产量和质量。症状包括乳房肿胀、乳汁颜色改变、体温升高、奶量下降、行为异常等。导致奶牛乳腺炎的因素很多，其中80%以上是由病原微生物感染引起的，主要包括致病率较高的金黄色葡萄球菌和无乳链球菌。乳腺炎对牧场经济影响巨大，因为它会导致牛奶中体细胞数增加，并可能需要废弃受感染乳牛产生的牛奶。因此，预防和控制乳腺炎是奶牛养殖业中的重要任务。常用的防控措施包括定期进行乳房检查、严格执行挤奶卫生操作规程、使用抗生素治疗感染等。 然而长期和过度使用抗生素可能导致细菌对抗生素产生抗药性，从而降低现有药物的有效性，因此开发新的药物有助于克服这一挑战，保持对牛乳腺炎的有效控制。 发明内容[0003] 本发明的目的是提供一株乳酸乳球菌及其在制备由金黄色葡萄球菌和/或无乳链球菌引起的牛乳腺炎的药物中的应用，以至少解决上述问题。 [0004] 为了实现本发明的目的和其它优点，提供了乳酸乳球菌L‑WY410，其分类命名为乳酸乳球菌Lactococcus lactis)L‑WY410，菌株乳酸乳球菌Lactococcus lactis L‑WY410于2024年01月31日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏编号为：CGMCC NO.29830，保藏时间为：2024年01月31日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。 [0005] 本发明还提供了一种上述的乳酸乳球菌在制备治疗由金黄色葡萄球菌和/或无乳链球菌引起的牛乳腺炎的药物中的应用。 [0006] 优选的是，所述的应用，所述药物的活性成分为所述乳酸乳球菌的外膜囊泡。 [0007] 优选的是，所述的应用，所述外膜囊泡的制备方法包括：步骤一、制备乳酸乳球菌种子液； 步骤二、固体平板培养：将所述乳酸乳球菌种子液涂布在MRS固体平板培养基上，培养至长出新的乳酸乳球菌菌落； 步骤三、收集乳酸乳球菌外膜囊泡：对所述乳酸乳球菌菌落进行刮洗，收集菌液，将所述菌液进行离心，离心条件为：离心温度4℃、离心力不大于8000g、离心时间5‑30min，再将得到的上清液用微滤膜过滤； 步骤四、纯化乳酸乳球菌外膜囊泡：采用超滤管对过滤后的滤液进行截留，并将得到的截留液用微滤膜进行二次过滤，即得乳酸乳球菌外膜囊泡。 [0008] 优选的是，所述的应用，所述制备乳酸乳球菌种子液是将乳酸乳球菌菌种加入MRS液体培养基中，于30℃下培养12 h。 [0009] 优选的是，所述的应用，采用0.01M的PBS缓冲液对所述乳酸乳球菌菌落进行刮洗。 [0010] 优选的是，所述的应用，所述离心条件为：离心温度4℃、离心力4000g、离心时间10min。 [0011] 优选的是，所述的应用，所述微滤膜的孔径为0.22μm。 [0012] 优选的是，所述的应用，采用30KD的超滤管对过滤后的滤液在4℃、4000g离心力下进行截留浓缩。 [0013] 优选的是，所述的应用，在所述二次过滤前，在超滤管中用0.01M的PBS缓冲溶液在4℃、4000g离心力下洗涤截流液三次。 [0014] 本发明至少包括以下有益效果：第一、本发明提供了一株能够抑制金黄色葡萄球菌和无乳链球菌生长的乳酸乳球菌L‑WY410，其外膜囊泡可作为活性物质应用在由金黄色葡萄球菌和/或无乳链球菌引起的牛乳腺炎药物中，为治疗由金黄色葡萄球菌和/或无乳链球菌引起的牛乳腺炎感染提供了新的药物来源。 [0015] 第二、本发明提供了一种提高外膜囊泡抑制金黄色葡萄球菌和无乳链球菌生长能力的外膜囊泡提取方法。 [0017] 图1是本发明实施例2制备的乳酸乳球菌外膜囊泡的透射电镜图；图2是本发明实施例3制备的乳酸乳球菌外膜囊泡的透射电镜图； 图3是乳酸乳球菌外膜囊泡对金黄色葡萄球菌和无乳链球菌的抑菌圈图； 图4是乳酸乳球菌外膜囊泡对金黄色葡萄球菌的生长抑制图； 图5是乳酸乳球菌外膜囊泡对无乳链球菌的生长抑制图。 [0018] 生物材料保藏：乳酸乳球菌L‑WY410，其分类命名为乳酸乳球菌Lactococcus lactis L‑WY410，菌株乳酸乳球菌Lactococcus lactis L‑WY410于被2024年01月31日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC NO.29830，保藏时间为：2024年01月31日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。 具体实施方式[0020] 应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。 [0021] 需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。 [0022] 实施例1：乳酸乳球菌的筛选及鉴定1. 样品来源 本实施例所用的菌株来源于生牛乳。 [0024] 3. 抗金黄色葡萄球菌菌株筛选将金黄色葡萄球菌在TSB培养基中过夜培养，采用倾注法制备金黄色葡萄球菌指示菌平板。将上一步所得菌株发酵液滴5微升在指示菌平板中，37℃培养24h，选取有抑菌圈的菌株进行鉴定。 [0025] 4. 菌株鉴定4.1将菌株接种在MRS固体培养基中培养48h后，表面边缘光滑，呈规则圆形，乳白色。 [0026] 4.2 16S rDNA鉴定用基因组DNA提取试剂盒，提取目标菌株的基因组DNA，送至北京博迈德生物技术有限公司进行16S rDNA测序，将所得测序结果在NCBI网站进行BLAST序列比对，结果显示序列与乳酸乳球菌乳亚种的鉴定的16S rDNA序列同源性超过99%。 [0027] 基于以上，将该菌株命名为乳酸乳球菌Lactococcus lactis)L‑WY410，菌株乳酸乳球菌Lactococcus lactis L‑WY410于2024年01月31日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏编号为：CGMCC NO.29830，保藏时间为：2024年01月31日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。 [0028] 实施例2：制备乳酸乳球菌外膜囊泡将保存在甘油管的乳酸乳球菌L‑WY410从‑80℃冰箱取出，按2%接种量加入到10 mL MRS液体培养基中，置于30℃ 培养箱培养至12 h，获得种子液；将乳酸乳球菌种子液按 2% 转接至400mL MRS 液体培养基中，在30℃培养箱中培养24h。之后，在4℃、4000 g条件下离心发酵液(培养菌液)10min以除去菌体，收集无菌上清液，上清液经0.22 μm的水系膜过滤，除去大部分细胞碎片和鞭毛等杂质。对获得的滤液进行离心，4℃，200，000×g离心4h，去掉上清液，沉淀用400 µL 0.01 M的PBS溶液重悬，获得乳酸乳球菌外膜囊泡。利用透射电镜对获得的囊泡进行负染分析，结果如图1 所示。 [0029] 实施例3：制备乳酸乳球菌外膜囊泡将保存在甘油管的乳酸乳球菌L‑WY410从‑80℃冰箱取出，按2%接种量加入到10 mL MRS液体培养基中，置于30℃ 培养箱培养至12 h，获得种子液；取100 µL乳酸乳球菌种子液，涂布于10个直径6 cm的MRS固体平板培养基中，置于30℃继续培养24 h，用0.01M PBS缓冲液将平板中的菌体刮洗下来，4℃，4000 g离心10 min，除去大部分菌体。取上清液，上清液经0 .22 μm的水系膜过滤，除去大部分细胞碎片和鞭毛等杂质，获得含有乳酸乳球菌外膜囊泡的混合物；将含乳酸乳球菌外膜囊泡的滤液用30 KD 超滤管截留，4℃，4000 g离心浓缩至1 mL，然后用15 mL 0.01M PBS 洗三次，并最终浓缩至1 mL，获得乳酸乳球菌外膜囊泡。利用透射电镜对获得的囊泡进行负染分析，结果如图2 所示。 [0030] 由图1、图2可知，在透射电子显微镜（TEM）图像下都可观察到有椭圆形、含有双层膜结构的球形囊泡存在，证明乳酸乳球菌L‑WY410可以分泌囊泡，但采用实施例3的平板提取方法分离得到的囊泡与采用实施例2的传统囊泡提取方法分离得到的囊泡相比，囊泡的完整性好、杂质少、纯度更高。 [0031] 实验例1：囊泡平板抑菌试验将保存在甘油管的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 6538）从‑80℃冰箱取出，按2%接种量加入到10 mL TSB液体培养基中，在30℃培养箱中培养12h，得活化后的金黄色葡萄球菌；将保存在甘油管的无乳链球菌（Streptococcus agalactiaeATCC 27956）从‑80℃冰箱取出，按2%接种量加入到10 mL BHI液体培养基中，在37℃培养箱中培养12h，得活化后的无乳链球菌；将活化后的金黄色葡萄球菌和无乳链球菌；分别按照千分之一的接种量加入半凝固的TSB和BHI琼脂中，之后将其倒入60mm 平板中，每平板约10mL； 待其完全凝固，在平板上放入6mm 无菌滤纸，在滤纸片中滴加20微升实施例2制备的囊泡，置入30℃培养箱过夜培养12h，观察抑菌圈，实验结果如图3所示，图3中A中加入的是金黄色葡萄球菌，B中加入的是无乳链球菌，MVs为在滤纸片上添加囊泡，CK为空白对照。 [0032] 由图3可知，两组指示菌平板上都出现了明显的抑菌圈，证明囊泡对金黄色葡萄球菌和无乳链球菌具有较强的抗菌能力。 [0033] 实验例2：将保存在甘油管的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 6538）从‑80℃冰箱取出，按2%接种量加入到10 mL TSB液体培养基中，在30℃培养箱中培养12h，得活化后的金黄色葡萄球菌；将保存在甘油管的无乳链球菌（Streptococcus agalactiaeATCC 27956）从‑80℃冰箱取出，按2%接种量加入到10 mL BHI液体培养基中，在37℃培养箱中培养12h，得活化后的无乳链球菌；将活化的金黄色葡萄球菌和无乳链球菌分别按照2%接种量转接至含有TSB和BHI培养基的无菌离心管中，并随机均分为三组，一组加入终浓度为0.45 mg/mL的实施例2制备的囊泡，另一组加入终浓度为0.45 mg/mL的实施例3制备的囊泡，余下一组作为对照不加囊泡，混匀后，置入30℃培养箱培养，测量不同时间段菌株的生长OD600值，实验结果如图4、图5所示。 [0034] 由图4、图5可知，在没有囊泡存在的条件下，金黄色葡萄球菌培养至12h时OD600可以达到1.6以上，而在囊泡存在下，金黄色葡萄球菌的生长受到明显的抑制作用，其中，添加实施例2制备的囊泡与金黄色葡萄球菌共同孵育，培养至12h时OD600为1.1左右，添加实施例3制备的囊泡与金黄色葡萄球菌共同孵育，培养至12h时OD600在0.8以下；与金黄色葡萄球菌相似，无乳链球菌的生长也受到了囊泡的抑制，在没有囊泡存在的条件下，无乳链球菌培养至12h时OD600可以达到1.8以上，而添加实施例2制备的囊泡与无乳链球菌共同孵育，培养至12h时OD600维持在0.9左右，添加实施例3制备的囊泡与无乳链球菌共同孵育，培养至12h时OD600维持在0.7左右。这说明采用本发明的乳酸乳球菌L‑WY410制备的囊泡对金黄色葡萄球菌和无乳链球菌的生长具有明显的抑制作用，且实施例3制备的囊泡对金黄色葡萄球菌和无乳链球菌的生长抑制效果优于实施例2制备的囊泡，这可能是由于相较于实施例2的传统囊泡提取方法，采用实施例3的平板提取方法提取得到的囊泡的结构更完整、杂质更少、纯度更高，因此对金黄色葡萄球菌和无乳链球菌表现出更高的抑菌能力。 [0036] 尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。 |
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