[0001] 本发明属于微生物技术领域，涉及一株生防菌，具体涉及一株绿针假单胞菌橙色亚种及其应用。

[0002] 由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv. actinidiae，Psa）引起的猕猴桃细菌性溃疡病被称为猕猴桃的“癌症”，猕猴桃细菌性溃疡病连年发生，不仅会挫伤果农种植积极性和带来经济效益损害，更严重制约猕猴桃产业发展。

[0003] 目前，猕猴桃细菌性溃疡病的防治仍以化学防治为主，铜制剂和抗生素是最常使用的药剂。然而，化学农药在农业生产中的大量使用，不仅给生态环境带来负担，还会影响人体健康。利用生防菌防治农业病害是一种具有广泛应用潜力的生物防治方法，在环境中无污染、无残留，对作物无不良影响且安全性较高。生防菌在自然环境中表现出良好的杀菌能力，能够通过竞争作用、寄生作用、拮抗作用或诱导植物抗性的方式防治植物病害。

[0004] 细菌具有种类广、数量多、繁殖快、适用性强、易于培养的特性，因此，分离筛选出对猕猴桃细菌性溃疡病具有较好生防效果的细菌菌株具有重要意义。

[0005] 本发明旨在开发一种对猕猴桃细菌性溃疡病具有较好生防效果的生防菌资源。为实现本发明的技术目的，本发明提供一株绿针假单胞菌橙色亚种及其应用。

[0006] 本发明给出一株绿针假单胞菌橙色亚种，并验证了该菌株的生物活性。所述绿针假单胞菌橙色亚种具体为绿针假单胞菌橙色亚种（Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca）HYBR‑89。经生测试验获知，该菌株对猕猴桃细菌性溃疡病的病原菌具有拮抗作用，可用于防治猕猴桃细菌性溃疡病并且表现出优异效果。

[0007] 本发明所述Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiacaHYBR‑89采集于陕西省眉县陈家沟猕猴桃园发病“红阳”猕猴桃植株的根际土。保藏信息如下：分类命名：Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiacaHYBR‑89；
保藏时间：2024年3月4日；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏单位地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；
保藏编号：CGMCC No.29931。

[0008] 进一步地，本发明所述菌株HYBR‑89是从陕西省眉县陈家沟猕猴桃园发病“红阳”猕猴桃植株的根际土中分离、纯化后得到，在LB固体培养基上表现为圆形、橘黄色、不透明、表面凸起、光滑、边缘整齐的菌落。

[0009] 进一步地，本发明所述Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiacaHYBR‑89的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。通过多序列比对并构建系统发育树得知菌株HYBR‑89为绿针假单胞菌橙色亚种。

[0010] 具体地，本发明将纯化后的菌株进行平板对峙培养，筛选出对猕猴桃细菌性溃疡病病原菌具有明显拮抗作用的菌株。本发明提供的Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiacaHYBR‑89拮抗猕猴桃细菌性溃疡病病原菌，猕猴桃细菌性溃疡病病原菌为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种。

[0011] 另一方面，本发明请求保护上述绿针假单胞菌橙色亚种在防治猕猴桃细菌性溃疡病中的应用，猕猴桃细菌性溃疡病的病原菌为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种。

[0012] 进一步地，本发明通过抑菌活性试验和离体叶片抑菌活性试验得知，Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiacaHYBR‑89对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种M228、H117、G23、G25、HBCB‑11、H214以及H79均具有拮抗作用。

[0013] 将所述Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiacaHYBR‑89接种于LB液体培养基，28℃、220rpm/min，摇床培养2d后得到绿针假单胞菌橙色亚种发酵液。该发酵液对猕猴桃细菌性溃疡病的病原菌表现出抑制作用。

[0014] 还有，本发明请求保护一种微生物菌剂，包含上述绿针假单胞菌橙色亚种和/或绿针假单胞菌橙色亚种发酵液。这种微生物菌剂用于防治猕猴桃细菌性溃疡病。

[0015] 与现有技术相比，本发明提供的技术方案至少具备下述的有益效果或优点：本发明为猕猴桃细菌性溃疡病的防治提供了一种生防微生物资源。本发明从猕猴桃植株的根际土中分离、纯化得到Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiacaHYBR‑
89，该菌株对猕猴桃细菌性溃疡病病原菌丁香假单胞菌猕猴桃致病变种具有拮抗作用。

[0016] 本发明通过抑菌活性试验得知，Pseudomonas chlororaphis  subsp. aurantiacaHYBR‑89对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种M228、H117、G23、G25、HBCB‑11、H214以及H79均产生抑菌圈，对多种猕猴桃细菌性溃疡病病原菌表现出抑菌活性。

[0017] 本发明通过离体叶片抑菌活性试验得知，先接种Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiacaHYBR‑89，再接种丁香假单胞菌猕猴桃致病变种M228的叶片病斑面积明显小于先接种水再接种丁香假单胞菌猕猴桃致病变种M228的阳性对照组，Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiacaHYBR‑89对猕猴桃细菌性溃疡病病原菌的预防效果显著。附图说明

[0018] 图1为本发明所述HYBR‑89菌株的平板培养图。

[0019] 图2为本发明所述HYBR‑89菌株的系统发育树。

[0020] 图3为本发明所述HYBR‑89菌株对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种M228的抑菌活性图。

[0021] 图4为本发明所述HYBR‑89菌株对不同来源猕猴桃细菌性溃疡病病原菌的抑菌活性图。图4中的A为本发明所述HYBR‑89菌株对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种H117的抑菌活性图；图4中的B为本发明所述HYBR‑89菌株对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种G23的抑菌活性图；图4中的C为本发明所述HYBR‑89菌株对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种G25的抑菌活性图；图4中的D为本发明所述HYBR‑89菌株对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种HBCB‑11的抑菌活性图；图4中的E为本发明所述HYBR‑89菌株对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种H214的抑菌活性图；图4中的F为本发明所述HYBR‑899菌株对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种H79的抑菌活性图。

[0022] 图5为本发明所述HYBR‑89菌株对猕猴桃细菌性溃疡病病原菌的离体叶片防效试验结果。图5中的A为本发明所述HYBR‑89菌株对猕猴桃细菌性溃疡病病原菌防效试验的离体叶片图；图5中的B为本发明所述HYBR‑89菌株对猕猴桃细菌性溃疡病病原菌防效试验的病斑面积统计结果图；a为只接种H2O的阴性对照组；b为先接种H2O再接种丁香假单胞菌猕猴桃致病变种M228的阳性对照组；c为先接种HYBR‑89再接种丁香假单胞菌猕猴桃致病变种M228的处理组；M228为阳性对照组的病斑面积统计结果；HYBR‑89为处理组的病斑面积统计结果。

[0023] 下面，结合实施例对本发明的技术方案进行说明，但是，本发明并不限于下述的实施例。各实施例中所述实验方法和检测方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可在市场上购买得到。

[0024] 实施例1本实施例提供了HYBR‑89菌株的分离、纯化及鉴定。

[0025] 1、HYBR‑89菌株的分离与纯化土样采集于陕西省眉县陈家沟猕猴桃园发病“红阳”猕猴桃植株的根际土。采用稀释涂布法分离土壤样品中的目标生防菌。取不同稀释浓度的土壤悬液适量，分别在LB固体培养基、PDA固体培养基、TSB固体培养基以及高氏一号培养基上涂布均匀，每种培养基、每个浓度设置3个重复。将平板置于28℃恒温培养箱中，连续培养48h。

[0026] 挑选形态各异的菌落分别进行纯化，即当平板上长出单菌落时，将形态不同的单菌落用接种环挑出至新的固体培养基上，再培养。对纯化后的菌株进行平板对峙，3次重复，筛选对猕猴桃细菌性溃疡病病原菌丁香假单胞菌猕猴桃致病变种M228具有明显拮抗作用的菌株。在LB固体培养基上分离筛选得到HYBR‑89菌株，该菌株在LB固体培养基上的培养形态如图1所示。由图1可知，HYBR‑89菌株在LB固体培养基上表现为圆形、橘黄色、不透明、表面凸起、光滑、边缘整齐的菌落。

[0027] 2、HYBR‑89菌株的鉴定按照细菌基因组总DNA提取试剂盒（购于Omega Bio‑Tek，货号为D3350）提取菌株DNA，选择通用引物27F和1492R对菌株的16S rDNA基因序列进行PCR扩增，扩增产物通过
1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，确定目标条带。按照胶回收试剂盒（购于Omega Bio‑Tek，货号为D2500）操作进行胶回收，胶回收产物送往擎科生物科技有限公司测序。将测序结果（SEQ ID NO:1）在NCBI数据库进行BLAST比对得到多株亲缘关系相近菌株的16S rDNA序列，使用MEGA 
11软件进行多序列比对并修剪对齐后构建系统发育树（图2），从而确定HYBR‑89菌株的分类地位。本实施例发现，HYBR‑89菌株与绿针假单胞菌橙色亚种（Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca）NCIB 10068归为一支，因而将其鉴定为绿针假单胞菌橙色亚种（Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca）。

[0028] 实施例2本实施例提供了Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiacaHYBR‑89菌株对猕猴桃细菌性溃疡病病原菌的抑菌活性试验。

[0029] 1、HYBR‑89菌株对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种M228的皿内抑菌活性试验分别在LB平板上划线活化HYBR‑89菌株和M228菌株，分别用LB液体培养基接种HYBR‑89单菌落和M228单菌落，28℃、220rpm/min，摇床培养两天。按照体积比5%的比例将OD600=0.1的M228发酵液与冷却到40℃左右的LB培养基混合均匀后倒平板，用打孔器在平板中央打孔，滴加HYBR‑89发酵液20μL，28℃培养24h后用十字交叉法测量抑菌圈直径（图3），试验设3个重复，取其平均值。经过测量得知，HYBR‑89菌株对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种M228的抑菌圈直径达29mm，可见，HYBR‑89菌株对猕猴桃细菌性溃疡病病原菌具有拮抗作用。

[0030] 2、HYBR‑89菌株对不同丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的皿内抑菌活性试验采用上述相同方法摇床培养HYBR‑89菌株和不同丁香假单胞菌猕猴桃致病变种。按照体积比5%的比例将OD600=0.1的病原菌发酵液与冷却到40℃左右的LB培养基混合均匀后倒平板，用打孔器在平板中央打孔，滴加HYBR‑89发酵液20μL，28℃培养24h后用十字交叉法测量抑菌圈直径（图4），试验设3个重复，取其平均值。

[0031] 经过测量得知，HYBR‑89菌株对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种H117的抑菌圈直径为14mm，对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种G23的抑菌圈直径为14mm，对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种G25的抑菌圈直径为15mm，对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种HBCB‑11的抑菌圈直径为13mm，对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种H214的抑菌圈直径为13.5mm，对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种H79的抑菌圈直径为16.5mm。可见，HYBR‑89菌株对多株不同种类的丁香假单胞菌猕猴桃致病变种均具有拮抗作用。

[0032] 实施例3本实施例提供了HYBR‑89菌株的离体叶片抑菌活性试验。

[0033] 采集长势一致的猕猴桃叶片，首先进行表面消毒（0.6%次氯酸钠溶液浸泡10min），之后用无菌水冲洗叶片3遍，置于滤纸上晾干。使用打孔器制叶盘（注意避开叶脉），叶盘置于菌液中进行真空渗透（0.1MPa，30s，重复3次）。共涉及三个处理，每个处理5 10个叶盘，试~验重复3次；无菌水清洗3次，置于提前备好的水琼脂平板上。渗透处理后的材料置于人工气候培养箱，3d后拍照记录叶盘发病情况（图5）。

[0034] a：阴性对照，只接种H2O。

[0035] b：阳性对照，先接种H2O，再接种M228。

[0036] c：处理组，先接种HYBR‑89，再接种M228。

[0037] 由图5中的A可知，在离体条件下，a处理组的叶片不发病，c处理组的叶片病斑面积明显小于b处理组，预防效果显著。由图5中的B可知，接种M228的b处理组叶片发病率为40.91%，先接种HYBR‑89，再接种M228的c处理组叶片发病率为8.53%，两者差异极显著。表明HYBR‑89菌株对猕猴桃细菌性溃疡病病原菌具有拮抗作用，可以用于防治猕猴桃细菌性溃疡病。

[0038] 以上所述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。在依据本发明构思的条件下本领域普通技术人员进行的相关推演和替换，在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。