[0001] 本发明涉及养殖领域，更具体地，涉及用于蛋鸡的复合益生菌剂及其应用。

[0002] 益生菌作为绿色、安全的饲料添加剂被广泛应用于畜禽养殖中。益生菌能够保护动物胃肠道，促进其健康生长，并且通过其有益代谢产物，影响动物的健康，减少环境污染，降低养殖成本，因此成为了近年来的研究热点。复合益生菌制剂是由几种益生菌组合加工制成的制剂，能够改善机体内环境的微生态平衡，加快营养物质在动物胃肠道内的降解和吸收，进而促进动物的生长和生产。近年来有很多研究均表明复合益生菌制剂可以提高动物的生产性能、增强免疫力，但由于益生菌种类、组合方式、添加量及动物品种不同，益生菌在动物体内发挥的作用不同。

[0003] 本申请提供了一种用于蛋鸡的复合益生菌剂，包括：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌和粪肠球菌；其中，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌和粪肠球菌的混合比例为2:3:3:2。

[0004] 本申请还提供了上述复合益生菌剂在改善蛋鸡的产蛋率和蛋品质中的应用。

[0005] 在一些实施例中，所述复合益生菌剂在蛋鸡的日粮中的添加比例为150mg/kg。

[0006] 本申请试验采用单因子设计，随机选择51周龄产蛋率相近、健康的京红一号蛋鸡288只，随机分为4个处理，每处理6个重复，每个重复12只鸡。对照组采用玉米‑豆粕型基础日粮，试验组分别在对照组的基础上添加100、150和200mg/kg的复合益生菌制剂。预饲期
7d，正式试验期84d。试验结果表明，150mg/kg组产蛋率显著高于对照组(P＜0.05)，其他组与对照组差异不显著；200mg/kg组不合格蛋率显著低于对照组(P＜0.05)，其他组与对照组差异不显著，150mg/kg组与200mg/kg组差异不显著。蛋品质方面，200mg/kg组蛋壳厚度显著高于对照组(P＜0.05)，其他组与对照组差异不显著，150mg/kg组与200mg/kg组差异不显著。综上，蛋鸡日粮中添加复合益生菌制剂可以显著提高蛋鸡生产性能和蛋壳厚度，降低不合格蛋率，推荐添加量为150mg/kg。
附图说明

[0007] 图1示出了复合益生菌制剂对蛋鸡产蛋率的影响。

[0008] 下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

[0009] 1.1试验动物与材料

[0010] 试验用蛋鸡从河北省易县永合养鸡场购得的京红一号蛋鸡。复合益生菌制剂组成为：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌、粪肠球菌(质量比为2:3:3:2)。

[0011] 1.2试验设计与饲粮组成

[0012] 试验鸡为51周龄产蛋率相近、健康的京红一号蛋鸡288只，随机分为4组，每组6个重复，每个重复12只鸡。试验采用单因子设计，分为对照组与试验组，对照组采用玉米‑豆粕型基础日粮(表1示出了基础日粮配方及营养水平)，试验组分别在基础日粮中添加100、150和200mg/kg的复合益生菌制剂。预试期7d，正试期84d。

[0013] 表1

[0014]

[0015]

[0016] 注：a.预混料每千克饲料提供：VA30万IU，VD310万IU，VE1000IU，VK3150mg，VB135mg，VB2120mg，VB6100mg，VB120.20mg，烟酸670mg，泛酸500mg，叶酸10mg，生物素4mg，铁1400mg，锰1600mg，铜500mg，锌1200mg，碘100mg，硒15mg。

[0017] b.除代谢能外，其他指标均为测定值。

[0018] 1.3饲养管理

[0019] 在试验期间蛋鸡采用立式笼养，每笼装有3只鸡。每日分别饲喂两次(8:00、15:00)，自由采食饮水，光照采用人工光照，共16h，按常规程序进行免疫。

[0020] 1.4检测指标及方法

[0021] 1.4.1生产性能指标

[0022] 试验开始后，每天记录每重复的蛋数、蛋重、鸡死亡数、不合格蛋数，每周结料，统计耗料量。试验结束后计算每组产蛋率、平均日采食量和料蛋比。

[0023] 产蛋率(％)＝产蛋总数/(鸡只数×天数)×100％                     (1)平均日采食量(g)＝总耗料重/(鸡只数×天数)                      (2)料蛋比＝总耗料重/总蛋重                                        (3)[0024] 1.4.2蛋品质测定

[0025] 试验结束当天，每处理随机选取30枚鸡蛋，标号，存放于4℃冰箱保存，并于收集当天进行蛋品质的测定。

[0026] 1.4.3营养物质表观消化率测定

[0027] 在饲养试验期最后3d，以重复为单位，每24h收集一次排泄物(去除其中羽毛、饲料等杂物)，在‑4℃冰箱中冷藏保存，防止样品腐败变质。样品收集完毕后，将3d的粪样混合均匀。粪样经过65℃烘干制成风干样品，粉碎过40目筛，制成待测样品封于密封袋中，在‑4℃冰箱中冷藏保存，防止样品腐败变质。粗蛋白质含量用凯氏定氮法测定；磷采用钒钼酸铵法测定；钙采用高锰酸钾滴定法；酸不溶灰分(AIA)含量测定法。这些测定方法均是本领域常用的方法，在此不再详细描述。

[0028] 表观消化率(％)＝[1‑(a/b)×(c/d)]×100％

[0029] 式中：a为粪中该营养物质含量；b为饲料中该营养物质含量；c为饲料中酸不溶灰分含量；d为粪中酸不溶灰分含量。

[0030] 烘干后，记录重量，粉碎备用。分别称取饲料和鸡粪样品0.3g，加入10mL浓硫酸，充分混匀后用石墨消解仪进行消解，分别使用凯氏定氮仪测定全氮含量，用分光光度计测定全磷含量。

[0031] 养分表观消化率(％)＝((A‑B)/A)*100

[0032] 其中：A为食入养分含量；B为粪便中该养分含量。

[0033] 1.4.4血清生化指标测定

[0034] 试验结束最后一天禁食12h，每重复随机采1只鸡的血液取10mL，常温条件下倾斜促凝管静置30min，经3000rpm离心10min，采集血清，进行分装至离心管中，将其‑20℃保存，待测。

[0035] 血清总蛋白：按照血清总蛋白检测试剂盒说明(Sigma)进行操作，用可见分光光度法测定其吸光度并进行计算。

[0036] 血清尿素氮：按照血清尿素氮检测试剂盒说明(上海科艾博生物)进行操作，用可见分光光度法测定其吸光度并进行计算。

[0037] 1.4.5含氮物质排放

[0038] 粪样采集方法同养分表观消化率。

[0039] 吲哚(IAA)：同血清总蛋白的测定。

[0040] 粪臭素(SK)：同血清总蛋白的测定。

[0041] 粪氮(FN)排放：测定方法同养分表观消化率。

[0042] 粪氨气(FA)测定：试验最后1d，采集新鲜粪样(无杂物)，混合均匀。每重复取100g新鲜鸡粪，置于500mL磨口玻璃瓶中，置于室温环境下发酵3d。使用纳氏试剂比色法测定。

[0043] 称取新鲜粪便10g(精确至0.1g)放入100mL三角瓶中，加50mL2mol/L氯化钾溶液，用橡皮塞塞紧，振荡30min，立即过滤于50mL三角瓶中。吸取滤液5.0～10.0mL于25mL容量瓶中，加水稀释至20mL左右。加1mL 25％酒石酸钠，充分摇动后静置5min，使其与钙、镁离子络合。加入5滴1％阿拉伯胶，摇动后加入1mL纳氏试剂，边加边摇动，然后定容至刻度。5min后在分光光度计上用490nm波长比色。同时做空白试验。

[0044] 1.4.6经济效益

[0045] 根据试验期间饲料的消耗量和饲料市场均价计算饲料成本，不计入死亡鸡耗料量。根据试验期间蛋鸡总产蛋量和市场均价计算收入，不计入不合格蛋。试验期间，基础饲料单价为2.98元/kg，所用益生菌单价135元/kg，鸡蛋单价为11.58元/kg，未考虑人工、水电等其他成本。计算公式为：

[0046] 平均每只鸡利润＝只总产蛋重×鸡蛋单价‑只总耗料量×(饲料单价+益生菌单价)。

[0047] 1.5数据分析

[0048] 试验数据用SPSS22.0统计软件进行单因素方差分析，Duncan′s法进行多重比较，数据用“平均值±标准差”表示，P＜0.05为差异显著。

[0049] 2结果与分析

[0050] 2.1生产性能

[0051] 由表2可知，150mg/kg组产蛋率显著高于对照组(P＜0.05)，其他组与对照组差异不显著。100mg/kg组平均蛋重显著低于150mg/kg组(P＜0.05)，与对照组和200mg/kg组差异不显著。200mg/kg组的不合格蛋率显著低于对照组(P＜0.05)，和其他组差异不显著。由图1可以看出，各处理组蛋鸡初始产蛋率相当，随着周龄的增大，试验蛋鸡的产蛋率逐渐下降。在第4周后，试验组蛋鸡产蛋率降低的频率减缓，其中150mg/kg组产蛋率降低最慢，显著高于对照组。表2示出了复合益生菌制剂对蛋鸡生产性能的影响。

[0052] 表2

[0053]

[0054]

[0055] 注：数字肩标不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，下同。

[0056] 2.2蛋品质

[0057] 由表3可知，各组鸡蛋的蛋形指数、蛋壳强度、蛋白高度、哈氏单位、蛋黄比率均无显著差异(P＞0.05)。100mg/kg组的蛋黄颜色显著下降(P＜0.05)，其他组与对照组差异不显著。200mg/kg组的蛋壳厚度显著提高(P＜0.05)，其他组与对照组差异不显著，150mg/kg组与200mg/kg组差异不显著。表3示出了复合益生菌制剂对蛋品质的影响。

[0058] 表3

[0059]

[0060] 2.3表观养分代谢率

[0061] 表4示出了蛋鸡日粮中补充复合益生菌制剂后其养分消化率的变化情况。200mg/kg组的粗蛋白代谢率显著高于对照组和100mg/kg组(P＜0.05)，与150mg/kg组无显著差异。150和200mg/kg组的钙代谢率均显著高于对照组和100mg/kg组(P＜0.05)，两组间无显著差异。其他养分的代谢率无显著变化。

[0062] 表4

[0063]

[0064] 2.4粪中污染物质排放

[0065] 由表5可知，蛋鸡日粮中补充复合益生菌制剂可以显著影响蛋鸡粪中污染物质的排放量。150和200mg/kg组的粪中氨气排放量显著低于对照组(P＜0.05)，试验组间无显著差异。150和200mg/kg组的粪中3‑甲基吲哚含量显著低于对照组和100mg/kg组(P＜0.05)，两组间差异不显著。吲哚含量也有相似的趋势，150和200mg/kg组的粪中吲哚含量显著低于对照组和100mg/kg组(P＜0.05)，两组间差异不显著。

[0066] 表5

[0067]

[0068] 2.5经济效益

[0069] 由表6可知试验期间各处理组蛋鸡的经济效益。只考虑饲料成本的情况下，各试验组利润均高于对照组，其中150mg/kg复合益生菌组利润最高，比对照组提高了7.40％。

[0070] 表6

[0071]

[0072] 因此，蛋鸡日粮中补充复合益生菌制剂可能通过改善肠道环境，促进肠道发育以提高粗蛋白和钙的利用率，提高血清中白蛋白含量，降低尿素氮含量，从而提高生产性能和蛋壳厚度，降低不合格蛋率，并且可以减少粪中污染物质的排放。综合各项指标和经济效益，推荐补充量为150mg/kg。

[0073] 此外，在同样的补充量150mg/kg的情况下，比较了枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌和粪肠球菌中的三种或添加额外益生菌的结果。A组：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌(质量比为2:3:3)；B组：地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌和粪肠球菌(质量比为3:3:2)；C组：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和粪肠球菌(质量比为2:3:2)；D组：枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌和粪肠球菌(质量比为2:3:2)；E组：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌和粪肠球菌(质量比为1:4:2:3)；F组：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌和粪肠球菌(质量比为2:3:3:2)；G组：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌和粪肠球菌(质量比为3:2:2:3)；
H组：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌、粪肠球菌和植物乳杆菌(质量比为2:3:3:2:
2)。表7和表8示出了各组的对蛋鸡生产性能的影响。

[0074] 表7

[0075]

[0076] 表8

[0077]

[0078] 由表7和表8可知，通过采用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌和粪肠球菌(质量比为2:3:3:2)，相比于其他质量比(E组和G组)，或者相比于其中的三种(A‑D组)，或者相比于添加额外的益生菌(H组)，蛋鸡的生产性能均更佳。

[0079] 本领域技术人员应理解，以上实施例仅是示例性实施例，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以进行多种变化、替换以及改变。