一种dsRNA及其提取方法和应用 |
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| 申请号 | CN202410253065.0 | 申请日 | 2024-03-06 | 公开(公告)号 | CN117947020A | 公开(公告)日 | 2024-04-30 |
| 申请人 | 南京工业大学; | 发明人 | 柳东; 鲍雅楠; 张迪; 廖镜淋; 张斌赟; 李飞雪; 刘霖洁; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及基因工程领域，公开了一种从大肠杆菌中产生dsRNA以抑制灰霉菌的方法及dsRNA的提取方法和应用。本发明公开的RNAi的靶标基因是 灰葡萄孢 菌中的BcSAS1，因为它在灰霉病菌的毒 力 中发挥关键作用。具体来说，BcSAS1编码灰霉菌中菌丝发育和 毒力 所需的小GTP酶Rab家族的成员。本发明以灰霉菌BcSAS1基因为 基础 ，获得的dsRNA能有效降低灰霉菌的侵染能力从而防控 植物 和 水 果的灰霉病。本发明利用大肠杆菌实现了在短时间内大规模合成dsRNA，并显著提高了dsRNA的提取效率，克服 现有技术 难以大规模生产dsRNA的缺点。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种dsRNA的提取方法，其特征在于，包括如下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种dsRNA及其提取方法和应用技术领域背景技术[0002] 灰葡萄孢菌，又称灰霉菌(Botrytis cinerea)，是最重要的农业经济植物病原菌之一，可导致包括许多水果和叶菜在内的1000多种植物发生灰霉病，每年给全球造成的经济损失(超过100亿美元)巨大。由于其寄主范围广、遗传变异快、抗逆性强，导致灰霉病很难控制。迄今为止，针对采后疾病最有效的治疗方法是使用杀菌剂。然而，杀菌剂也有一些缺点，例如存在产生抗杀菌剂真菌的风险。此外，由于它们缺乏特异性，它们对环境中的有益微生物构成潜在威胁，包括对人类健康的影响。因此，需要开发生态友好的方法来控制真菌病原体和采后疾病。 [0003] 据报道，诱导RNA干扰(RNAi)的小干扰RNA(siRNA)参与了宿主免疫和病原体毒力。与此同时，B.cinerea可利用siRNA效应器和宿主RNAi机制来促进灰霉病在宿主物种中的发展。因此，使用双链RNA(dsRNA)靶向重要真菌基因的基于RNAi的生物杀真菌剂被认为是一种控制毁灭性灰霉病的新兴方法。开发具有成本效益和可扩展的RNAi生物杀真菌剂的生产方法，可能是该技术在农业实际应用中面临的主要挑战。总之，基于RNAi的生物杀真菌剂在防治破坏性灰霉病方面具有巨大潜力。 发明内容[0004] 发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种抑制灰葡萄孢菌的dsRNA及其提取方法和应用。 [0005] 为了解决上述技术问题，本发明公开了一种dsRNA及其提取方法和应用。本发明的第一目的是提供了一种dsRNA的提取方法。本发明的第二目的是提供了该提取方法提取得到的抑制灰葡萄孢菌的dsRNA。本发明的第三目的是提供了该dsRNA的应用。 [0006] 第一方面，本发明提供了一种dsRNA的提取方法，包括如下步骤： [0008] (2)将所述的粗提dsRNA经过酶消化得到混合物； [0009] (3)将所述的混合物经过苯酚氯仿异戊醇法处理，即得。 [0010] 其中，步骤(1)中，所述的固定液为无水乙醇和磷酸盐缓冲液的混合溶液，其中固定液中乙醇的浓度为60～80％v/v；优选地，固定液中乙醇的浓度为75％v/v，磷酸盐缓冲液(PBS)的pH为7.2，即利用pH为7.2的PBS配制浓度为75％v/v的乙醇溶液。 [0011] 所述的盐溶液为氯化钠水溶液，所述的氯化钠水溶液浓度为100～200mM；所述的固定液用量以所述的发酵液与固定液的体积比为1:0.5～1:2计；所述的盐溶液与所述的固定液的体积比为1:5～1:20。优选地，所述的氯化钠水溶液浓度为150mM；所述的固定液用量以所述的发酵液与固定液的体积比为1:1计；所述的盐溶液与所述的固定液的体积比为1:10。 [0012] 其中，步骤(1)中，所述的经固定液和盐溶液处理，将所述的含有dsRNA的发酵液离心得到沉淀，重悬于所述的固定液中，离心，再重悬于所述的盐溶液中，60～100℃孵育5～30min，离心收集上清得到粗提dsRNA。优选地，98℃孵育10min。 [0013] 其中，步骤(1)中，所述的含有dsRNA的发酵液按照如下方法制备：制备重组表达载体并导入大肠杆菌，得到重组大肠杆菌；将所述的重组大肠杆菌发酵培养即得。 [0014] 其中，所述的重组表达载体的制备方法为将靶标基因区段与L4440载体连接，即得； [0015] 所述的靶标基因区段为灰葡萄孢菌Botrytis cinerea来源的BcSAS1基因的靶标基因区段；所述的靶标基因区段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述的L4440载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述的L4440载体为含有双向T7启动子的RNAi表达载体。所述的大肠杆菌为大肠杆菌HT115(DE3)。优选地，以靶标基因灰葡萄孢菌的BcSAS1基因为模板，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，获得靶标基因区段。用核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示的引物进行PCR扩增，获得核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的带有酶切位点的dsRNA片段；同时，采用限制性内切酶KpnⅠ和BglⅡ对L4440载体进行双酶切，获得线性化L4440载体；利用同源重组酶将所述的带有酶切位点的dsRNA片段连接到线性化L4440载体上，即得重组表达载体。将含有dsRNA片段的重组表达载体导入到大肠杆菌HT115(DE3)，即得重组大肠杆菌。 [0016] 其中，所述的发酵培养按如下方法进行，将重组大肠杆菌接种于LB液体培养基中，30～40℃培养至OD600为0.2～1.0时添加IPTG诱导2～7h，所述的IPTG添加浓度为0.1～ 1.0mM。优选地，37℃培养至OD600为0.4时添加IPTG诱导4～5h，所述的IPTG添加浓度为 0.4mM。 [0017] 其中，步骤(2)中，所述的酶消化，将所述的粗提dsRNA与DNase1、RNase A和氯化钠水溶液混合，30～40℃孵育30～90min，得到混合物。优选地，37℃孵育1h。 [0018] 其中，所述的DNase1的浓度为0.5～2U/μL；所述的RNase A的浓度为50～500ng/μL；所述的氯化钠水溶液浓度为1～5M；所述的混合物中，粗提dsRNA的占比为70％～91％v/v、DNase1的占比为1％～3％v/v，RNase A的占比为1％～3％v/v和氯化钠水溶液的占比为3％～13％v/v，其中，所述的占比为某物质占混合物总体积的比例。优选地，所述的DNase1的浓度为1U/μL；所述的RNase A的浓度为100ng/μL；所述的氯化钠水溶液浓度为3M。 [0019] 优选地，所述的混合物中还包括10×DNase reaction buffer。所述的10×DNase reaction buffer的占比为3％～13％v/v。 [0020] 优选地，步骤(3)中，所述的苯酚氯仿异戊醇法，即将步骤(2)得到的混合物与苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1，v/v)溶液以体积比为1:1混合并涡旋震荡，离心取上相，与醋酸铵和异丙醇混合，离心弃上清，即得。 [0021] 本发明的第二方面在于提供了一种第一方面所述的提取方法提取得到的抑制灰葡萄孢菌的dsRNA。 [0022] 本发明的第三方面在于提供了一种第二方面所述的dsRNA在制备防治水果灰霉病制剂中的应用。优选地，所述的水果为苹果，所述的灰霉病由灰葡萄孢菌引起。 [0023] 其中，所述的制剂中，dsRNA的浓度为50～200ng/μL。优选地，浓度为100ng/μL。 [0024] 其中，所述的防治灰霉病制剂用于滴注在水果创口处，抑制灰霉病。优选地，滴注在苹果创口处。 [0025] 有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下突出的显著优点： [0026] (1)本发明的dsRNA靶向灰葡萄孢菌BcSAS1基因，BcSAS1编码灰霉菌中菌丝发育和毒力所需的小GTP酶Rab家族的成员，能够抑制病菌芽管萌发、附着胞的形成、菌丝生长，进而能够起到防治灰霉病的作用； [0027] (2)细菌诱导生产的dsRNA成本低，产量高，可达到5.67μg/mL；工艺简单，并且特异性强，抗菌效果明显，dsRNA‑BcSAS1降低了灰葡萄孢菌菌丝生长率，并且安全环保，使得RNAi技术更好地应用于灰霉病防治。 [0028] (3)本发明的dsRNA的提取纯化方法，dsRNA提取纯度高，提取损失率低，dsRNA产量相较于传统的基于乙醇和磷酸盐缓冲盐水溶液提取法(1.53μg/mL)和苯酚氯仿异戊醇提取法(3.45μg/mL)可达到5.67μg/mL，提高了1.64倍，且提取得到的dsRNA完整性高。附图说明 [0029] 下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。 [0030] 图1为本发明表达dsRNA‑BcSAS1的L4440‑BcSAS1的质粒图谱。 [0031] 图2为本发明提取得到的dsRNA‑BcSAS1电泳图。 [0032] 图3为本发明提取纯化出的固体dsRNA‑BcSAS1示意图。 [0033] 图4为实施例3dsRNA‑BcSAS1在PDA平板上抑制灰葡萄孢菌的生长结果图。 [0034] 图5为实施例3dsRNA‑BcSAS1在96孔板中抑制灰葡萄孢菌的生长结果图。 [0035] 图6为实施例3dsRNA‑BcSAS1在水果中抑制灰葡萄孢菌的生长结果图。 具体实施方式[0036] 下面结合附图以实施例的方式对本发明的技术方案作进一步说明。 [0037] 以下实施例中所采用的材料和仪器若无特殊说明均为市售，使用的水果为超市购买，野生型灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea、B05.10)作为实验菌株，该菌株由南京农业大学植物保护学院牛东东老师赠送，并在本实验室保藏，其详细信息见参考文献[Qiao L,Lan C,Capriotti L,et al.Spray‑induced gene silencing for disease control is dependent on the efficiency of pathogen RNA uptake[J].Plant Biotechnology Journal,2021,19(9):1756–1768.]。所应用的L4440载体和大肠杆菌E.coli‑HT115(DE3)菌株均购于上海植生优谷生物技术有限公司。 [0038] 下列实施例中，所述的PBS为磷酸盐缓冲液，其pH为7.2。 [0039] 实施例1高效产生BcSAS1的双链RNA的底盘L4440‑BcSAS1/HT115(DE3)的构建[0040] 本发明的dsRNA靶向灰葡萄孢菌BcSAS1基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)，BcSAS1基因是灰霉病毒力相关基因，编码灰霉菌中菌丝发育和毒力所需的小GTP酶Rab家族的成员，能够抑制病菌芽管萌发、附着胞的形成、菌丝生长，进而能够起到防治灰霉病的作用。通常情况下，dsRNA在普通大肠杆菌中生产很容易被细胞内RNaseⅢ降解，现在广泛应用的L4440/HT115(DE3)系统常常被用于dsRNA的大量生产。BcSAS1的靶标基因区段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；并通过引物(SEQ ID NO.3～4)在靶标基因区段添加5'(BglII)and 3'(KpnI)，得到带有酶切位点的dsRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。同时，采用限制性内切酶KpnⅠ和BglⅡ对L4440载体进行双酶切，获得线性化L4440载体。将带有酶切位点的dsRNA通过5'(BglII)and 3'(KpnI)(使用重组的方法)克隆至线性化载体L4440，得到重组表达载体L4440‑BcSAS1，其质粒图谱见图1。 [0041] 将重组质粒L4440‑BcSAS1转入感受态细胞E.coli‑DH5α中，涂布于LB固体平板上，在37℃培养箱中，倒置过夜培养12～14h；挑取阳性单菌落进行菌落PCR检测，检测引物为seq‑F‑BcSAS1(核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)、seq‑R‑BcSAS1(核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)，琼脂糖凝胶电泳分析，长度为483bp即为靶标基因区段成功克隆至载体L4440的重组质粒；将含有目的基因片段的单菌落测序分析，检测重组载体序列的准确性。 [0042] 将鉴定正确的单菌落接种于LB液体培养基中，37℃过夜摇培12h；利用质粒DNA提取试剂盒(购自于苏州优逸兰迪生物科技有限公司)提取L4440‑BcSAS1重组表达载体，琼脂糖凝胶电泳检测，长度为2895bp即为正确的L4440‑BcSAS1重组质粒；将重组表达载体转化到表达型菌株E.coli‑HT115(DE3)中，涂板，37℃培养箱中过夜培养12～14h；挑取阳性单菌落进行PCR检测，检测引物为seq‑F‑BcSAS1和seq‑R‑BcSAS1，琼脂糖凝胶电泳验证，正确的长度为483bp，将验证正确的菌株进行50％v/v甘油保存，即菌株L4440‑BcSAS1/HT115(DE3)。 [0043] 实施例2dsRNA的诱导表达和提取纯化 [0044] 将含有表达载体的L4440‑BcSAS1/HT115(DE3)菌液按体积比1：100接种于含抗性的LB液体培养基中，在摇床37℃，200rpm下培养；当OD600＝0.4时，加入终浓度为0.4mM的IPTG，在37℃下诱导表达4～5h得到发酵液。其中，含抗性的LB液体培养基成分为10g/L氯化钠，10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物、100μg/mL氨苄青霉素和12.5μg/mL四环素。 [0045] 接着提取发酵液中的dsRNA，所述提取纯化dsRNA的方法包括如下步骤： [0046] (1)将25mL发酵液以10000g离心5min；将细菌沉淀1重悬于25mL固定液中，所述的固定液为75％v/v乙醇的PBS溶液中，室温下孵育5min，并将细胞悬浮液以10000g离心5min；将细菌沉淀2重悬于2500μL的150mM NaCl中，98℃孵育10min后，将细胞培养物以13000g离心10min，收集上清液，以获得粗提dsRNA(如图2泳道1所示)，稀释10倍并使用NanoDrop 2000分光光度计进行定量； [0047] (2)向200μL粗提dsRNA添加4μL RNase Free DNase1(1U/μL，购自于南京诺唯赞生物科技股份有限公司)、26μL 10×DNase reaction buffer(购自于南京诺唯赞生物科技股份有限公司)和4μL RNase A(100ng/μL，购自于南京诺唯赞生物科技股份有限公司)、26μL的3M NaCl；37℃下孵育1h以破坏剩余的DNA和单链RNA，得到混合物； [0048] (3)利用苯酚氯仿异戊醇法处理所述的混合物，具体方法为：加入260μL苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1，v/v)通过剧烈涡旋分离dsRNA，然后在室温下以12000g离心15min；将含有dsRNA的上相转移到新管中，并通过涡旋与100μL NH4OAc醋酸铵(7.5M)和100μL异丙醇混合，在4℃下以12000g离心30min；弃去上清液并使用500μL乙醇(70％)仔细洗涤dsRNA沉淀两次；dsRNA在无菌通风橱中风干5‑10min得到透明色的固体状dsRNA(如图3所示)，然后重悬于100μL预热的无核酸酶水中得到精提的dsRNA；使用NanoDrop 2000分光光度计对纯化的dsRNA进行定量，并通过2％琼脂糖凝胶电泳和紫外光下可视化来评估dsRNA的完整性，如图2泳道2所示。由核苷酸序列SEQ ID NO.1可知，本实施例纯化得到的dsRNA的长度为250bp，对比图2中的两条泳道，本发明所述的纯化提取方法得到的dsRNA完整性更高。 [0049] 实验结果表明，通过所述的方法对发酵液进行dsRNA的提取和纯化，得到dsRNA的浓度可达到5.67μg/mL。 [0050] 实施例3验证灰葡萄孢菌BcSAS1基因的dsRNA抑制灰霉菌的效果 [0051] 1、dsRNA‑BcSAS1在PDA平板上抑制了灰葡萄孢菌的生长 [0052] 使用PDA平板在体外测试dsRNA‑BcSAS1对灰葡萄孢菌生长和毒力的影响。直径为4mm的菌塞取自灰葡萄孢菌菌落。每个平板中央放置一个4mm菌塞，然后在每个处理中，向菌塞顶部添加20μL(dsRNA‑BcSAS1(2μg)、dsRNA‑GFP或超纯水)。将平板于22℃孵育，每12h补充添加相应的dsRNA‑BcSAS1、dsRNA‑GFP或超纯水，通过测量接种后菌落直径来评估生长动态。发现对照组的灰葡萄孢菌菌落直径约有70.3mm，而实验组添加了dsRNA‑BcSAS1的灰葡萄孢菌菌落直径最小，约有40.8mm。对照组的孢子生长率达到1684％，而实验组dsRNA‑BcSAS1的菌丝生长率仅有920％，降低了764％，如图4所示，说明dsRNA‑BcSAS1对灰葡萄孢菌菌丝有一定的抑制效果。 [0053] 2、dsRNA‑BcSAS1在96孔板中抑制了灰葡萄孢菌的生长 [0054] 采用体外动力学吸光度测定法，测试了dsRNA‑BcSAS1对灰葡萄孢菌生长的抗真菌6 活性。所有检测均在96孔板中进行。每孔含10μL分生孢子(2.3*10 细胞数/mL)、90μL dsRNA‑BcSAS1(9μg)，包埋在总体积为200μL的PDB液体培养基中。对照孔为200μL的PDB(10μL分生孢子+90μLddH2O)和200μL的PDB(10μL分生孢子)。将孔板放入微孔板阅读器中，在25℃下培养72h，在600纳米波长下测量吸光度。如图5所示，发现在24h内，对照组和实验组的灰霉菌分生孢子生长率没有差别，48‑72h发现，实验组含有dsRNA‑BcSAS1的孢子生长率明显比对照组低，含有dsRNA‑BcSAS1的孢子生长率仅有40％，而对照组的孢子生长率达到 417％～794％，降低了377％～754％，说明dsRNA‑BcSAS1对灰葡萄孢菌孢子有一定的抑制效果。 [0055] 3、dsRNA‑BcSAS1在水果体内抑制了灰葡萄孢菌的生长 [0056] (1)水果消毒：挑选外观无破损的果实为实验材料。将这些水果浸入2％次氯酸钠溶液中2分钟，用超纯水冲洗，并在干净的工作台中风干(约2小时)。风干后，在接种病原体之前，用灭菌的牙签在果实中间处损伤果实。 [0057] (2)制备分生孢子悬浮液：制备7‑10天的灰葡萄孢菌PDA平板，用无菌刮刀轻轻刮取培养物表面的分生孢子，置于2ml超纯水中。 [0058] (3)接种：苹果果实分别用移液管接种10μL孢子悬浮液(2.3*106细胞数/mL，接种前用涡旋器混合悬浮液)于每个伤口部位。待其干燥后，分别将20μL dsRNA‑BcSAS1(2μg)、dsRNA‑GFP和超纯水滴注在伤口部位。将接种的果实放入塑料筐，于22℃培养。 [0059] (4)在接种了10μL孢子悬浮液的苹果样品发现，如图6所示，对照组的苹果创口的2 2 面积约33.96cm，而实验组用dsRNA‑BcSAS1处理的苹果创口的面积约8.83cm，明显比对照组的苹果创口小很多，说明dsRNA‑BcSAS1能在水果体内抑制灰葡萄孢菌的生长。 [0060] 对比例1dsRNA的提取纯化 [0061] 双链RNA的提取纯化方法还包括乙醇和磷酸盐缓冲液提取法和苯酚氯仿异戊醇提取法，详见参考文献[Ma Z‑Z,Zhou H,Wei Y‑L,等.Anovel plasmid–Escherichia coli system produces large batch dsRNAs for insect gene silencing[J].Pest Management Science,2020,76(7):2505–2512.]、[Figueiredo Prates L H,Merlau M,Rühl‑Teichner J,等.An Optimized/Scale Up‑Ready Protocol for Extraction of Bacterially Produced dsRNA at Good Yield and Low Costs[J].International Journal of Molecular Sciences,Multidisciplinary Digital Publishing Institute,2023,24(11):9266.]和[Ahn S‑J,Donahue K,Koh Y,等.Microbial‑Based Double‑Stranded RNA Production to Develop Cost‑Effective RNA Interference Application for Insect Pest Management[J].International Journal of Insect Science,SAGE Publications Ltd STM,2019,11:1179543319840323.]。具体方法如下： [0062] 1、乙醇和磷酸盐缓冲液提取法：将5mL细胞培养物在80℃下加热20分钟，然后在6000g下离心5分钟，得到细菌沉淀1。将细菌沉淀1重悬于用PBS配制的75％v/v乙醇中，并将细胞悬液在8000g下离心5分钟，得到细菌沉淀2。将细菌沉淀2重悬于50μL 150mM NaCl中，并将细胞培养物在12000g下离心2min以获得粗提dsRNA。将所得粗提dsRNA稀释五倍，并使用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)进行定量。 [0063] 向20μL粗提的dsRNA中添加1U RQ1 RNase‑Free DNase(Promega)和1μL RNase A溶液(2ng/μL)(Promega)。将混合物在37℃下孵育10分钟，以破坏剩余的DNA和单链RNA。然TM后使用MEGAclear 试剂盒(Thermo Fisher Scientific)进一步纯化dsRNA。用50μL洗脱溶液从过滤器中洗脱dsRNA，并使用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific)进行定量。 [0064] 2、苯酚氯仿异戊醇提取法：将25mL细菌培养物转移到50mL离心管中，并在4℃下以5000g离心10分钟；丢弃上清液后，通过移液而不是涡旋将其重悬于含有10mM EDTA的2mL NH4OAc(1M)中以避免起泡。将1mL细胞悬液与700μL苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1，v/v)混合，剧烈涡旋，在65℃下孵育30分钟，偶尔摇晃，然后在室温下以12000g离心15分钟。将含有核酸的上层相小心转移至新管中，加入700μL异丙醇混合，‑20℃保存过夜，然后4℃下12000g离心30分钟进行沉淀。通过加入1mL乙醇(70％)并在4℃下以7500g离心5分钟，仔细洗涤核酸沉淀物两次。除去残留的乙醇后，将沉淀物在无菌通风橱中风干5至10分钟(干燥后核酸沉淀物应变透明)。将沉淀重悬于180μL预热的无核酸酶水和20μL 10×DNase缓冲液中，并在室温下孵育30分钟。然后，在管中加入2μL Turbo DNase和2μL RNase(Thermo Scientific)后，将混合物在37℃下孵育1小时以破坏剩余的DNA和单链RNA，使用200μL苯酚/氯仿/异戊醇通过剧烈涡旋分离DsRNA，然后在室温下以12000g离心15分钟。将含有dsRNA的上相转移到新管中，并通过涡旋与100μL NH4OAc醋酸铵(7.5M)和100μL异丙醇混合。在4℃下以12000g离心30分钟；弃去上清液并使用250μL乙醇(70％)仔细洗涤dsRNA沉淀两次；DsRNA在无菌通风橱中风干5至10分钟，然后重悬于100μL预热的无核酸酶水中。使用NanoDrop 2000分光光度计对纯化的dsRNA进行定量，并通过1.2％琼脂糖凝胶电泳和紫外光下可视化来评估dsRNA的完整性。上述两种方法得到的dsRNA的产量如表1所示，由表1可以看出，本发明的提取方法相比传统提取方法，可使dsRNA产量提升至少1.64倍。 [0065] 表1不同提取方法得到的dsRNA产量表 [0067] 本发明提供了一种dsRNA及其提取方法和应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。 |
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