一种质粒DNA的分离纯化方法 |
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| 申请号 | CN202311828819.2 | 申请日 | 2023-12-28 | 公开(公告)号 | CN117947017A | 公开(公告)日 | 2024-04-30 |
| 申请人 | 楷拓生物科技(苏州)有限公司; 武汉楷拓生物科技有限公司; 上海楷拓生物科技有限公司; | 发明人 | 许美玲; 杨薇; 柯尊阳; 肖瑶; 李晨; 刘梦洁; 任科云; 叶炜; 梁华; 胡坤坤; 左静; 彭木; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及一种质粒DNA的分离纯化方法。该分离纯化方法包括以下步骤：(1)含目的质粒的菌体裂解液经过滤得到含目的质粒的菌体裂解上清液；(2)将含目的质粒的菌体裂解上清液经膜浓缩后换液得到粗提溶液；(3)将粗提溶液依次通过第一层析柱和第二层析柱进行层析分离，得到纯化后的质粒溶液，其中，第一层析柱所采用的填料为具有分子筛功能、离子交换功能和疏 水 功能的多功能填料，第二层析柱所采用的填料为亲和填料。本发明方法通过工艺整体设计，特别是采用特定的两步层析相结合，实现了高纯高品质质粒DNA的高效生产，成本更低更适用于工业化水平质粒分离纯化。本发明工艺适用于不同大小及类型的目的质粒DNA分离纯化，适用性广。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种质粒DNA的分离纯化方法，其特征在于：所述的分离纯化方法包括以下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种质粒DNA的分离纯化方法技术领域背景技术[0002] 质粒存在于许多细菌及酵母等生物中，是细胞染色体能够自主复制的很小的环状DNA分子。质粒是基因工程中最常用的载体，可以作为疫苗或者治疗性药物单独使用；也可以在病毒生产中作为病毒包装的原料；在mRNA疫苗或药物的生产中，可以作为体外转录反应的模板，用于mRNA的体外转录制备。随着基因治疗、细胞治疗和mRNA药物的快速发展，质粒DNA得到了更加广泛的应用。因此，高纯度、高质量的质粒DNA的工程大规模生产需求不断增加。 [0003] 质粒DNA提取及纯化的工艺流程包括：菌体发酵、菌体裂解、澄清过滤、浓缩、层析纯化。目前市面上制备质粒纯化工艺，使用的还是cytiva提供的传统的质粒纯化三步法方案。首先使用凝胶过滤(6FF)，在高硫酸铵浓度下(2.1M)，利用质粒DNA与宿主RNA分子量的差别进行分离。该层析的作用是除去宿主RNA以及其他杂质，收率为90％左右。优点是回收率高，对大小不同的质粒适用性强。但是缺点也非常明显，凝胶层析为非特异性过滤，样品的上样体积有限，上样体积小于柱体积的1/3，且层析过程中，流速需要控制在30‑60cm/h，否则会导致质粒DNA与RNA分离度变差。故层析时间较长；第二步层析使用的亲和填料(PlasmidSelect Xtra)。该步层析可有效分离超螺旋质粒和开环质粒。收率约70％‑80％；第三步层析使用的是强阴离子交换填料(Source 30Q)，作用是除去内毒素和其他痕量杂质。该层析收率约50‑70％，收率较低，且需要通过稀释3‑4倍体积来降低质粒样品电导，导致层析时长增加。三步法的整体收率约30‑50％左右。收率较低，且整个层析过程流速较慢(60‑120cm/h)，大大增加了时间成本。因此传统三步法质粒纯化过程普遍存在回收率低、耗时长的问题。 [0004] 因此，需要开发一种快速高效的质粒DNA分离纯化方法，在提升质粒产量和品质的同时，降低制备成本。 发明内容[0005] 本发明所解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种能够快速高效分离纯化质粒DNA且成本更低，更适合工业化大规模制备质粒DNA的工艺。 [0006] 为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案： [0007] 一种质粒DNA的分离纯化方法，所述的分离纯化方法包括以下步骤： [0008] (1)含目的质粒的菌体裂解液经过滤得到含目的质粒的菌体裂解上清液； [0009] (2)将所述含目的质粒的菌体裂解上清液经膜浓缩后换液得到粗提溶液； [0010] (3)将所述粗提溶液依次通过第一层析柱和第二层析柱进行层析分离，得到纯化后的质粒溶液， [0011] 其中，第一层析柱所采用的填料为具有分子筛功能、离子交换功能和疏水功能的多功能填料，所述第二层析柱所采用的填料为亲和填料。 [0012] 优选地，所述多功能填料的平均粒径为80～100μm，由激活的配基核心和惰性壳层组成，所述配基核心包括基质和配基，所述基质为高度交联结合琼脂糖，所述配基为辛胺。在纯化过程中，质粒DNA由于其分子量较大被排阻在填料微球外部，以流穿的模式分离，而RNA、宿主蛋白、宿主核酸及内毒素进入填料微球内部与辛胺基团结合，达到分离效果。因为该层析可同时除去RNA及内毒素，所以无需额外添加絮凝剂及离子交换层析，结合亲和层析的开环除去功能，组合为高效的两步法层析工艺。 [0013] 优选地，所述亲和填料的平均粒径为30～50μm，所述亲和填料的配基为嗜硫芳香族化合物。第二层析柱的主要作用是除去开环质粒，提高超螺旋质粒比例，其通过开环质粒与超螺旋质粒碱基暴露程度和表面电荷的强弱不同进行有效分离，并进一步降低内毒素含量。 [0014] 根据一些具体实施方式，所述多功能填料为Capto Core 700。 [0015] 根据一些具体实施方式，所述亲和填料为Cytiva PlasmidSelect Xtra。 [0016] 优选地，所述含目的质粒的菌体裂解液为含目的质粒的大肠杆菌菌体裂解液。 [0017] 优选地，所述目的质粒的大小为3Kb‑15Kb。 [0018] 优选地，所述步骤(1)中，所述过滤包括先后进行的一级过滤和二级过滤，所述一级过滤采用的是孔径为10μm～50μm的深层滤器，所述二级过滤采用的是孔径为0.22μm～0.45μm的囊氏滤器。 [0020] 优选地，所述平板膜包和/或中空纤维膜每平方米处理30～50L所述含目的质粒的大肠杆菌菌体裂解液。 [0021] 优选地，所述膜浓缩的浓缩倍数为20～50倍。 [0022] 优选地，所述步骤(2)中，所述换液采用的是膜包超滤的方式，所使用的置换液为：1～2.5M硫酸铵，5～15mM依地酸二钠，50～150mM氨丁三醇，余量水，所使用的置换液的pH值为7～8。 [0023] 优选地，所述步骤(3)中，通过所述第一层析柱进行的层析分离步骤依次为：柱前清洗、平衡、上样、复平衡、洗杂。 [0024] 其中，所述柱前清洗和洗杂分别包括水洗和NaOH溶液冲洗； [0025] 所述平衡和所述复平衡采用的第一平衡液为：1～2.5M硫酸铵，5～15mM依地酸二钠，50～150mM氨丁三醇，余量水，所述第一平衡液的pH值为7～8； [0026] 所述上样使用步骤2的粗提溶液作为上样样本； [0027] 在所述上样阶段，当UV260高于100mAu开始收样，直到在所述复平衡阶段，UV260低于100mAu停止收样。 [0028] 根据一些优选实施方式，通过所述第一层析柱进行的层析分离步骤具体如下： [0029] 用超纯水以300～500cm/h的流速冲洗所述第一层析柱，冲洗体积3～10CV； [0030] 用1M NaOH与30％异丙醇的混合溶液以150～300cm/h的流速冲洗所述第一层析柱，冲洗体积3～10CV； [0031] 用超纯水以300～500cm/h的流速冲洗所述第一层析柱，冲洗体积3～10CV； [0032] 用所述第一平衡液以线性流速300～500cm/h过所述第一层析柱，平衡体积3～10CV； [0033] 用所述粗提溶液以线性流速150～300cm/h过所述第一层析柱，在UV260高于100mAu开始收样； [0034] 用所述第一平衡液以线性流速300～500cm/h过所述第一层析柱，平衡体积3～10CV，UV260低于100mAu停止收样； [0035] 用1M NaOH与30％异丙醇的混合溶液以线性流速150～300cm/h冲洗所述第一层析柱，冲洗体积3～10CV； [0036] 用超纯水以300～500cm/h的流速冲洗所述第一层析柱，冲洗体积3～10CV。 [0037] 优选地，所述步骤(3)中，通过所述第二层析柱进行的层析分离步骤依次为柱前清洗、平衡、上样、复平衡、洗脱， [0038] 其中，所述柱前清洗和洗杂分别包括水洗和NaOH溶液冲洗； [0039] 所述平衡和所述复平衡采用的第二平衡液为：1.5～3.5M硫酸铵，5～15mM依地酸二钠，50～150mM氨丁三醇，余量水，所述第二平衡液的pH值为7～8； [0040] 所述上样使用通过所述第一层析柱进行的层析分离收集的样本作为上样样本； [0041] 所述洗脱采用的洗脱液为：1.5～3.5M硫酸铵，0.1～0.5M氯化钠，5～15mM依地酸二钠，50～150mM氨丁三醇，余量水，所述洗脱液的pH值为7～8； [0042] 在所述洗脱阶段，当UV260升至100mAu开始收样，直到UV260降至100mAu停止收样。 [0043] 根据一些优选实施方式，所述步骤(3)中，通过所述第二层析柱进行的层析分离步骤具体如下： [0044] 用超纯水以60～120cm/h的流速冲洗所述第二层析柱，冲洗体积3～10CV； [0045] 用1M NaOH与1M NaCl的混合溶液以线性流速60～120cm/h冲洗所述第二层析柱，冲洗体积3～10CV； [0046] 用超纯水以60～120cm/h的流速冲洗所述第二层析柱，冲洗体积3～10CV； [0047] 用所述第二平衡液以线性流速60～120cm/h过所述第二层析柱，平衡体积3～10CV； [0048] 用通过所述第一层析柱进行的层析分离收集的样本以线性流速60～120cm/h过层析柱，上样载量≤2.0mg/mL； [0049] 用所述第二平衡液以线性流速60～120cm/h过所述第二层析柱，平衡体积3～10CV； [0050] 用洗脱液以线性流速60～120cm/h过所述第二层析柱，在洗脱过程中，UV260升至100mAu开始收样，直到UV260降至100mAu停止收样。 [0051] 优选地，所述的分离纯化方法还包括对步骤(3)的所述质粒溶液进行换液的步骤，所使用的置换液为：0.5～1.5mM依地酸二钠，5～15mM氨丁三醇，余量水，所使用的置换液的pH值为7～8。 [0052] 本发明工艺传统三步法相比，收率提高10％～15％左右，杂质除去效果更好，且远低于标准，且操作简化，效率提高，成本大大降低。相比同时收率高，流速快。可以节省时间成本和填料成本，适用性广。相比BIA整体柱，质粒品质收率相当，但BIA整体柱成本较贵，且清洁难度大，使用寿命较短，因此本发明的制备成本明显更低，更适合大规模工业化应用。本发明工艺使用于不同大小及类型的目的质粒DNA分离纯化，适用性广。 [0053] 由于采用上述技术方案，本发明与现有技术相比具有如下优点： [0054] 本发明方法通过工艺整体设计，特别是采用特定的两步层析相结合，实现了高纯高品质质粒DNA的高效生产，成本更低更适用于工业化水平外泌体分离纯化。本发明工艺使用于不同大小及类型的目的质粒DNA分离纯化，适用性广。 具体实施方式[0055] 下面结合具体的实施案例对本发明的技术方案进一步描述，但本发明不只限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体要求做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。 [0056] 本发明中，如无特殊说明，使用的仪器、原料和试剂均可通过市售获得。 [0057] 以下实施例和对比例的含目的质粒的菌体裂解液均大肠杆菌发酵菌体经碱裂解制备得到的，其中涉及的重组质粒构建、质粒转染大肠杆菌以及大肠杆菌的发酵培养均采用本领域的常规方法。 [0058] 其中，实施例1、对比例1、对比例2和对比例3采用同一批含目的质粒的菌体裂解液进行质粒DNA分离纯化，目的质粒大小约为6Kb，记作“Plasmid A”。 [0059] 实施例2、对比例3、对比例4和对比例5采用同一批含目的质粒的菌体裂解液进行质粒DNA分离纯化，目的质粒大小约为5Kb，记作“Plasmid B”，Plasmid B后续用于制备mRNA线性化质粒，带有120个PolyA。 [0060] 实施例3和对比例6采用不同批次含目的质粒的菌体裂解液进行质粒DNA分离纯化，目的质粒包括用于包装腺病毒的大小约为10Kb的主质粒，记作“Plasmid D”，用于包装腺病毒的大小约为14Kb的辅助质粒，记作“Plasmid E”，用于包装腺病毒的大小约为6Kb的辅助质粒，记作“Plasmid F”。 [0061] 本发明中，HCD为宿主DNA的缩写；HCR为宿主RNA的缩写；HCP为宿主蛋白的缩写。 [0062] 实施例1 [0063] 本实施例提供一种质粒DNA(Plasmid A)的分离纯化方法，其步骤如下： [0064] 1.收集发酵完成的菌体，使用碱裂解的方法，获得质粒裂解液，向含有Plasmid A的菌体裂解液中加入0.5M氯化钙进行絮凝，静置50min后先过孔径为50μm的深层滤器(ANOW，型号：CTPP05KFS5)，再过孔径为0.22μm的囊氏滤器(ANOW，型号：CNPP022BHS2‑A1)，收集滤液，得到含Plasmid A的菌体裂解上清液。 [0065] 2.将步骤1的含Plasmid A的菌体裂解上清液经孔径大小为100KD的平板膜包(cobetter,UFELA0100010P)按照每平方米处理40L含Plasmid A的菌体裂解上清液的量浓缩30倍，然后进行等体积换液，共置换8次，获得pH值为7.5±0.1的粗提溶液，采用的置换缓冲液配方为：2.1M硫酸铵，10mM依地酸二钠，100mM氨丁三醇，pH：7.5±0.1，余量水，pH 7.5±0.1。(同第一次层析中使用的Buffer A)。 [0066] 3.第一步层析： [0067] 粗提溶液为第一步层析上样样本。 [0068] 第一步层析的使用的层析柱信息：柱高20cm；柱直径：16mm；对称性：1.0，HETP：5872。填料：Capto Core 700。 [0069] 操作方法见表1： [0070] 表1 [0071] [0072] [0073] 4.第二步层析： [0074] 第一步层析收集的溶液为第二步层析上样样本。 [0075] 第二步层析的使用的层析柱信息：柱高12.7cm；柱直径：26mm；对称性：1.25；HETP：6380。填料：Cytiva PlasmidSelect Xtra。 [0076] 操作方法见表2： [0077] 表2 [0078] [0079] [0080] 5.将第二步层析收集的洗脱液经通过膜包(cobetter，型号：UFELA0010001P)超滤2 的方式进行换液获得最终质粒成品，超滤膜包的孔径为100kD，膜面积为100cm ，用于置换的缓冲液配方为：1mM依地酸二钠，10mM氨丁三醇，余量水，pH：7.5±0.5。 [0081] 对比例1 [0082] 本对比例提供一种质粒DNA(Plasmid A)的分离纯化方法，其步骤如下： [0083] 1.收集发酵完成的菌体，使用碱裂解的方法，获得质粒裂解液，向含有Plasmid A的菌体裂解液中加入0.5M氯化钙进行絮凝，静置50min后先过孔径为50μm的深层滤器(ANOW，型号：CTPP05KFS5)，再过孔径为0.22μm的囊氏滤器(ANOW，型号：CNPP022BHS2‑A1)，收集滤液，得到含Plasmid A的菌体裂解上清液。 [0084] 2.将步骤1的含Plasmid A的菌体裂解上清液经孔径大小为100KD的平板膜包(cobetter，UFELA0100010P)按照每平方米处理40L含Plasmid A的菌体裂解上清液的量浓缩30倍，即可获得上样前样品。 [0085] 3.第一步层析： [0086] 步骤2的浓缩液为第一步层析上样样本。 [0087] 第一步层析的使用的层析柱信息：柱高30cm；柱直径：50mm；对称性：1.02，HETP：≥7872。填料：6FF。 [0088] 操作方法见表3： [0089] 表3 [0090] [0091] [0092] 4.第二步层析： [0093] 第一步层析收集的溶液为第二步层析上样样本。 [0094] 第二步层析的使用的层析柱信息：柱高12.7cm；柱直径：26mm；对称性：1.15；HETP：6800。填料：Cytiva PlasmidSelect Xtra。 [0095] 操作方法见表4： [0096] 表4 [0097] [0098] 3.第三步层析： [0099] 第二步层析收集的溶液，加入2倍体积超纯水，得到第三步层析上样样本。 [0100] 第三步层析的使用的层析柱信息：柱高15cm；柱直径：16mm；对称性：1.08；HETP：7568。填料：Source 30Q。 [0101] 操作方法见表5： [0102] 表5 [0103] [0104] 6.将第三步层析收集的洗脱液经通过膜包(cobetter，型号：UFELA0010001P)超滤2 的方式进行换液获得最终质粒成品，超滤膜包的孔径为100kD，膜面积为100cm 。用于置换的缓冲液配方为：1mM依地酸二钠，10mM氨丁三醇，余量水，pH：7.5±0.5。 [0105] 对比例2 [0106] 本对比例提供一种质粒DNA(Plasmid A)的分离纯化方法，其步骤如下： [0107] 1.收集发酵完成的含有Plasmid A菌体，使用碱裂解的方法，获得质粒裂解液，向裂解液中加入0.5M氯化钙进行絮凝，静置50min后，先过孔径为50μm的深层滤器(ANOW，型号：CTPP05KFS5)，再过孔径为0.22μm的囊氏滤器(ANOW，型号：CNPP022BHS2‑A1)，收集滤液，得到含Plasmid A的菌体裂解上清液。 [0108] 2.将步骤1的含Plasmid A的菌体裂解上清液，使用超纯水进行稀释至电导为38‑40ms/cm(加水体积为2.3倍体积)即可获得第一步层析上样溶液。 [0109] 3.第一步层析 [0110] 步骤2的粗提溶液为第一步层析上样样本。 [0111] BIA整体柱层析信息：CIMmultusTMDEAE‑1，1ML整体柱，货号为311.5114‑2。 [0112] 操作方法见表6： [0113] 表6 [0114] [0115] 4.第二步层析： [0116] 第一步层析收集的溶液，使用Adjust buffer(100mM Tris，10mM EDTA，4M(NH4)2SO4，余量水，pH 7.5)按照1：3体积混合均匀，为第二步层析上样样本。 [0117] 第二步层析的使用的层析柱信息：CIMmultusTM C4 HLD‑1，货号：311.8136‑2[0118] 操作方法见表7： [0119] 表7 [0120] [0121] [0122] 5.将收集的洗脱液经通过膜包(密理博，货号：PXB100C50)超滤的方式进行换液获2 得最终质粒成品，超滤膜包的孔径为100kD，膜面积为50cm，用于置换的缓冲液配方为：1mM依地酸二钠，10mM氨丁三醇，余量水，pH：7.5±0.5。 [0123] 对比例3 [0124] 本对比例提供一种质粒DNA(Plasmid A)的分离纯化方法，其基本同实施例1，区别在于步骤2的置换液和步骤3的平衡液不同、步骤4中的洗脱液不同。 [0125] 具体地，本对比例中步骤2的置换液和步骤3的平衡液分别换成：0.5M硫酸铵，10mM依地酸二钠，100mM氨丁三醇，余量水，pH：7.5±0.1。 [0126] 本对比例中步骤4的洗脱液换成：1.5M硫酸铵，0.5M氯化钠，10mM依地酸二钠，100mM氨丁三醇，余量水，pH：7.5±0.1。 [0127] 对比例4 [0128] 本对比例提供一种质粒DNA(Plasmid A)的分离纯化方法，其基本同实施例1，区别在于步骤2的置换液和步骤3的平衡液不同、步骤4中的洗脱液不同。 [0129] 具体地，本对比例中步骤2的置换液和步骤3的平衡液分别换成：3M硫酸铵，10mM依地酸二钠，100mM氨丁三醇，余量水，pH：7.5±0.1。 [0130] 本对比例中步骤4的洗脱液换成：1.5M硫酸铵，0.5M氯化钠，10mM依地酸二钠，100mM氨丁三醇，余量水，pH：7.5±0.1。 [0131] 按照表8所示GMP级质粒质量标准比较实施例1和对比例1～3的最终质粒成品品质，结果见表9。 [0132] 表8 [0133] [0134] 表9 [0135] [0136] [0137] 实施例2 [0138] 本实施例提供一种质粒DNA(Plasmid B)的分离纯化方法，其基本同实施例1，区别仅在于目的质粒大小和用途不同，本实施例中的目的质粒为大小约为5kb的后续用于制备mRNA线性化质粒的Plasmid B，其带有120个PolyA。 [0139] 对比例4 [0140] 本对比例提供一种质粒DNA(Plasmid B)的分离纯化方法，其基本同对比例1，区别仅在于目的质粒用途不同，本实施例中的目的质粒为大小约为5kb的后续用于制备mRNA线性化质粒的Plasmid B，其带有120个PolyA，本对比例中的目的质粒同实施例2。 [0141] 对比例5 [0142] 本对比例提供一种质粒DNA(Plasmid B)的分离纯化方法，其基本同对比例2，区别仅在于目的质粒不同，本对比例中的目的质粒同实施例2。 [0143] 按照上述表8所示GMP级质粒质量标准比较实施例2、对比例4和对比例5的最终质粒成品品质，结果见表10。 [0144] 表10 [0145] [0146] [0147] 实施例3 [0148] 本实施例提供一种质粒DNA的分离纯化方法，其基本同实施例1，区别仅在于目的质粒不同，本实施例中的目的质粒为用于包装腺病毒的三个质粒，包括大小约为10kb的主质粒Plasmid D，大小约为14kb的辅助质粒Plasmid E和大小约为6kb的Plasmid F。 [0149] 对比例6 [0150] 本对比例提供一种质粒DNA的分离纯化方法，其基本同对比例1，区别仅在于目的质粒大小和用途不同，本实施例中的目的质粒同实施例3。 [0151] 按照上述表8所示GMP级质粒质量标准比较实施例3和对比例6的最终质粒成品品质，结果见表11。 [0152] 表11 [0153] [0154] [0155] 实践发现，本发明工艺对于不同大小及类型的质粒适用性强，且操作简单，层析条件要求较为宽松，大幅降低了工艺开发时间，并在此基础上，实现了高回收率和高效除杂效果，其中收率可达60～83％左右，杂质去除率可达95％。 [0156] 与传统三步法层析相比，纯化上样量提高至凝胶层析上样量12倍，上样流速同比增长6倍，生产填料降低为原有填料量1/6，层析柱柱径缩小1倍，层析缓存液使用量降低3倍，缩短工艺时间1天，转化至生产后，可大大降低生产成本，并提高生产产率。 [0157] 与市面上使用的BIA整体柱的两步层析工艺相比，无需絮凝剂及常规的层析中的杂质去除条件摸索，收率更高，适用性强，具有良好的放大性，同时填料使用寿命更长，成本更低，实践了降本增效的理念。 [0158] 以上对本发明做了详尽的描述，目的在于让本领域内的技术人员了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，且本发明不限于上述的实施例，凡根据本发明的精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。 |
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