一种变性剂及其应用 |
|||||||
| 申请号 | CN202311413966.3 | 申请日 | 2023-10-27 | 公开(公告)号 | CN117947016A | 公开(公告)日 | 2024-04-30 |
| 申请人 | 江苏金斯瑞生物科技有限公司; | 发明人 | 吴志强; 刘仁杰; 戴兵; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供了一种变性剂及其应用，其中，所述变性剂用于在 电泳 前对核酸样品进行处理。所述变性剂为DMSO溶液和尿素的混合 试剂 。本发明所述的变性剂可用于核酸变性、核酸纯化过程，能够减少烘干时间6‑8小时，具有耗时少、周期短、效率高的优势，且利用本发明所述的变性剂进行核酸变性后，核酸电泳的结果具有条带清晰、 位置 正确、纯度高、回收率高的有益效果。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种在电泳前对核酸样品进行处理的变性剂，所述变性剂为DMSO溶液与尿素的混合试剂，其中，尿素浓度为50‑500g/L。 |
||||||
| 说明书全文 | 一种变性剂及其应用交叉引用 技术领域[0002] 本发明所述技术领域为电泳领域，具体地，涉及变性剂领域。 背景技术[0003] 聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术，带电颗粒在电场作用下，通过电荷和分子筛效应从而达到纯化目的。核酸上样前需加入变性剂，常见核酸变性剂为尿素、甲酰胺等。目前使用的变性剂为饱和尿素溶液。核酸氨水单管烘箱氨解后需进行排氨处理，一般操+作为放置烘箱长时间进行烘干，甚至长达十个小时，防止残留NH4影响电泳过程的质荷比造成上方拖带。排氨时间过长，导致核酸电泳纯化周期长，实验时间成本高。目前，尚未有解决办法可以缩短排氨时间，因此，急需一种新型的变性剂，缩短电泳纯化周期。 发明内容[0004] 本申请一方面提供了一种在电泳前对核酸样品进行处理的变性剂，所述变性剂为DMSO溶液与尿素的混合试剂，其中，尿素浓度为50‑500g/L。 [0005] 优选地，所述变性剂中尿素浓度为200‑400g/L。 [0006] 更优选地，所述变性剂中尿素浓度为300‑350g/L。 [0007] 所述核酸包括DNA、RNA；优选地，所述核酸为DNA。 [0008] 优选地，所述核酸长度不超过500个核苷酸。 [0009] 更优选地，所述核酸长度不超过100个核苷酸。 [0010] 本申请另一方面提供了一种变性剂的制备方法，所述制备方法包括在DMSO溶液中加入尿素干粉，其中，所述DMSO溶液与尿素干粉的添加比例为1L：50‑500g。 [0011] 优选地，所述DMSO溶液与尿素干粉的添加比例为1L：200‑400g。 [0012] 更优选地，所述DMSO溶液与尿素干粉的添加比例为1L：300‑350g。 [0013] 在一些实施方式中，所述制备方法在室温下进行。 [0014] 本申请又一方面提供了一种核酸变性方法，具体包括： [0015] 步骤1.对核酸样品进行氨解处理； [0016] 步骤2.对步骤1所得产物进行烘干处理； [0017] 步骤3.使用本申请所述电泳变性剂在合适条件下对步骤2所得核酸产物进行变性处理； [0018] 其中，所述步骤2中烘干处理条件为60℃～80℃，60min～120min。 [0019] 优选地，所述步骤2中烘干处理条件为60℃～80℃，60min～90min。 [0020] 所述步骤3中，变性处理的条件为60℃～95℃变性5min～20min。 [0021] 优选地，所述述步骤3中变性处理条件包括60℃～80℃变性10min～20min。 [0022] 本发明再一方面提供了所述变性剂或所述的变性方法在纯化核酸中的用途。 [0023] 有益效果： [0024] 本发明所述的变性剂可用于核酸变性、核酸纯化过程，减少烘干时间6‑8个小时，具有耗时少、周期短、效率高的优势，且利用本发明所述的变性剂进行核酸变性后，核酸电泳的结果具有条带清晰、位置正确、纯度高、回收率高的有益效果。附图说明 [0025] 图1A展示了本申请一些实施方式扩增所得核酸的电泳图，左侧为对照组方法，右侧为本申请所述方法； [0026] 图1B展示了本申请一些实施方式扩增所得核酸的电泳图，左侧为对照组方法，右侧为本申请所述方法； [0027] 图1C展示了本申请一些实施方式扩增所得核酸的电泳图，左侧为对照组方法，右侧为本申请所述方法； [0028] 图1D展示了本申请一些实施方式扩增所得核酸的电泳图，左侧为对照组方法，右侧为本申请所述方法； [0029] 图1E展示了本申请一些实施方式扩增所得核酸的电泳图，左侧为对照组方法，右侧为本申请所述方法； [0030] 图2A展示了本申请一些实施方式纯化核酸的HPLC检测结果； [0031] 图2B展示了本申请一些实施方式纯化核酸的HPLC检测结果； [0032] 图2C展示了本申请一些实施方式纯化核酸的HPLC检测结果； [0033] 图2D展示了本申请一些实施方式纯化核酸的HPLC检测结果； [0034] 图2E展示了本申请一些实施方式纯化核酸的HPLC检测结果。 具体实施方式[0035] 除非另有说明，本发明所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术员通常所理解的含义。 [0036] 在本说明书中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。 [0037] 在本说明书中，所述“核酸”可以是双链或单链核酸，例如双链DNA、单链DNA或RNA。其长度通常大于3个核苷酸，本发明所述的方法优选核酸长度小于500个核苷酸，例如100个核苷酸、200个核苷酸、300个核苷酸、400个核苷酸、500个核苷酸；更优选小于100个核苷酸，例如10个核苷酸、15个核苷酸、20个核苷酸、25个核苷酸、30个核苷酸、40个核苷酸、50个核苷酸、60个核苷酸、70个核苷酸、80个核苷酸、90个核苷酸、100个核苷酸。 [0038] 本说明书中所述“变性剂”、“核酸变性剂”、“电泳变性剂”为相同试剂，是指DMSO溶液与尿素的混合试剂。其中，所述尿素的浓度为50‑500g/L，例如50、100、150、200、250、300、350、400、450或500g/L。在一些具体的实施方式中，所述尿素的浓度为50‑200g/L，例如50、 75、100、125、150、175或200g/L。在一些优选的实施例中，所述尿素的浓度为200‑400g/L。在一些优选的实施例中，所述尿素的浓度为200‑350g/L，例如200、210、220、230、240、150、 160、170、280、290、300、310、320、330、340或350g/L。本申请的技术人员也尝试使用了DMSO溶液与各种浓度的甘油、蔗糖等常用比重剂，其作为核酸变性剂进行电泳后，效果不好，常出现条带位置不准确、条带边界不清晰或拖尾、纯化后核酸的回收率低等问题，而本发明所述的DMSO尿素混合溶液条带位置准确、条带清晰、回收率高。本申请的技术人员也尝试了非DMSO的溶液变性剂，如水与尿素的混合溶液，其电泳的条带、回收率与本发明所述方法结果接近，但是其电泳过程耗时长，需要长时间的排氨烘干后才能进行核酸变性，比本发明所述方法耗时多7‑8小时，本发明所述方法实验周期短，耗时少，效率高。在一些具体的实施例中，本说明书中所述的电泳为凝胶电泳，例如琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。 [0039] 本文所述的“尿素干粉”、“干尿素”均为尿素的干粉状态。 [0040] 在一些具体的实施例中，本发明所述的变性剂制备方法为在DMSO溶液中加入尿素干粉，其中，所述DMSO溶液与加入尿素干粉的添加比例为1L：50‑500g，比如1L：50、100、150、200、250、300、350、400、450或500g。在一些具体的实施方式中，所述DMSO溶液与加入尿素干粉的添加比例为1L：200‑400g。在一些具体的实施方式中，所述DMSO溶液与加入尿素干粉的添加比例为1L：50、75、100、125、150、175或200g。在一些具体的实施方式中，所述DMSO溶液与加入尿素干粉的添加比例为1L：200‑350g。在一些优选的实施例中，所述DMSO溶液与加入尿素干粉的添加比例为1L：200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、 330、340或350g。在一些具体的实施方式中，所述DMSO溶液与加入尿素干粉的添加比例为 1L：300‑350g。在一些具体的实施方式中，所述DMSO溶液与加入尿素干粉的添加比例为1L： 300‑320g。更优选地，所述DMSO溶液与加入尿素干粉的添加比例为1L：310、311、312、313、 314、315、316、317、318、319或320g。优选地，所述制备方法在室温下进行。 [0041] 在一些具体的实施例中，本发明所述的方法包括排氨烘干步骤，所述烘干处理条件包括60℃～80℃高温处理，例如60℃、62℃、64℃、66℃、68℃、70℃、72℃、74℃、76℃、78℃、80℃。所述高温处理的时间为60min～120min，例如60min、70min、80min、90min、100min、110min、120min。在一些具体的实施例中，所述烘干处理的条件为60℃～ 80℃，120min；在一些具体的实施例中，所述烘干处理的条件为60℃～80℃，110min；在一些具体的实施例中，所述烘干处理的条件为60℃～80℃，100min；在一些具体的实施例中，所述烘干处理的条件为60℃～80℃，60min～90min，如60min、70min、80min；在一些具体的实施例中，所述烘干处理的条件为80℃，90min、80℃，60min、60℃，90min或60℃，120min。 [0042] 在一些具体的实施例中，本发明所述核酸变性方法包括加入所述变性剂后60℃～95℃孵育5min～20min。在一些具体的实施例中，变性温度为60℃、62℃、64℃、66℃、68℃、 70℃、72℃、74℃、76℃、78℃、80℃、82℃、84℃、86℃、88℃、90℃、92℃、94℃、95℃。在一些具体的实施例中，所述变性方法为60℃～95℃，5min、60℃～95℃，10min、60℃～95℃， 15min、60℃～95℃，20min。在一些优选的实施例中，所述变性方法为60℃，15min。在一些优选的实施例中，所述变性方法为65℃，15min。在一些优选的实施例中，所述变性方法为90℃～95℃，5min～10min。在一些优选的实施例中，所述变性方法为80℃～90℃，10min～ 15min。在一些优选的实施例中，所述变性方法为60℃～80℃，10min～20min。 [0043] 下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步详细的说明。除非另有说明，下文描述的实施例的方法和材料均为可以通过市场购买获得的常规产品。本发明所属领域技术员将会理解，下文描述的方法和材料，仅是示例性的，而不应视为限定本发明的范围。实施例1聚丙烯酰胺凝胶电泳 变性剂的制备 [0044] 室温下，饱和尿素试剂配料表如下表1：表1饱和尿素试剂配料(对照组) 试剂 含量 灭菌水 50ml 干尿素 至饱和 [0045] 配置方法：向50ml灭菌水中加入干尿素，边加入边搅拌至饱和。 [0046] 本申请变性剂试剂配料如下表2：表2本申请变性剂配料(实验组) 试剂 含量 DMSO 50ml 干尿素 10‑25g [0047] 配置方法：向50ml DMSO中加入干尿素，边加入边搅拌，DMSO体积V(ml)与尿素干粉(g)的添加比例为1：0.2‑0.5。样品准备 [0048] 1)实验组与对照组采用固相亚磷酰胺法合成相同的核酸，核酸序列信息和分子量见下表3、表4。 [0049] 2)测试5个不同长度的样品，具体信息见表3。 [0050] 3)本实验使用固相亚磷酰胺法以200nmol载体规模合成实验样品。表3实验核酸信息 关键物料 [0051] 关键物料信息如下表4：表4关键物料信息表 关键设备 [0052] 关键设备信息如下表5：表5关键设备信息表 方法 [0053] 1.核酸氨解 [0055] 2.冷却、粗产品测值 [0056] 将氨解后测试样品冷却30min，完全冷却后测量粗产品值。 [0057] 3.赶氨 [0058] 将测试样品放入烘箱进行赶氨处理，赶氨条件如下表6：表6赶氨条件表 样品 赶氨条件 对照组 60℃～80℃8～9h(完全烘干) 实验组 60℃～80℃120min～60min [0059] 4.变性 [0060] 变性条件如下表7：表7变性条件表 [0061] 5.上样跑胶 [0062] 实验组与对照组样品分开上样，且相同核酸上样同一块电泳板内。电泳槽内加入适量TBE电泳缓冲液，设定电压600V，电流设为45mAn/电泳板，跑胶。跑胶时长如下表8：表8跑胶时长表 碱基(Bp) 电泳时长(min) 20 80 30 110 40 140 58 200 80 260 [0063] 实验结果如图1A‑图1E所示，可以看出本发明所用方法得到的电泳结果与常规方法相比，条带单一、肉眼观察条带清晰，位置正确，可见，本发明所述的变性剂在节约烘干时间的基础上依然能达到条带单一、位置正确的效果。实施例2检测核酸片段大小和纯度 [0064] 按照实施例1所述的方法对5种核酸进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到含有目的条带的凝胶。割胶 [0065] 1)准备泡胶管架，泡胶管架上带有“左”标识的一面朝左放置，朝自己一面即为正面，将每一批胶的轮次信息标签贴在泡胶管架正面。 [0066] 2)撬开上层玻璃，用保鲜膜覆盖在凝胶上，再将凝胶倒置在保鲜膜上，取下下层玻璃。以Marker泳道靠近左手为参照，从左往右依次撕下电泳玻璃板上的电泳标签，粘贴在凝胶对应泳道位置。 [0067] 3)在紫外灯下放一块干净的TLC板(板上无附着凝胶，无破损)，将倒置在保鲜膜上的凝胶按照上样口在左侧，Marker泳道在上的方位顺序放在TLC板上。 [0068] 4)打开紫外灯观察核酸条带，注意Marker与样品间的长度差异，确定目的条带。 [0069] 5)确定目的条带后进行割胶，第一刀割靠近Marker泳道的一侧，第二刀割远离Marker泳道的一侧，第三刀割靠近上样口的一侧，第四刀割远离上样口的一侧。用镊子夹入已经准备好的注射器针筒中，对应的电泳标签撕下贴在对应注射器针筒管壁上，再将此注射器针筒放在对应位置的泡胶管架上。 [0070] 6)每割完一条核酸后要用乙醇清洗割胶刀片和取胶镊子。泡胶、泡胶转移 [0071] 1)分别取已灭菌碎胶工具(一个碎胶工具对应一个注射器)，插进泡胶管架上的注射器针筒内，将胶碎成小块状，再使用移液器往注射器针筒内加入1000ul灭菌水泡胶液。 [0072] 2)将注射器针筒塞上干净备用的注射器活塞，放入烘箱泡胶。 [0073] 泡胶时间按照下表9进行操作。表9泡胶条件表 碱基范围 泡胶温度 泡胶时间 ≤30bp 60℃ 1.5h 31‑59bp 60℃ 2h ≥60bp 60℃ 2.5h [0074] 3)注射器针筒泡胶转移 [0075] 推动注射器活塞将液体完全打入离心管中,同时撕下电泳标签,将其贴在对应离心管壁上,再一一对应放置。测量检测 [0076] 取上一步的泡胶液分别进行QC‑MS检测扩增核酸主峰占比情况，判定是否存在裂解不合格现象、HPLC检测，判断纯度。 [0077] 实验结果如表10和图2A‑图2E所示，表明本申请所述方法扩增得到的核酸主峰单一，占比接近100％，且纯度相比常规方法更高，平均纯度达到90％以上。可见，本申请所述的方法在减少烘干时间后，依然可以得到纯度高的核酸，且核酸的完整度高，主峰占比高。表10核酸主峰占比及纯度 实施例3检测核酸回收率 [0078] 按照实施例1和实施例2所述的方法得到泡胶液。测量检测 [0079] 对泡胶样品使用酶标仪测定其OD260值，OD260代表核酸在波长为260nm处的吸光度，以此来对核酸进行定量，计算纯化回收率。 [0080] 纯化回收率计算方法：(A260(纯)*V1)/(A260(粗)*V2)*100％； [0081] 其中，A260(纯)表示纯化后的测量值，A260(粗)表示粗产品测量值，V1表示纯化后总体积，V2表示粗产品总体积。 [0082] 实验结果如表11所示，表明应用本申请所述的变性剂和方法进行电泳，在节约烘干时间的同时，还能进一步提高纯化回收率。表11核酸回收率 [0083] 本发明的实施方式并不限于上述实施例所述，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域普通技术人员可以在形式和细节上对本发明做出各种改变和改进，而这些均被认为落入了本发明的保护范围。 |
||||||
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈